基于HS-SPME-GC-MS 技術分析不同種類黑茶香氣成分

鄧見田燁，晏美紅，尚鉑昊，李亦龍，肖 田，朱洺志,3,4, ，王坤波,3,4,

（1.湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南長沙 410128；2.湖南農業大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南長沙 410128；3.湖南農業大學植物功能成分利用省部共建協同創新中心，湖南長沙 410128；4.湖南農業大學農業農村部園藝作物基因資源評價利用重點實驗室，湖南長沙 410128）

黑茶是我國特有的后發酵茶，是中國最具特色的茶類之一[1-2]。近年來由于其降脂減肥、調節脂質代謝等多種健康益處而備受人們關注。隨著黑茶中具有保健養生作用的功能成分被不斷挖掘，黑茶已不僅限于邊銷或僑銷，正在向外銷市場擴張，出口東南亞、日本等地區[3-4]。黑茶產區廣，可因特殊制作工藝與不同產地分成許多不同種類：茯磚茶、天尖、六堡茶、黑磚、藏茶等[5]。

由于原料、產地以及制作工藝等諸多因素影響，不同黑茶種類形成了各種獨特的香氣品質特征。天尖和六堡茶是簍裝散茶的一類。天尖由特級、一級黑毛茶加工制得，通常帶有松煙香[6]。六堡茶常以檳榔香和松煙香聞名[7-8]。茯磚茶和黑磚屬于磚形緊壓黑茶。茯磚茶磚塊內布滿冠突散囊菌，俗稱“金花”，“發花”這一獨特工序賦予茯磚茶獨特的菌花香[9-10]。黑磚香氣純正帶有松煙香[11]。藏茶主要產于四川省，由于暢銷青藏高原地區而得名[12-13]。藏茶主要香氣類型是陳香[14-15]。

目前針對茶葉香氣成分提取的方法主要包括液-液萃取、減壓蒸餾萃取、攪拌棒吸附萃取、水蒸氣蒸餾法、同時蒸餾萃取法、超臨界流體萃取法和固相微萃取法（Solid phase micro-extraction，SPME）等[16-17]。其中，固相微萃取中最常用的頂空固相微萃取（Headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）法操作簡單，設備要求低，常用于提取揮發性、半揮發性有機物。該方法無需溶劑、集采樣、萃取與濃縮為一體；同時，此方法對于熱敏性成分提取較充分，且無有機試劑的干擾，香氣還原度較好。因此，頂空固相微萃取（HS-SPME）法是提取茶葉香氣成分較為常用的技術。

香氣是決定茶葉品質最重要的關鍵因素之一，然而，目前關于黑茶香氣的研究較多關注于單一產地或同種類間的比較，關于不同產地多種類黑茶間香氣成分差異的相關報道較少。本文采用頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用（HS-SPME-GC-MS）技術對5 個不同種類黑茶樣品進行香氣成分檢測分析，明確各不同種類黑茶香氣成分組成差異，可為后期黑茶香氣機理研究以及品質創新等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑茶 收于各地區，均使用錫箔袋密封保存于實驗室4 ℃冰箱中；藏茶 產于四川省雅安市，2016 年；茯磚茶 產于湖南省益陽市，2016 年；天尖 產于湖南省益陽市，2016 年；黑磚 產于浙江省金華市，2016 年；六堡茶 產于廣西省梧州市，2016年；56 種香氣標準品 購于東京化成工業株式會社、美國Sigma、北京百靈威科技有限公司等。

7890B-7000C 氣相色譜-串聯質譜儀 美國Agilent 公司；75 μm CAR/PDMS SPME 固相微萃取手動進樣手柄和萃取頭 美國Supelco 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 感官審評 感官審評參照Li 等[18]的研究方法，審評人員由8 名專業人員組成。

1.2.2 固相微萃取法 精確稱取1 g 磨碎茶樣于15 mL 萃取小瓶中，加入轉子，再加5 mL 100 ℃蒸餾水，在80 ℃恒溫水浴條件下以轉速600 r/min 萃取吸附60 min，GC-MS 解析10 min。

1.2.3 GC-MS 分析條件 GC 條件：色譜柱DB-WAX（30 m×250 μm×0.25 μm），進樣口溫度240 ℃，載氣為氦氣（純度＞99.999%），柱流量為1 mL/min，分流比10∶1；升溫程序為：35 ℃保持5 min，以2 ℃/min的速度升到100 ℃，保持1 min；再以5 ℃/min 的速度升溫至240 ℃，保持2 min。MS 條件：離子源溫度230 ℃，接口溫度240 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，電子倍增器電壓：1161 V，全掃描模式（Scan）下的質量掃描范圍35～550 u。

1.2.4 定性定量方法 通過計算機檢索與NIST05s.LIB 質譜庫提供的標準質譜圖進行對照，以匹配度大于80%為標準，根據保留指數計算公式，結合保留時間求出各被測組分的保留指數（Retention index，RI），保留指數計算公式[19]如公式（1）所示。通過文獻以及數據庫的保留指數進行鑒定；將待測物質的特征離子以及RI 與標準品比較進行定性。結合各色譜峰的峰面積進行香氣相對含量分析，并根據檢測出的各香氣成分峰面積與內標（己酸乙酯）峰面積的比值進行相對定量。具體方法參照李永迪的研究方法[20]。

式中：RI 為待測物質保留指數；n 表示待測物質的碳數；RT（x）為待測物質的保留時間；RT（n）為待測物質流出前正構烷烴的保留時間；RT（n+1）為待測物質流出后正構烷烴的保留時間。

1.2.5 香氣活性值（Odor activity value，OAV）計算OAV 為某香氣成分的質量濃度與其氣味閾值的比值[21-22]，OAV 計算公式如公式（2）所示。

式中：C 為香氣成分的質量濃度，μg/L；OT 為該香氣成分的氣味閾值，μg/L。

1.3 數據處理

每組實驗數據重復測定3 次。采用Excel 2019軟件進行各樣品香氣成分的數據分析；采用Origin 2021 軟件制作柱狀圖和雷達圖；采用TBtools 軟件制作熱圖；采用SIMCA-P 14.1 軟件進行主成分分析（PCA）、層序聚類分析（HCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和計算預測變量重要性投影（VIP）；采用SPSS 27 數據處理軟件（IBM）進行單因素方差分析（ANOVA）中的最小顯著差異法檢驗，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同種類黑茶的感官審評結果分析

不同種類黑茶的感官審評結果如表1 所示，感官審評綜合得分為藏茶（91.35）＞茯磚茶（90.15）＞黑磚（89.05）＞六堡茶（88.85）＞天尖（86.33）。五種黑茶在湯色、滋味以及葉底等方面的差異較小；藏茶、茯磚茶、黑磚的外形相對較好。根據感官審評結果（表1）中香氣部分的審評結果，將不同種類黑茶的香氣特征制成雷達圖（圖1），雷達圖的數值表示黑茶樣品的某一香氣特征分值，分值越高表示黑茶樣品的某一香氣特征越明顯。結果顯示，不同種類黑茶的香氣特征差異較大，藏茶具有持久的陳香，茯磚茶有明顯的菌花香，稍帶陳香，黑磚香氣純正，六堡茶具有明顯持久的檳榔香與陳香，天尖具有持久的松煙香，所有茶樣均稍帶木香。

圖1 黑茶感官審評雷達圖Fig.1 Radar map of sensory evaluation of dark tea

表1 黑茶樣品的感官審評結果Table 1 Results of sensory evaluation of dark tea products

2.2 不同種類黑茶的香氣成分分析

為進一步分析不同種類黑茶產生不同香型的原因，利用HS-SPME-GC-MS 技術這5 個黑茶樣品的香氣成分及含量進行分析鑒定。由表2 可知，在五種黑茶中共檢測到56 個香氣成分。根據化合物主要官能團的不同將檢測到的香氣成分分為7 大類，其中，酮類化合物和醛類化合物最多，均為15 種，醇類化合物11 種，酯類化合物5 種，雜氧化合物5 種，碳氫化合物3 種及酚類化合物2 種。

表2 不同種類黑茶的香氣成分定性分析與香氣含量Table 2 Qualitative analysis and aroma content of different types of dark tea

續表2

結果顯示，不同種類黑茶在香氣成分的構成與含量上都有差異。五種黑茶樣品的香氣成分總含量排序為茯磚茶（6355.30 μg/L）＞藏茶（5858.73 μg/L）＞藏黑磚（5789.71 μg/L）＞藏天尖（4801.37 μg/L）＞藏六堡茶（3740.14 μg/L）。各樣品的香氣成分含量較多的種類為醛類化合物、酮類化合物、醇類化合物和酯類化合物。酮類化合物和醇類化合物多體現為花果香，醛類化合物多體現為青草香和花果香，這些化合物通常給予茶葉美好的香氣[23]。茯磚茶中的醛類化合物、酮類化合物和醇類化合物的含量均為最高，茯磚茶的菌花香應與這三類化合物密切相關。在藏茶和茯磚茶中含量較高的1,2,3-三甲氧基苯和1,2,4-三甲氧基苯等雜氧化合物則會賦予茶葉陳香的香氣品質。有些香氣成分是某些種類黑茶特有的，如：檸檬醛I 在藏茶、茯磚茶和黑磚中檢測出；3,4,5-三甲氧基甲苯和順-茉莉酮在茯磚茶、六堡茶、藏茶和天尖中檢測出；棕櫚酸甲酯只在黑磚、六堡茶和天尖中檢測出，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚只在茯磚茶中檢測出。總之，由于不同種類黑茶的原料、加工工藝以及制作環境等因素的影響，不同種類黑茶的香氣成分存在著較大差異。

不同香氣成分在不同種類的黑茶間相對含量差異顯著。由圖2a 可知，五種黑茶的香氣成分構成、化合物總數量和每類化合物間化合物數量差異不大，但由圖2b 可知，不同種類黑茶間的香氣成分相對含量差異顯著，所有茶樣中香氣成分質量濃度較高的酯類化合物、醇類化合物、醛類化合物以及酮類化合物，總相對含量達到90%以上。藏茶、黑磚和天尖中香氣成分質量濃度最高的是酯類化合物，分別含有2325.55、2628.10、2132.88 μg/L；占各樣品香氣成分總含量39.69%、45.39%、44.42%。茯磚茶和六堡茶中醇類化合物成分質量濃度最高，分別含有1939.81、1492.62 μg/L，其相對含量為30.52%和39.91%。藏茶、茯磚茶、黑磚、六堡茶、天尖中質量濃度含量最高的香氣成分均為二氫獼猴桃內酯，質量濃度分別為2298.04、1290.95、2583.62、1299.50、2102.33 μg/L；占各樣品香氣成分總含量的39.22%、20.31%、44.62%、34.74%、43.79%。這些香氣成分相互影響、共同作用形成黑茶特殊的香氣品質。

圖2 不同種類黑茶香氣成分含量比較Fig.2 Comparison of aroma components in different types of dark tea

2.3 多組分化學計量學

OAV 是結合香氣成分的含量和氣味閾值，對各香氣成分在樣品的香氣貢獻進行綜合評價的方法[24-26]。通常認為OAV＞1 的香氣成分對茶葉香氣形成有貢獻，OAV＞10，則對茶葉香氣形成有顯著影響[27-28]。參照文獻[20,23,25,29]中香氣成分在水中的閾值計算出各香氣成分的OAV，并記錄文獻所描述香氣成分的香氣特征。結果表明（表3），有31 種香氣成分OAV＞1，即有31 種香氣成分對黑茶的香氣形成有貢獻。這些香氣成分類型主要為醛類化合物和醇類化合物。

表3 不同種類黑茶香氣成分OAV 和香氣描述Table 3 OAV and aroma attributes of aroma components in different types of dark tea

續表3

藏茶中，有27 種香氣成分OAV＞1，其中OAV＞10 的香氣成分有10 種，1,2,3-三甲氧基苯對藏茶香氣具有突出貢獻。茯磚茶中香氣成分OAV＞1 的有30 種，其中OAV＞10 的有12 種，反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、檸檬醛I、檸檬醛II 和正己醛等醛類化合物以及水楊酸甲酯對茯磚茶的菌花香具有突出貢獻，而1,2,3-三甲氧基苯則對茯磚茶的陳香具有突出貢獻。黑磚中香氣成分OAV＞1 的有25種，其中OAV＞10 的香氣成分有11 種，苯乙醇、橙花叔醇II 和氧化芳樟醇I 等香氣成分的綜合作用形成了黑磚純正的香氣。在六堡茶中有22 種香氣成分OAV＞1，其中OAV＞10 的香氣成分有9 種，（+）-雪松醇對六堡茶的檳榔香具有突出貢獻。天尖中，香氣成分OAV＞1 有25 種，其中OAV＞10 的香氣成分有10 種，反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛和正己醛等醛類化合物和植醇等醇類化合物對天尖的松煙香有突出貢獻。這與黃林杰[8]、蔣容港[26]和張婷等[30]的研究結果相一致。綜上所述，不同種類黑茶的特征香氣形成的呈香香氣成分均有所不同，同一香氣成分對不同種類黑茶的香氣形成也有不同貢獻。

為研究不同種類黑茶中顯著差異的香氣成分，將五組茶樣的56 種香氣組分進行PCA，HCA 和PLS-DA 分析，并且結合OAV，研究不同種類黑茶中香氣成分組成的差異及呈香香氣成分的差異。PCA和HCA 分析表明（圖3a、圖3b），五種黑茶可明顯分為5 組，表明5 組樣品間香氣成分組成具有顯著差異。基于PCA 和HCA 結果，構建了PLS-DA 模型（圖3c），擬合參數R2X=0.991、Q2=0.998，置換檢驗模型（圖3d）R2=0.0507、Q2=-0.672，Q2回歸線與縱軸的相交點小于零，表明該判別模型有較好的解釋能力，且不存在過擬合現象，模型驗證有效。

根據PLS-DA 模型，利用VIP＞1 且P＜0.05，共篩選出12 種差異香氣成分，分別為反-2-己烯醛、反-2-壬烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、α-松油醇、橙花叔醇II、芳樟醇、順式-3-己烯-1-醇、3,4-二甲氧基甲苯、2-正戊基呋喃、順-茉莉酮以及4-仲丁基苯酚，將12 種差異香氣成分含量制成熱圖（圖4）。其中，有7 種差異香氣成分OAV＞1，分別是：反-2-己烯醛、反-2-壬烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、橙花叔醇II、芳樟醇以及2-正戊基呋喃。

圖4 差異香氣成分熱圖Fig.4 Heatmap of the differential aroma components

3 結論

本研究采用感官審評對茯磚茶、黑磚、藏茶、六堡茶和天尖這五個不同種類黑茶進行綜合評價。結果顯示：藏茶具有持久的陳香，茯磚茶有明顯的菌花香，帶陳香，黑磚香氣純正，六堡茶具有明顯持久的檳榔香與陳香，天尖具有持久的松煙香。

采用HS-SPME-GC-MS 技術對這五個不同種類黑茶的香氣成分進行定性定量檢測分析。結果表明，不同種類黑茶的香氣成分在種類、數量以及相對含量均存在差異。五種黑茶中共檢測出56 個香氣成分。對數據進行OAV 分析并結合感官審評結果發現，具有陳香香氣特征的1,2,3-三甲氧基苯對藏茶的陳香具有突出貢獻，可能是藏茶的陳香最為突出持久的主要原因。反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、檸檬醛I、檸檬醛II、正己醛和水楊酸甲酯對茯磚茶的菌花香具有突出貢獻，而1,2,3-三甲氧基苯對茯磚茶的陳香具有突出貢獻。反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、正己醛和植醇等對天尖的松煙香有突出貢獻。苯乙醇、橙花叔醇II 和氧化芳樟醇I 等香氣成分綜合作用形成了黑磚純正的香氣。這些香氣成分相互作用、相互影響，共同形成了黑茶的特殊香氣品質。基于VIP＞1 且P＜0.05，篩選出12 種含量差異達到顯著水平的香氣成分，結合OAV 值，在其中篩選出7 種差異性黑茶呈香香氣成分，分別是：反-2-己烯醛、反-2-壬烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、橙花叔醇II、芳樟醇以及2-正戊基呋喃。

以上結果揭示了不同種類黑茶的風味特征及主要香氣成分，為深入認識不同種類黑茶香氣特征提供了數據參考。未來還可采用GC-O-MS、香氣重組、智能感官等方法對各香氣成分的協同作用進行深入研究。