基于陽性淋巴結(jié)/原發(fā)灶體積比分型的上行型和下行型鼻咽癌的外周血淋巴細胞亞群比較及預后分析*

何姍珊，陳思皓，劉刈，王丹，邵世龍，楊牧，張石川

610041 成都，四川省腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學附屬腫瘤醫(yī)院 放射腫瘤學四川省重點實驗室（何姍珊、劉刈、王丹、邵世龍、張石川），腫瘤基礎(chǔ)研究中心（楊牧）；646000 四川 瀘州，西南醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院（何姍珊、陳思皓、劉刈、王丹、張石川）；610041 成都，電子科技大學 醫(yī)學院（邵世龍）

盡管進入調(diào)強放療（intensity-modulated radiotherapy， IMRT）時代后，鼻咽癌的治療效果有了很大提高，但仍有約15%的患者在接受標準治療后發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，10%出現(xiàn)局部區(qū)域復發(fā)［1-2］。如何早期識別這些患者并優(yōu)化其治療策略，是進一步提高鼻咽癌總體生存率的主要挑戰(zhàn)。

在鼻咽癌高發(fā)區(qū)，人們很早就注意到鼻咽癌具有不同的進展模式：部分鼻咽癌原發(fā)灶較局限，但伴隨廣泛的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（下行型）；而另有部分鼻咽癌表現(xiàn)為原發(fā)灶廣泛侵襲，但沒有或較少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（上行型）［3-4］（典型病例如圖1 所示）。有證據(jù)表明，兩者的治療失敗模式也截然不同:上行型多見局部復發(fā)，而下行型則較易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移［5-6］。因此，對這兩種鼻咽癌進行比較研究，可能為研究鼻咽癌轉(zhuǎn)移和復發(fā)機制提供線索。

圖1 上行型和下行型鼻咽癌的典型病例Figure 1．Typical Cases of Ascending and Descending Nasopharyngeal Carcinoma

在既往的研究中，免疫系統(tǒng)對腫瘤進展模式的潛在影響較少受到關(guān)注。鼻咽和淋巴結(jié)均為次級淋巴器官。宿主的免疫背景和腫瘤內(nèi)的免疫微環(huán)境可能是影響腫瘤進展的重要因素［7-9］。從2017 年開始，我院部分鼻咽癌患者接受了基于流式細胞儀的外周血淋巴細胞亞群定量檢測。本研究擬利用這部分患者，比較上行型和下行型腫瘤外周血淋巴細胞亞群差異，探討宿主免疫背景與腫瘤進展之間可能存在的相關(guān)性。

既往研究一般根據(jù)T、N 分期進行上行/下行的定義:T3-4N01為上行型，T1-2N2-3為下行型，T3-4N2-3為混合型［10］。在本研究中，我們嘗試以陽性淋巴結(jié)體積（gross tumor volume of neck lymph nodes，GTV-N）與原發(fā)腫瘤體積（gross tumor volume of primary tumor，GTV-T）比（GTV-N to GTV-T ratio，NTR）定義上行型（低NTR）和下行型（高NTR），并驗證這個新的分型方式是否較傳統(tǒng)的TN 分型方法更準確地反映腫瘤的特點和預后。

1 資料和方法

1.1 納入與排除標準

本研究經(jīng)四川省腫瘤醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會批準（審批號：SCCHEC-02-2019-10） 。病例納入標準:（1）組織學證實為非角化性癌，EBER（EBV-encoded RNA）原位雜交陽性；（2） AJCC 第8 版分期為III 和IVa 期；（3）有治療前頭頸部增強磁共振圖像；（4）治療前接受過流式細胞術(shù)分析外周血淋巴細胞亞群；（5）已完成根治性放療或放化療；（6）至少隨訪12個月。排除標準:（1）完成治療后6 個月內(nèi)早期復發(fā)；（2）因IMRT 靶區(qū)勾畫缺陷導致局部或區(qū)域復發(fā)；（3）既往有自身免疫性疾病或活動性疾病；（4）有需要使用免疫抑制劑的合并癥；（5）需要藥物治療的活動性感染。

1.2 放化療方案

入組患者均接受以IMRT 為基礎(chǔ)的根治性放（化）療。原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)GTV 劑量70～72.6Gy/32～33f。預防照射CTV 劑量 50～60Gy/28～33f。治療期間給予化療的方式包括同步放化療、誘導化療聯(lián)合同步放化療、序貫放化療等。誘導化療的方案為含鉑雙藥方案或三藥方案，主要包括紫杉醇/吉西他濱/多西他賽+順鉑、紫杉醇+卡鉑/奈達鉑/洛鉑、紫杉醇/多西他賽+順鉑+氟尿嘧啶。序貫化療方案同誘導化療。同步化療藥物多為單藥順鉑或紫杉醇/多西他賽+順鉑或單藥奈達鉑/卡鉑。

1.3 陽性淋巴結(jié)與原發(fā)腫瘤體積比的計算

采用MIM 7.0 軟件在治療前MRI 圖像上勾畫原發(fā)灶和頸部陽性淋巴結(jié)的GTV。所有勾畫均由兩名具有高級職稱的頭頸放療醫(yī)生討論決定。對于咽后淋巴結(jié)與原發(fā)腫瘤發(fā)生融合的情況，另加一名影像科專家參與確定分界線，以區(qū)分屬于原發(fā)灶和淋巴結(jié)的部分。NTR 的計算方法為陽性淋巴結(jié)體積除以原發(fā)腫瘤體積。

1.4 外周血淋巴細胞亞群分析

對入組患者治療前的外周血樣本進行處理，并用熒光素標記的抗體（BD Multitest 試劑盒）進行染色。采用多通道流式細胞儀（BD FACS Canto）計數(shù)CD3、CD4、CD8、CD45、CD19、CD16、CD56 染色陽性的免疫細胞百分比（%）和絕對值（cells/μL）。采用Flowjo 軟件（Flowjo v10.6.1）對結(jié)果進行分析。

1.5 終點

主要終點為無局部復發(fā)生存（local recurrence-free survival，LRFS）和無遠處轉(zhuǎn)移生存（distant metastasisfree survival，DMFS）。復發(fā)被定義為根治性放（化）療后臨床腫瘤全部消退，治療結(jié)束6 個月以后原發(fā)部位再次出現(xiàn)與原腫瘤病理類型相同的腫瘤；LRFS 為治療開始第1 天至發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤復發(fā)的時間；DMFS 定義為治療開始第1 天至檢測到腫瘤轉(zhuǎn)移的時間。復發(fā)應經(jīng)組織學證實。診斷骨和肝轉(zhuǎn)移需要至少兩種不同的影像學方法的證據(jù)，并同時具有轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移后的記錄。診斷肺轉(zhuǎn)移需要有轉(zhuǎn)移前后胸部CT對比。由于復發(fā)和轉(zhuǎn)移均對總生存（overall survival，OS）和疾病無進展生存（progression-free survival，PFS）產(chǎn)生影響，且本研究初步分析顯示不同分型之間OS 及PFS 均無差異，因此本研究終點不包括OS和PFS。此外，由于僅有2 例出現(xiàn)頸部復發(fā)，區(qū)域無進展生存未做分析。隨訪方式包括門診或住院復查以及電話隨訪等。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行生存分析和COX 回歸模型分析。分別以復發(fā)和轉(zhuǎn)移作為結(jié)局事件采用ROC 曲線選取曲線下最大面積（area under the curve，AUC）所對應的數(shù)值作為NTR 劃分的臨界值，以此分為上行型、下行型和混合型。并采用X-tile 分析確定各淋巴細胞亞群百分比與絕對值的最佳截斷值。不同生存曲線的比較采用Log-rank 檢驗。使用Graph Pad Prism 9.0 版軟件繪制圖表。所有檢驗均為雙尾檢驗，P＜ 0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者基本特征

從2017 年11 月至2021 年11 月，共252 例初診患者接受外周血淋巴細胞亞群分析。排除I/II 期患者40 例，IVb 期患者33 例，放棄治療患者4 例，失訪患者5 例，死于非鼻咽癌疾病患者2 例，無治療前圖像患者4 例。最終納入164 例患者。入組患者的臨床特征見表1。

表1 164 例鼻咽癌患者的一般臨床特征Table 1. Clinical Characteristics of the 164 Patients with Nasopharyngeal Carcinoma

2.2 治療結(jié)果

截至2022 年11 月，19 例（11.6%）發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，其中骨轉(zhuǎn)移3 例，肝轉(zhuǎn)移7 例，肺轉(zhuǎn)移5 例，肺和骨同時轉(zhuǎn)移1 例，肝和骨同時轉(zhuǎn)移2 例，肝和肺同時轉(zhuǎn)移1 例。9 例局部復發(fā)，通過隨訪MRI 圖像與IMRT 計劃的融合確定，所有復發(fā)均發(fā)生在GTV覆蓋區(qū)域。2 例出現(xiàn)淋巴結(jié)復發(fā)。全組患者的3 年OS、DMFS、LRFS、PFS 分別為88.2%、87.5%、94.0%、77.8%。

2.3 根據(jù)陽性淋巴結(jié)/原發(fā)腫瘤體積比對患者重新分型

164 例鼻咽癌患者中，陽性淋巴結(jié)體積中位數(shù)為14.02 mL（0～212.82 mL），原發(fā)腫瘤體積中位數(shù)為18.20 mL（3.32～130.49 mL）。為了確定由NTR將鼻咽癌分為上行型、下行型和混合型的最佳截斷值，我們分別以遠處轉(zhuǎn)移和局部復發(fā)為狀態(tài)變量進行ROC 分析獲取臨界值（圖2）。上行型、下行型和混合型腫瘤最終被定義為NTR ＜ 0.4、NTR ＞ 2.0 和0.4 ≤NTR ≤2.0 （圖3）。采用NTR 重分型后，共67 名鼻咽癌患者（40.85%）的臨床分型發(fā)生了變化:11 例（22.92%）TN 上行型腫瘤被重新分為NTR混合型，22 例（42.31%）TN 下行型腫瘤被歸為NTR混合型，33 例（51.56%）TN 混合型腫瘤歸為NTR上行型（22 例）和下行型（11 例），另外有1 例患者由TN 下行型歸為NTR 上行型。

圖2 ROC 曲線獲取LRFS（A）和DMFS（B）的NTR 臨界值Figure 2．ROC Curves Used to Obtain the NTR Cut-off Values for LRFS （A） and DMFS （B）

圖3 164 例患者原發(fā)腫瘤體積和陽性淋巴結(jié)體積分布圖Figure 3．Distribution of GTV-T and GTV-N of 164 Patients

2.4 NTR 分型較TN 分型更能預測局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移

在NTR 定義的上行型鼻咽癌患者中，7 例發(fā)生局部復發(fā)（占所有局部復發(fā)的77.8%），4 例發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移（占所有遠處轉(zhuǎn)移的21.1%）；而在TN 分期定義的上行型鼻咽癌患者中，相應的計數(shù)為4 例發(fā)生復發(fā)（占所有局部復發(fā)的44.4%），4 例發(fā)生轉(zhuǎn)移（占遠處轉(zhuǎn)移的21.1%）。NTR 定義的下行型鼻咽癌患者中，遠處轉(zhuǎn)移10 例（占全部遠處轉(zhuǎn)移的52.6%），局部復發(fā)1 例（占全部局部復發(fā)的11.1%）；TN 分型定義的下行型鼻咽癌患者中，遠處轉(zhuǎn)移9 例（占全部遠處轉(zhuǎn)移的47.4%），局部復發(fā)1例（占全部局部復發(fā)的11.1%）。ROC 分析顯示，對于LRFS 和DMFS， NTR 分型的ROC 曲線下面積均大于TN 分型（圖4）。對于非上行型（包括下行型和混合型，兩組之間的LRFS 差異無統(tǒng)計學意義）和上行型鼻咽癌，NTR 分型的3 年LRFS 分別為97.2%和88.5%（P= 0.006），TN 分型的3 年LRFS 分別為94.8%和91.9%（P= 0.385）；非下行型（包括上行型和混合型，兩組之間的DMFS 差異無統(tǒng)計學意義）和下行型鼻咽癌的3 年DMFS 在NTR 分型中分別為91.1%和77.0%（P= 0.004），在TN 分型中分別為89.4%和83.0%（P= 0.137）（圖5）。 NTR 分型法在對預測局部晚期鼻咽癌局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移方面優(yōu)于傳統(tǒng)的TN 分型。

圖4 NTR 分型和TN 分型預測LRFS 和DMFS 的ROC 曲線Figure 4．ROC Curves of NTR and TN Classifications for Predicting LRFS and DMFS

圖5 上行型和非上行型鼻咽癌之間LRFS 的Kaplan-Meier 曲線比較，NTR 分型（A），TN 分型（B）；下行型和非下行型鼻咽癌之間DMFS 的Kaplan-Meier 曲線比較，NTR 分型（C），TN 分型（D）Figure 5．Kaplan-Meier Curves of LRFS and DMFS in Different Types by NTR Classification and TN Classification

2.5 下行型鼻咽癌患者CD3+CD4+T 淋巴細胞明顯升高

為了回答不同進展模式的腫瘤是否存在宿主免疫背景的差異，比較上行型、下行型和混合型鼻咽癌患者外周血中CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B和CD（16+56）+NK/T亞群的差異。我們發(fā)現(xiàn)，CD3+CD4+T 淋巴細胞的百分比和絕對計數(shù)在下行型鼻咽癌患者中顯著升高，引起CD3+T淋巴細胞亞群的絕對值也相應升高。而其他亞群在下行型和其他分型之間差異無統(tǒng)計學意義，提示CD3+CD4+T 淋巴細胞亞群可能與腫瘤進展模式相關(guān)（圖6）。

圖6 不同NTR 分型之間各淋巴細胞亞群的差異比較Figure 6．Comparison of Lymphocyte Subsets in Three Types of Nasopharyngeal Carcinoma by NTR Classification

2.6 NTR 定義的臨床分型是影響患者LRFS 和DMFS 的獨立預后因素

對LRFS 和DMFS 進行COX 回歸分析，進一步探討臨床分型和宿主免疫背景與治療結(jié)果的相關(guān)性。在LRFS 的單因素分析中，NTR 分型（P= 0.006）和順鉑累積劑量（P= 0.039，非鉑類化療均按順鉑低劑量計算）與局部控制率相關(guān)，而在多因素分析中，只有NTR 分型是LRFS 的獨立預后因素（HR= 6.779，95%CI1.406～32.695，P= 0.017）。在DMFS 的分析中，單因素分析顯示N 分期（P= 0.006）、CD3+CD8+T 細胞百分比（P= 0.044）和NTR 定義的臨床分型（P= 0.004）與遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，但多因素分析顯示只有NTR 臨床分型是DMFS 的獨立預后因素（HR= 3.409， 95%CI1.384～8.396，P= 0.008；表2、3）。

表2 164 例鼻咽癌LRFS 的單因素和多因素分析Table 2．Univariate Analysis and Multivariate Analysis of LRFS of 164 NPC Patients

表3 164 例鼻咽癌DMFS 的單因素和多因素分析Table 3．Univariate Analysis and Multivariate Analysis of the DMFS of 164 NPC Patients

3 討 論

鼻咽癌原發(fā)灶與頸部淋巴結(jié)的不平衡發(fā)展是一個值得研究的臨床現(xiàn)象，本研究從兩方面就此進行了探討：一是針對既往定義的模糊性，提出一種新的定量方法來定義上行型/下行型鼻咽癌；二是基于患者外周血淋巴細胞亞群百分比和計數(shù)，探討不同臨床分型與宿主免疫背景的可能關(guān)系。

既往研究一般根據(jù)TN 分期定義上行型/下行型，但這種分型法某些情況并未真實反映腫瘤負荷。例如，一個T3N3 腫瘤有多個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，原發(fā)灶較小，但因為顱底骨結(jié)構(gòu)受侵（如斜坡受侵）而分為T3，根據(jù)TN 分型應為混合型，但從原發(fā)灶和淋巴結(jié)腫瘤負荷看，分為下行型腫瘤更為合理。在本研究中，我們引入了一種新的定義方法，即陽性淋巴結(jié)與原發(fā)腫瘤體積比，并根據(jù)其對局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的預測能力，提出了定義上行型/下行型鼻咽癌的臨界值。生存分析結(jié)果顯示，NTR 分型上行型預測局部復發(fā)的能力強于TN 分型上行型，而NTR 分型下行型預測遠處轉(zhuǎn)移的能力強于TN 分型下行型。

TN 分期反映了腫瘤侵襲的范圍，而原發(fā)腫瘤［11］或陽性淋巴結(jié)［12］的腫瘤負荷也可能是影響鼻咽癌生存的獨立預后因素。一般來說，腫瘤原發(fā)灶進展與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈線性相關(guān)［13］，但部分腫瘤，如鼻咽癌，原發(fā)灶進展與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯的多樣性。這種差異可能反映了腫瘤的生物學行為，并可能與治療反應和結(jié)局相關(guān)。已有研究提出，原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)之間的代謝差異（淋巴結(jié)與原發(fā)腫瘤18F-氟脫氧葡萄糖攝取的比值）是乳腺癌［14］和肺癌［15］的預后因素。Hung 等［16］對鼻咽癌也進行了類似的研究，發(fā)現(xiàn)陽性淋巴結(jié)與原發(fā)灶之間相對最大標準化攝取值比值是鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移的獨立預測因素（HR= 2.20，P= 0.011），這與我們的觀察結(jié)果類似。與代謝成像相比，MR 圖像可以獲得精確的腫瘤體積，且有更好的經(jīng)濟性和可及性，值得今后擴大樣本，進行多中心研究進一步驗證NTR 分型作為鼻咽癌預后因素的有效性。

本研究同時探討了宿主免疫背景與臨床分型之間的關(guān)系，以及免疫因素對鼻咽癌預后的影響。導致腫瘤原發(fā)灶和區(qū)域淋巴結(jié)不均衡進展的因素尚不清楚，由于鼻咽屬于結(jié)外淋巴組織，且鼻咽癌組織中存在大量的免疫細胞，因此免疫系統(tǒng)在腫瘤進展中可能起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與鼻咽癌其他分型相比，NTR 下行型鼻咽癌外周血CD3+CD4+T 淋巴細胞水平顯著升高，下行型鼻咽癌患者中CD3+T淋巴細胞絕對值的升高與CD3+CD4+T 淋巴細胞的升高相關(guān)。但包括CD3+CD4+T 亞群在內(nèi)的免疫細胞亞群均不是影響預后的獨立因素。在另一項關(guān)于鼻咽癌的獨立研究中，CD3+CD4+T 淋巴細胞計數(shù)的減少被發(fā)現(xiàn)與較差的無遠處轉(zhuǎn)移生存率相關(guān)［17］。在非小細胞肺癌患者中，外周血CD3+CD4+T 細胞計數(shù)升高預示著更長的生存期［18］。因此，外周血CD3+CD4+T 淋巴細胞計數(shù)增高可能只是下行型鼻咽癌的伴隨改變，而并不是其出現(xiàn)較多遠處轉(zhuǎn)移的內(nèi)在因素。免疫系統(tǒng)如何參與鼻咽癌的發(fā)展及如何影響治療反應還需進一步結(jié)合免疫動態(tài)變化及腫瘤內(nèi)免疫微環(huán)境因素進行更深入的討論［19-20］。

綜上所述，本研究提出了一種新的鼻咽癌臨床分型方法（NTR 分型）。證明了這種新的分型法在預測臨床終點方面相較TN 分型法的優(yōu)越性。這一新定義使我們能夠更客觀地分析導致腫瘤原發(fā)灶和淋巴結(jié)不平衡生長的機制，為解決腫瘤復發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移提供新的思路。

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