逍遙丸對(duì)“怒”應(yīng)激大鼠海馬差異表達(dá)基因的影響及機(jī)制探討*

陳思潔,肖 亮,王 瑩,李瑋婷,付 勇,楊軍平△

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,江西南昌 330004;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西南昌 330006;3.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院針灸科,江西南昌330006

應(yīng)激是外部壓力作用于機(jī)體,導(dǎo)致的一系列網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)和生理反應(yīng)。短期應(yīng)激能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)外部環(huán)境的適應(yīng)能力,反復(fù)或長期應(yīng)激則會(huì)破壞機(jī)體的調(diào)節(jié)系統(tǒng),出現(xiàn)一系列神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫和代謝等的異常和紊亂,導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)情緒和行為異常[1]。近些年來,情緒心理應(yīng)激作為心血管疾病、結(jié)直腸癌、不孕癥等多種疾病的致病因素而成為研究熱點(diǎn)[2]。

源自中醫(yī)理論體系的七情致病論強(qiáng)調(diào)情志活動(dòng)與疾病的關(guān)系,“怒”情志首傷肝,《醫(yī)碥》曰:“百病皆生于郁...皆肝木之病矣”,“肝主疏泄”與情志疾病的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系[3]。研究表明,“肝主疏泄”這一功能與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(NEI)網(wǎng)絡(luò)息息相關(guān),通過中樞多種神經(jīng)遞質(zhì)及其神經(jīng)肽、激素等的表達(dá)變化來調(diào)節(jié)相關(guān)臟腑的功能,與情緒心理應(yīng)激的免疫功能調(diào)控密切相關(guān)[4]。逍遙丸作為抗“怒”應(yīng)激的首選方藥,其被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代心身醫(yī)學(xué)劃分的情緒心理應(yīng)激相關(guān)疾病中[5-6],對(duì)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞具有較好的治療作用,但目前有關(guān)逍遙丸與情緒心理應(yīng)激在基因水平方面的研究鮮見相關(guān)報(bào)道。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-Seq)是一種從生物體水平進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)手段,能夠從分子層面揭示疾病的發(fā)生發(fā)展過程及多靶點(diǎn)藥物的作用機(jī)制,被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,對(duì)研究情志致病起著重要的作用。海馬體是應(yīng)激性刺激中受損最嚴(yán)重的大腦區(qū)域之一,與情緒和行為有著密切的聯(lián)系[7-9]。因此,本研究通過RNA-Seq分析正常、“怒”應(yīng)激及逍遙丸干預(yù)后大鼠海馬的差異表達(dá)基因(DEG),并對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析及驗(yàn)證,以期從基因組學(xué)層面探究“怒”情緒應(yīng)激的生物學(xué)機(jī)制及逍遙丸抗“怒”應(yīng)激的作用機(jī)制,為進(jìn)一步篩選“怒”應(yīng)激相關(guān)基因和中藥逍遙丸的藥效靶基因等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料來源 選用Wistar大鼠(SPF級(jí))72只,SD大鼠(SPF級(jí))12只,均為雄性,8周齡,體質(zhì)量(200±20)g;兩種品系的大鼠均由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2019-0010。將大鼠隨機(jī)分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,不限飲食,室溫20～25 ℃,早上7點(diǎn)開燈,晚上7點(diǎn)熄燈[10]。實(shí)驗(yàn)方案已通過江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),審核批號(hào):JZLLSC20220814。

1.2儀器與試劑 DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),VII A 7 Real-time PCR System(美國Applied Biosystems公司),NanodropTMOne超微量紫外分光光度計(jì)(美國Thermo公司),NanoDrop ND-1000(美國NanoDrop公司),Gene Amp PCR System 9700(美國Applied Biosystems公司),Agilent 2100 Bioanalyzer(美國Agilent公司),Illumina HiSeq2000/2500/3000/4000(美國Illumina公司)。逍遙丸(仲景宛西制藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字:Z41021831),氟西汀膠囊(蘇州中化藥品工業(yè)有限公司,批號(hào):J20200039),5-HT、CORT酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定試劑盒(江西博茵達(dá)生物科技有限公司,批號(hào)分別為MM-0442R1、GT10870)、TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司,批號(hào)10296-028),異丙醇、氯仿(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)分別為40064391、10006818),RNA酶抑制劑、RiboZero Magnetic Gold Kit(Human/Mouse/Rat)、KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit(Illumina,批號(hào)KK8401)。

1.3方法

1.3.1造模 參照文獻(xiàn)[10-11]方法,采用“足底電擊+社會(huì)隔離法”對(duì)孤養(yǎng)的Wistar大鼠制備“怒”應(yīng)激模型。為孤養(yǎng)大鼠制造早晚顛倒的生活環(huán)境,晚上7點(diǎn)開燈,早上7點(diǎn)熄燈;每天不定時(shí)進(jìn)行侵犯鼠干擾(隨機(jī)選取1只SD大鼠放入模型鼠的單籠,持續(xù)15 min),進(jìn)行無法逃避的足底電擊(電擊棒3 000 V,持續(xù)15 min),不限飲食,持續(xù)21 d(正常組大鼠與侵犯鼠隔離聲音飼養(yǎng)且光線正常)。

1.3.2分組與給藥 Wistar大鼠隨機(jī)分成正常組(12只)和“怒”應(yīng)激模型組(60只),正常組每6只1籠,“怒”應(yīng)激模型組單籠(37 cm×27 cm×17 cm)孤養(yǎng),并按上述方法復(fù)制“怒”應(yīng)激模型,正常組大鼠不做處理。SD大鼠作為侵犯鼠,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后廢棄處理。造模1周后,60只“怒”應(yīng)激模型組大鼠隨機(jī)分出48只進(jìn)入中藥低、中、高劑量組和氟西汀組,每組12只,并于每日應(yīng)激造模后分別給予含生藥量為0.45 g/kg·d、0.90 g/kg·d、1.80 g/kg·d的逍遙丸混懸液[12]及10 mg/kg·d的氟西汀[13]灌胃治療2周,中藥低、中、高劑量組統(tǒng)稱中藥組,余下12只作為“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組,正常組與“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組灌服生理鹽水,灌胃容積為1 mL/100 g體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)第21天晚上8點(diǎn)大鼠禁食,翌日上午8點(diǎn)開始麻醉,采用眼靜脈取血方式收集血液,靜置后離心(3 000 r/min,15 min),分離血清待測;用頸椎脫臼法處死大鼠,于冰盒上摘取海馬組織,放入-80 ℃冰箱。

1.3.3動(dòng)物行為學(xué)試驗(yàn) (1)曠場試驗(yàn)[14-15]。于實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)第3周末進(jìn)行。試驗(yàn)全程保持安靜,準(zhǔn)備曠場箱大小為1.0 m×1.0 m×0.5 m,底面分為25個(gè)等方格,靠內(nèi)壁一圈為周圍格,其余為中央格。啟動(dòng)攝像儀器,提起大鼠尾巴中后段將其放置于曠場箱中央,記錄大鼠3 min運(yùn)動(dòng)軌跡。采用軟件分析以下各項(xiàng)得分,①水平得分:大鼠經(jīng)過格子數(shù);②垂直得分:大鼠直立次數(shù)。(2)攻擊行為試驗(yàn)[16]。于實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)第3周末進(jìn)行。將單只大鼠放入待測籠,啟動(dòng)攝像儀器,隨機(jī)選取1只SD侵犯鼠放入大鼠籠中,記錄15 min內(nèi)大鼠的行為變化,計(jì)算以下得分,①攻擊次數(shù);②攻擊累積時(shí)間。

1.3.4海馬5-HT、血清CORT水平測量 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測海馬中5-HT、血清中CORT水平。

1.3.5海馬組織收集與RNA-Seq 分別從正常組、“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組、中藥高劑量組中隨機(jī)選擇5只大鼠的海馬組織作為樣本進(jìn)行測序分析。提取各組海馬的總RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計(jì)定量檢驗(yàn)后,去除rRNA,富集mRNA并構(gòu)建cDNA文庫,用qPCR方法進(jìn)行文庫的最終定量,對(duì)合格cDNA文庫進(jìn)行測序。

1.3.6轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)與基因差異表達(dá)分析 原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過嚴(yán)格的測序質(zhì)量控制,在測序完成后,需要對(duì)Illumina測序儀產(chǎn)生FASTQ格式的原始序列進(jìn)行質(zhì)檢以評(píng)估能否進(jìn)行后續(xù)分析,通過統(tǒng)計(jì)Q30來判斷測序質(zhì)量,一般Q30≥80%表示測序質(zhì)量極高。本研究Q30(評(píng)估測序質(zhì)量的參數(shù))均超過90%,說明樣本測序質(zhì)量極高。對(duì)轉(zhuǎn)錄組測序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾后通過Ensembl數(shù)據(jù)庫與參考基因組進(jìn)行比對(duì),計(jì)算基因的FPKM值,設(shè)定閾值為顯著性水平P≤0.05且組內(nèi)FPKM均值≥0.5,差異倍數(shù)≥1.5或≤0.667來篩選差異表達(dá)基因。

1.3.7基因本體(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 對(duì)篩選獲得的差異表達(dá)基因,進(jìn)行GO與KEGG通路富集分析。其中GO分析包括以下3個(gè)子條目:分子功能(MF)、細(xì)胞組成(CC)、參與的生物學(xué)過程(BP)[17]。

1.3.8逍遙丸回調(diào)差異表達(dá)基因分析[18]使用Venny2.1.0工具將正常組vs.“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組vs.中藥組的差異表達(dá)基因取交集,進(jìn)一步篩選逍遙丸在回調(diào)“怒”應(yīng)激致病網(wǎng)絡(luò)中的重要基因。

1.3.9實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)驗(yàn)證 用TRIZO提取海馬總RNA并檢測濃度,采用逆轉(zhuǎn)錄+擴(kuò)增對(duì)轉(zhuǎn)錄組測序的交集差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。引物由英駿生物技術(shù)有限公司合成。使用基因β-actin作為內(nèi)參,目的基因擴(kuò)增后的結(jié)果經(jīng)過內(nèi)參校正,使用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量,各引物序列見表1。

表1 待測基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1“怒”應(yīng)激大鼠曠場試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)期間“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組大鼠在造模過程中死亡1只,剩余11只大鼠納入最終實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前1天,各組水平得分、垂直得分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第21天,相較于正常組,“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組水平得分、垂直得分下降(P<0.01);相較于“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組,中藥中劑量組、中藥高劑量組和氟西汀組水平得分、垂直得分上升(P<0.01),但中藥高劑量組和氟西汀組組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠曠場試驗(yàn)結(jié)果分)

2.2“怒”應(yīng)激大鼠攻擊行為試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)前1天,各組大鼠攻擊次數(shù)和攻擊累積時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第21天,相較于正常組,“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組攻擊次數(shù)、攻擊累積時(shí)間增加(P<0.01);相較于“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組,中藥中劑量組、中藥高劑量組和氟西汀組攻擊累積時(shí)間減少(P<0.01),中藥高劑量組和氟西汀組攻擊次數(shù)減少(P<0.01),但中藥高劑量組和氟西汀組組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠攻擊行為試驗(yàn)結(jié)果

2.3各組大鼠海馬5-HT、血清CORT水平比較 相較于正常組,“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組5-HT、CORT水平升高(P<0.01);相較于“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組,中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組和氟西汀組大鼠5-HT、CORT水平均降低(P<0.01),但中藥高劑量組和氟西汀組組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠海馬5-HT、血清CORT水平比較

2.4RNA-Seq結(jié)果分析

2.4.1差異表達(dá)基因分析 使用Ballgown進(jìn)行樣本表達(dá)水平的定量,分析不同組間基因的差異表達(dá),篩選出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因(P≤0.05,差異倍數(shù)≥1.5或≤0.667且組內(nèi)FPKM均值≥0.5)。相較于正常組,”怒”應(yīng)激模型對(duì)照組有43個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因28個(gè),下調(diào)基因15個(gè);相較于”怒”應(yīng)激模型對(duì)照組,中藥組差異表達(dá)基因共有42個(gè),其中上調(diào)基因22個(gè),下調(diào)基因20個(gè)。見圖1。

注:A為“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組 vs. 正常組;B為中藥組 vs. “怒”應(yīng)激模型對(duì)照組;左右兩條縱向的綠線分別為上調(diào)和下調(diào),綠色橫線為P閾值。

2.4.2差異表達(dá)基因GO富集分析結(jié)果 相較于正常組,“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組差異表達(dá)基因富集到BP條目34條,上調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞氧化解毒,紅細(xì)胞、骨髓細(xì)胞生長,血小板激活,對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)等;下調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞蛋白質(zhì)復(fù)雜裝配、組成。富集到MF條目10條,上調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及氧化還原酶活性、抗氧化活性、有機(jī)酸結(jié)合、血紅素結(jié)合、結(jié)合珠蛋白結(jié)合、四吡咯結(jié)合;下調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。富集到CC條目10條,上調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及結(jié)合珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合;下調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及線粒體膜、細(xì)胞及細(xì)胞器內(nèi)膜。

相較于“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組,中藥組差異表達(dá)基因富集到BP條目50條,上調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及蛋白質(zhì)折疊、基因轉(zhuǎn)譯、RNA生物合成、細(xì)胞元調(diào)控;下調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及血小板激活、血液凝固與止血、細(xì)胞氧化解毒、分解代謝。富集到MF條目16條,上調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及RNA聚合酶Ⅱ、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)二聚活動(dòng);下調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及氧化還原酶活性、抗氧化活性、有機(jī)酸結(jié)合、血紅素結(jié)合、結(jié)合珠蛋白結(jié)合、四吡咯結(jié)合。富集到CC條目13條,上調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞內(nèi)體,線粒體被膜、膜間隙,核小點(diǎn);下調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞外空隙、結(jié)合珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合、血紅蛋白復(fù)合體、分泌泡、分泌泡囊、細(xì)胞質(zhì)。

2.4.3差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析結(jié)果 “怒”應(yīng)激模型對(duì)照組與正常組差異表達(dá)基因比較,共富集到3條通路,其中上調(diào)差異表達(dá)基因富集到2條,涉及非洲錐蟲病、瘧疾;下調(diào)差異基因富集到1條,涉及糖尿病性心肌病。中藥組與“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組差異表達(dá)基因比較,共富集到3條通路,其中上調(diào)差異表達(dá)基因富集到1條,涉及單純皰疹病毒1型;下調(diào)差異表達(dá)基因富集到2條,涉及非洲錐蟲病、瘧疾。見圖2、3。

注:A為上調(diào)差異表達(dá)基因,B為下調(diào)差異表達(dá)基因;圖中條目按照P從低到高排列,縱坐標(biāo)表示P(-log10轉(zhuǎn)化)。

注:A為上調(diào)差異表達(dá)基因,B為下調(diào)差異表達(dá)基因;圖中條目按照P從低到高排列,縱坐標(biāo)表示P(-log10轉(zhuǎn)化)。

2.4.4逍遙丸回調(diào)差異表達(dá)基因分析 將正常組vs.“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組vs.中藥組先上調(diào)后下調(diào)的差異表達(dá)基因取交集,得到1個(gè)交集基因Slc25a22;將正常組vs.“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組vs.中藥組先下調(diào)后上調(diào)的差異表達(dá)基因取交集,得到4個(gè)交集基因Rtkn、Pf4、Hbb-b1、Hbb,表明逍遙丸可能通過調(diào)節(jié)這些基因表達(dá)水平回調(diào)“怒”應(yīng)激致病。見表5、圖4。

注:N為正常組;M為“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組;D為中藥組;up為上調(diào);down為下調(diào)。

2.4.5RT-qPCR驗(yàn)證差異基因結(jié)果 相較于正常組,“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組Rtkn、Pf4、Hbb-b1、Hbb mRNA表達(dá)均上調(diào)(P<0.05),Slc25a22 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05);相較于“怒”應(yīng)激模型對(duì)照組,中藥組Rtkn、Pf4、Hbb-b1、Hbb mRNA表達(dá)均下調(diào)(P<0.05),Slc25a22 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05),與RNA-Seq結(jié)果一致。見表6。

表6 逍遙丸對(duì)“怒”模型大鼠關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

隨著社會(huì)的迅速發(fā)展與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步,負(fù)性情緒致病已成為研究的一大熱點(diǎn)。七情致病論與情緒心理應(yīng)激是傳統(tǒng)中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于情志致病研究的重要內(nèi)容,二者在理論框架與發(fā)病原理方面存在相似性,都認(rèn)為負(fù)性情緒與健康和疾病密切相關(guān)[19]。七情中的“怒”情志是不良負(fù)性情緒的核心,“怒”首傷肝,導(dǎo)致肝失疏泄,諸病叢生。有多項(xiàng)研究表明,長期心理應(yīng)激和情緒異常容易引起體內(nèi)NEI網(wǎng)絡(luò)功能失衡,伴隨下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)分泌失常,進(jìn)一步誘發(fā)多系統(tǒng)的異常變化,主要涉及內(nèi)分泌、消化、生殖和心腦血管系統(tǒng)等[20-23]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn),采用“社會(huì)隔離+足底電擊法”制備的大鼠模型出現(xiàn)易激惹、怒叫、呼吸急促等典型怒表現(xiàn)[10,24]。本研究基于前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用孤養(yǎng)及晝夜顛倒改變大鼠生活環(huán)境,通過不定時(shí)的同類入侵及足底電擊,從心理、社會(huì)、軀體3個(gè)方面制造應(yīng)激源因素。在造模期間應(yīng)激大鼠表現(xiàn)出對(duì)外界刺激高度敏感、易激易怒,對(duì)侵犯鼠出現(xiàn)直立對(duì)峙、追逐攀壓、怒叫威脅等主動(dòng)攻擊行為。行為學(xué)試驗(yàn)提示,大鼠情緒緊張、煩躁焦慮,對(duì)外界探究的積極性降低,說明“怒”應(yīng)激模型的建立是有效的。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,單胺類神經(jīng)遞質(zhì)可作為情緒異常疾病的診斷標(biāo)志物[25]。研究發(fā)現(xiàn),身體應(yīng)激和心理應(yīng)激能夠引起海馬內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)水平抑制,5-HT水平升高,促進(jìn)HPA軸異常激活,導(dǎo)致其終末激素CORT呈高水平分泌[26-27]。同時(shí),NE與CORT水平的改變還可引起下丘腦負(fù)反饋抑制機(jī)制受損,誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞重編碼,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,損害海馬的結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致中樞機(jī)制的失調(diào)[1]。本研究結(jié)果顯示,“怒”應(yīng)激組大鼠海馬5-HT與血清CORT水平均顯著升高,提示大鼠HPA軸異常亢進(jìn)并成功處于心理應(yīng)激狀態(tài),逍遙丸干預(yù)后,以上指標(biāo)均得到顯著改善,說明逍遙丸抗“怒”情緒應(yīng)激的機(jī)制涉及中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與HPA軸的神經(jīng)-內(nèi)分泌功能調(diào)節(jié),并與5-HT和CORT的高水平分泌有關(guān)。

相關(guān)研究結(jié)果證實(shí),“怒”情緒應(yīng)激大鼠體內(nèi)存在內(nèi)分泌-炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)紊亂、線粒體網(wǎng)絡(luò)失衡、血液黏度上升及氧化應(yīng)激的情況[28-30]。本研究差異表達(dá)基因功能富集分析結(jié)果顯示,“怒”應(yīng)激相關(guān)基因涉及氧化應(yīng)激、代謝、免疫及凝血功能、細(xì)胞因子生成和線粒體網(wǎng)絡(luò),且與糖尿病性心肌病有關(guān),其功能范圍與NEI網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)。逍遙丸對(duì)“怒”應(yīng)激的調(diào)節(jié)主要集中于改善氧化應(yīng)激、凝血異常、代謝紊亂、免疫炎癥反應(yīng)及線粒體網(wǎng)絡(luò)失常。將差異表達(dá)基因取交集得到逍遙丸干預(yù)后具有顯著翻轉(zhuǎn)效果的5個(gè)基因并進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,結(jié)果與RNA-Seq數(shù)據(jù)相符。其中Rtkn是Rho效應(yīng)因子,Rtkn能夠與TIP-1相互作用以促進(jìn)Rho介導(dǎo)的血清應(yīng)答元件的激活[31],其表達(dá)量與多種癌癥皆有密切聯(lián)系[32]。本研究“怒”應(yīng)激大鼠血清應(yīng)答元件CORT水平的升高可以為海馬組織中Rtkn水平上調(diào)提供理解。Pf4除了有止血功能,也含有黏附分子、促炎和免疫調(diào)節(jié)化合物。有研究表明,精神壓力和高水平的循環(huán)腎上腺素生理水平可增強(qiáng)血小板在體內(nèi)的聚集,上調(diào)髓系細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[33]。Hbb和Hbb-b1都屬于血紅蛋白基因,研究發(fā)現(xiàn),血紅蛋白基因的表達(dá)量隨著應(yīng)激時(shí)間的增加而增加,慢性應(yīng)激可能參與血管系統(tǒng)功能、損傷和炎癥的基因調(diào)控[34-35]。Slc25a22是一種線粒體谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,具有促進(jìn)細(xì)胞合成天門冬氨酸,動(dòng)員絲裂原激活的蛋白激酶及胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的激酶信號(hào),減弱氧化應(yīng)激的作用[36]。綜合上述基因功能的分析,推測逍遙丸對(duì)“怒”情緒應(yīng)激的治療作用可能主要集中在維持血清素水平穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)代謝、調(diào)控凝血和免疫功能、減輕損傷與炎癥及抵抗氧化應(yīng)激方面。

綜上所述,“怒”情緒應(yīng)激反應(yīng)可影響中樞神經(jīng)遞質(zhì)和HPA軸的正常分泌,與NEI網(wǎng)絡(luò)的異常活動(dòng)密切相關(guān),逍遙丸可通過調(diào)節(jié)Rtkn、Pf4、Hbb-b1、Hbb、Slc25a22這些基因回調(diào)“怒”應(yīng)激致病。其結(jié)果值得進(jìn)一步深入研究和探討,且有助于深化對(duì)中醫(yī)藥調(diào)治分子機(jī)理的認(rèn)識(shí),為基因情緒應(yīng)激研究提供新的線索。然而研究存在一些不足:由于儀器與試劑缺乏,未能驗(yàn)證海馬表型的差異及證明差異表達(dá)基因與海馬表型的相關(guān)性;其次,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中計(jì)劃采用基因敲除等方法驗(yàn)證差異表達(dá)基因的臨床意義,深入開展多水平的研究,進(jìn)一步佐證研究結(jié)果。