重癥監護室肺部感染患者腸道菌群特征分析*

文 楊,蔣小艷,王浩園,范文輝,周茂霖,周 強△

1.重慶市高新區人民醫院重癥醫學科,重慶 400039;2.重慶市第九人民醫院神經內科,重慶 400799;3.重慶理工大學藥學與生物工程學院,重慶 400054

重癥監護室(ICU)患者病情危重,免疫力低下,侵入性操作較多,加之頻繁使用抗菌藥物,容易出現肺部感染,是醫院感染的高危人群[1-2]。腸道菌群對抑制宿主感染、促進炎癥反應和維持宿主免疫反應與菌群活性間的平衡至關重要,還可幫助宿主抵抗致病菌,如誘導宿主的免疫交叉反應以產生針對病原體的保護性免疫[3]。研究指出,危重癥患者的腸道菌群多樣性顯著降低,腸道微生態紊亂似乎與不良預后相關[4-5]。另有研究提出了“肺腸軸”的概念,腸道菌群通過微生物分泌物和免疫調控因子對肺部健康產生影響,腸道中的消化副產物可能影響免疫系統從而調控肺部的炎癥,而腸道菌群和肺部菌群可能通過淋巴中的液體互相交換[6]。因此,維持腸道菌群穩定對提高ICU肺部感染患者的治療效果十分重要。本研究使用16S rRNA測序技術分析危重癥患者糞便微生物菌群的結構特征,并將肺部感染與非肺部感染的危重患者和健康人群的檢測分析結果進行比較,進而尋找危重癥患者肺部感染的腸道微生態危險因素,有助于制訂新的預防和治療策略。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年3-9月重慶市高新區人民醫院ICU收治的50～90歲的危重癥患者和體檢中心的50～90歲健康人群作為研究對象,包括78例ICU肺部感染患者(Y-ICU組),22例ICU非肺部感染患者(N-ICU組)和40例健康人群(HC組)。ICU肺部感染患者中,未服用抗菌藥物的患者48例,服用抗菌藥物的患者30例。ICU非肺部感染患者中,未服用抗菌藥物的患者15例,服用抗菌藥物的患者7例。挑選ICU中未服用抗菌藥物的患者作為N-antibiotic組(63例),服用抗菌藥物的患者作為Y-antibiotic組(37例)。

Y-ICU組中,男42例,女36例;年齡(75.95±11.46)歲;體質量指數(BMI)(21.37±4.39)kg/m2;急性生理與慢性健康評分系統Ⅱ評分(APACHⅡ評分)(21.03±9.17)分;住院時間的中位數為34.50 d。N-ICU組中,男11例,女11例;年齡(74.77±8.85)歲;BMI(20.33±2.88)kg/m2;APACHⅡ評分(19.14±7.84)分;住院時間的中位數為11.50 d。HC組中,男20例,女20例;年齡(72.03±9.61)歲;BMI(22.11±3.00)kg/m2。Y-ICU組與N-ICU組的年齡、BMI、APACHⅡ評分和住院時間差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性;Y-ICU組、N-ICU組、HC組年齡結構和BMI差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2納入、排除標準 納入標準:入住ICU的危重癥患者。排除標準:年齡<50歲者;存在消化道疾病或行胃腸道手術治療者;采樣前1個月內服用過益生菌或抗微生物制劑者及合并自身免疫性疾病、血液系統疾病者。本研究符合醫學倫理學標準,獲得重慶高新區人民醫院倫理委員會批準,入組前均征得受試者或直系家屬知情同意,并簽署知情同意書。

1.3方法

1.3.1樣本采集 用5 mL糞便采集管(上海朗賦實業有限公司)收集ICU患者入院1 d內的新鮮糞便樣本或健康人群的新鮮糞便樣本置于干冰上保存,于2 h內轉移到-80 ℃冰箱保存,直至提取糞便中微生物基因組DNA。

1.3.2糞便基因組DNA提取與16S rRNA測序 本研究采用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒(美國MP Biomedicals公司)提取研究對象的糞便基因組DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳(5 V/cm,20 min)檢測基因組DNA完整性,用NanoDrop2000檢測DNA純度和濃度。然后利用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對基因組的16S rDNA的V3～V4區進行第1輪擴增,擴增體系(共20 μL)包含10 ng的DNA模板,0.8 μL的正向引物338-F(5 μmol/L),0.8 μL的反向引物806R(5 μmol/L),4 μL 5×Fast Pfu Buffer,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs ,0.4 μL Fast Pfu Polymerase,0.2 μL BSA,并補ddH2O至20 μL。第1輪擴增程序為:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,循環27次;72 ℃再延伸10 min,4 ℃冷卻保存。第1輪擴增產物選擇3 μL 2%的凝膠電泳(120 V,20 min)用于檢驗目的片段是否成功擴增。隨后,用磁珠法純化第1輪擴增產物。純化的擴增產物由重慶浦洛通基因醫學研究院上機測序。擴增產物加上特異性barcode用于識別樣本,16S rRNA V3～V4區擴增產物采用雙端測序策略(PE300)。測序反應在Illumina MiSeq測序平臺上進行,要求每個樣本產生的測序數據不低于50 000條序列片段。

1.3.3生物信息學分析 將Miseq測序下機數據根據特異性barcode序列進行樣本拆分,獲得每個樣本雙端測序數據即Paired-end(PE) 序列片段,根據PE序列片段之間的overlap采用Flash軟件對數據進行拼接(拼接后的序列稱為標簽),每個樣本不得低于50 000條標簽。對標簽序列進行質量控制,去除N含量超過0.1%的標簽,去除質量得分<20分的低質量標簽?；?7%的序列相似性用Usearch將序列歸類操作成運算分類單元(OTU),基于SLILVA 16S rRNA基因數據庫,用RDP(http://rdp.come.mus.edu/)進行序列的微生物分類(置信度70%),使用統計學分析方法對每一樣本進行不同分類級別的分類。根據統計學分析結果,得到每個樣本的微生物群落多樣性和豐度,并通過箱線圖等形式呈現出來。用Mothur分析樣本的alpha多樣性,其中包含Shannon指數、Chao1指數。利用Bray-Curtis相異指數和兩項非參數檢驗[置換多元方差分析(Adonis分析)和多響應置換過程分析(MRPP分析)]對數據進行相異檢驗;利用主成分分析(PCA)比較不同樣本的菌群結構,用聚類-熱圖分析不同菌群對治療策略的響應。采用LEfSe分析(線性判別分析)統計不同組別中有顯著作用即差異有統計學意義,微生物類群的LDA得分,展示LDA得分大于設定閾值(LDA得分>2分)的物種。然后,利用Tax4Fun軟件預測ICU患者腸道菌群群落的功能。最后,用皮爾遜相關系數矩陣圖表征ICU患者腸道菌群與臨床指標的相關性。

2 結 果

2.1ICU肺部感染患者腸道菌群的物種多樣性比較分析 通過對Y-ICU、N-ICU和HC組進行16S rRNA高通量測序,總共獲得8 267 315條有效序列,平均有效長度為401 bp。這些序列以97%的序列相似性聚類為2 540個OTU。ICU患者腸道菌群的物種多樣性較健康人差異有統計學意義(P<0.05),與HC組比較,Y-ICU組和N-ICU組Chao1指數均下降(P=0.002、P<0.001),見圖1A。與HC組比較,Y-ICU組Shannon指數降低(P=0.002),Y-ICU組與HC組有較為不同的腸道菌群豐富度,見圖1B。N-ICU與Y-ICU組Chao1指數和Shannon指數比較差異無統計學意義(P>0.05),Y-ICU和N-ICU組具有相似的菌群豐富度和多樣性。

筆者采用Adonis分析探討Y-ICU與N-ICU和HC的菌群結構是否存在差異,結果顯示,Y-ICU組和N-ICU組的腸道菌群結構與HC組比較差異均有統計學意義(P=0.001、0.001),但Y-ICU和N-ICU組腸道菌群結構差異無統計學意義(P=0.907),見圖1C。

2.2Y-ICU、N-ICU和HC組腸道菌群門和屬水平組成差異分析 選擇Y-ICU、N-ICU和HC組優勢菌群中相對豐度排名前5位的門水平進行分析,結果顯示,HC、N-ICU、Y-ICU組的腸道菌群都以厚壁菌門和擬桿菌門為主,HC組厚壁菌門和擬桿菌門平均相對豐度的總和高于N-ICU組和Y-ICU組(P<0.05)。與N-ICU組比較,Y-ICU組厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門、擬桿菌門和放線菌門的相對豐度差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2A、B。

注:A為相對豐度排名前5位的門水平差異分析的箱線圖;B為相對豐度排名前5位的門水平分析;C為相對豐度排名前10位的屬水平差異分析的箱線圖;D為相對豐度排名前10位的屬水平分析;E為ICU患者單一優勢菌群豐度≥50%的樣本熱圖;HC、N-ICU、Y-ICU分別為HC組、N-ICU組、Y-ICU組;ns為P≥0.05,*為0.010≤P<0.05;**0.001≤P<0.01;***P<0.001。

選擇Y-ICU、N-ICU和HC組優勢菌群中相對豐度排名前10位的屬水平進行分析,結果顯示,3組的腸道菌群以普雷沃菌屬和擬桿菌屬為主,且HC組屬水平多樣性差異有統計學意義(P<0.05)。與HC組相比,排名前10位的菌屬中,棒狀桿菌屬、卟啉單胞菌屬、厭氧球菌屬、芬戈爾德菌屬和嗜胨菌屬明顯富集于N-ICU組和Y-ICU組(P<0.05)。值得注意的是,雙歧桿菌作為最常見的腸道益生菌之一,其相對豐度在Y-ICU組中較N-ICU組更低(1.17%vs.2.35%)。見圖2C、D。另外,在HC、N-ICU和Y-ICU組中大部分樣本的單一優勢菌群相對豐度<50%,但是78例ICU肺部感染患者的樣本中,有11例樣本的單一優勢菌群相對豐度≥50%,表明這些樣本存在較嚴重的腸道菌群失調,且其優勢菌群主要集中在普雷沃菌屬、擬桿菌屬、腸球菌和埃希菌等,見圖2E。

本研究在Y-ICU和N-ICU組之間總共篩選到10個相對豐度差異有統計學意義的OTU,其中在Y-ICU組富集的有8個OTU,包括疣微菌科、阿克曼菌屬、疣微菌綱、疣微菌目、疣微菌門、月形單胞菌屬、克勞芽孢桿菌屬、消化鏈球菌科。在N-ICU組中富集的有2個OTU,為短桿菌屬和微球菌屬。N-ICU組和Y-ICU組差異最明顯的腸道微生物是疣微菌科及其代表菌屬阿克曼菌。見圖3。

圖3 Y-ICU組與N-ICU組基于OTU的LEfSe分析

2.3ICU患者腸道菌群功能預測 共預測獲得6 500個KEGG Orthology(KO),可以分類到210條代謝通路中。LEfSe分析顯示,ICU患者與健康者比較有4條代謝通路差異有統計學意義(P<0.05,LDA得分>3分),富集的代謝通路主要是基礎代謝相關的通路,如氧化磷酸化、RNA降解、ABC轉運器、硫繼電系統。HC富集的代謝通路主要是與糖類和氨基酸類代謝相關的通路,如戊糖和葡萄糖醛酸轉化途徑、淀粉和蔗糖代謝、丙氨酸天門冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖新陳代謝等。見圖4。此外,在Y-ICU組和N-ICU組中未篩選到差異代謝通路。

圖4 基于代謝通路ICU患者和健康者LEfSe分析

2.4ICU肺部感染患者腸道菌群與臨床指標的相關性 結果顯示,與HC組比較,Y-ICU和N-ICU組厚壁菌門/擬桿菌門的比值增加(P<0.05)。HC組厚壁菌門/擬桿菌門的比值都<10,但是有13例ICU患者厚壁菌門/擬桿菌門的比值>10,其中3例患者該比值更是>100,且厚壁菌門/擬桿菌門比值過大的樣本都表現出擬桿菌門豐度極小的傾向。ICU肺部感染者和非肺部感染者的厚壁菌門/擬桿菌門的比值差異無統計學意義(P>0.05)。革蘭陽性菌/革蘭陰性菌的比值在HC、N-ICU和Y-ICU組中差異無統計學意義(P>0.05)。另外,服用抗菌藥物與否的ICU患者盡管腸道菌群的Chao1指數差異有統計學意義(P<0.05),但是Shannon指數在兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5A、B。

注:A為ICU患者中抗菌藥物服用和非抗菌藥物服用者腸道菌群alpha多樣性;B為HC、N-ICU、Y-ICU組中厚壁菌門/擬桿菌門、革蘭陽性菌/陰性菌比值情況;C為患者腸道菌群與臨床參數Spearman秩相關系數熱圖;GPB/GNB分別表示革蘭陽性菌/革蘭陰性菌的比值;F/B表示厚壁菌門/擬桿菌門的比值;ns為P≥0.05;*0.01≤P<0.05 ;**0.001≤P<0.01;***P<0.001。

筆者評估了年齡結構、BMI、APACHⅡ評分和住院時間等與Y-ICU腸道菌群的關系。結果顯示,ICU患者肺部感染僅與糞球菌屬有關(P<0.05)。APACHEⅡ評分與擬桿菌屬和費克藍姆菌屬呈正相關(P<0.05),與葡萄球菌屬和消化鏈球菌屬呈負相關(P<0.05)。住院時間與魏斯菌屬呈正相關(P<0.05)。BMI與瘤胃球菌屬呈正相關(P<0.05),與雙歧桿菌屬和嗜血桿菌屬呈負相關(P<0.05),見圖5C。

3 討 論

腸道菌群被認為是人體的一個重要“器官”,對營養物質代謝、人體自身發育、免疫、疾病發生和轉歸均具有重要意義[7]。腸道中定植的厭氧菌、兼性厭氧菌可誘導腸道黏膜引起免疫反應,以抵御病原微生物的入侵,增強宿主的抗病能力,避免腸道受損害[8-10]。危重癥患者的微生物組研究方興未艾,多項研究證實腸道菌群失調在多種危重疾病中發揮著重要作用,如膿毒癥、急性腎損傷和多器官功能衰竭等[11-13]。ICU肺部感染的部分患者的腸道菌群可能存在極端生態失調,同時免疫功能低下難以制衡腸道微生物的平衡,從而容易引發感染。危重癥患者持續暴露于廣泛的內環境改變(如兒茶酚胺產生增加、葡萄糖代謝改變和胃腸功能障礙)以及臨床干預措施(如質子泵抑制劑、阿片類藥物、營養支持和抗菌藥物),這些因素均會影響腸道菌群組成,而紊亂的腸道菌群有助于病原菌的生長[14]。因此,在危重癥患者治療過程中,結合腸道菌群研究和臨床數據,綜合分析宿主和微生物間的相互作用,以及環境因素的影響,可對其治療提供積極的建議。通過對驅動微生物群落發育的生態和環境因子、菌群如何影響肺部感染的研究,可以為危重癥患者康復過程提供臨床指導,并具有重要的診斷價值。

本文通過對ICU患者和健康人群進行16S rRNA高通量測序分析,發現ICU肺部感染患者腸道菌較健康人群Chao1指數顯著降低,腸道菌群顯著失調,這與以往研究結果一致[11-13]。通過分析健康人群、危重癥肺部感染和非肺部感染患者的腸道菌群組成發現,危重癥肺部感染患者腸道中雙歧桿菌(促進健康的共生微生物)的豐富度略有降低,而變形菌門(病原微生物)的豐富度高于健康人群,這與之前研究ICU患者腸道微生物群落的特征一致[15]。另外,在肺部感染患者中微生物極度失調的患者(單一菌群相對豐度≥50%)的腸道菌群主要富集了普雷沃菌屬、擬桿菌屬、腸球菌和埃希菌。其中普雷沃菌屬是一種潛在的致病菌,可參與局部和全身感染,常引起口腔、肌肉骨骼、頭頸部、皮膚、下呼吸道和肺部等感染[16-17]。而腸球菌和埃希菌是ICU新生兒的主要早期腸道菌群[18],埃希菌感染也可通過調節JAK/STAT信號,誘導炎癥因子——抗菌藥物α(IFN-α)和抗菌藥物β(IFN-β)的產生,最終造成肺部炎癥或者損傷[19]。而主要富集在ICU患者中的芬戈爾德菌屬、嗜胨菌屬和卟啉單胞菌屬是糖尿病足骨髓炎感染的主要病原菌[20]。這些證據表明了ICU肺部感染患者腸道菌群中與感染相關的病原菌的豐度增加,從一定程度上解釋了入住ICU的患者有更大的感染風險。而ICU肺部感染者中腸道菌群極度失調者造成的肺部炎癥似乎由腸道菌群紊亂引起的自身免疫系統誘導炎癥因子所引起。本文的ICU患者腸道微生物群落的功能預測表明ICU患者腸道微生物糖類和氨基酸類代謝潛力低于健康人群,而糖代謝和氨基酸代謝能力的下降,會使危重癥患者的內環境改變,從而影響腸道菌群的組成。因此危重患者需要補充腸內營養或腸外營養來平衡失調的腸道微生態,以提高免疫力。

本研究在探索常見腸道菌群參數與ICU肺部感染結局的關系時,結果顯示革蘭陽性菌/革蘭陰性菌的比值在HC、N-ICU和Y-ICU組中并無明顯差異,表明革蘭陽性菌/革蘭陰性菌的比值不足以作為ICU肺部感染患者腸道菌群的特征性指標。厚壁菌門/擬桿菌門這一指標雖然在健康人和ICU患者中差異有統計學意義,但是ICU肺部感染者和非肺部感染者的厚壁菌門/擬桿菌門的比值并無明顯差異,因此認為厚壁菌門/擬桿菌門作為危重癥患者中肺部感染者的標志性指標欠缺說服力。另外本研究結合年齡結構、BMI、APACHⅡ評分和住院時間等評估ICU腸道菌群的關系,筆者發現未來擬桿菌屬、費克藍姆菌屬、葡萄球菌屬、消化鏈球菌屬和魏斯菌屬這些指標對提示預后和治療進展具有參考價值。但是由于本研究采用的臨床樣本數量有限,是否能把上述菌屬作為臨床危重癥的評價指標還需進一步擴大臨床樣本數量進行驗證。

綜上所述,本研究發現與健康人群相比,ICU肺部感染患者腸道菌群多樣性顯著降低,微生態失調,病原菌增加,促進健康的共生微生物減少。而ICU肺部感染患者腸道菌群的失調也許與糖代謝和氨基酸代謝下降有關。另外,基于肺腸軸理論和本研究的結果,ICU肺部感染患者可能會通過特殊菌屬(普雷沃菌、腸桿菌和埃希菌等)的感染引發自身免疫系統誘導炎癥因子產生并最終造成肺部感染,提示腸道菌群失調與ICU肺部感染有密切關系,也為ICU肺部感染患者的微生態靶向治療提供了一定的依據。