氯化膽堿對大腸桿菌發酵生產L-酪氨酸的影響

李長庚,趙思宇,李旭,趙春光,徐慶陽,3,4*

(1.天津科技大學 生物工程學院,天津 300457;2.寧夏伊品生物科技股份有限公司,銀川 750100;3.代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室,天津 300457;4.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室,天津 300457)

L-酪氨酸(L-tyrosine)是一種條件必需氨基酸,在動物及人體的新陳代謝和生長發育中起重要作用,廣泛應用于醫藥、食品、化工等行業[1-5]。隨著對酪氨酸功能開發研究的逐漸深入,其市場需求仍在不斷擴大。當前工業化生產L-酪氨酸的方式主要為提取法、酶催化法、化學法及生物發酵法[6],而利用代謝工程改造的大腸桿菌以葡萄糖為原料的生物發酵法具備成本低、生產周期較短、環境污染相對較小等優點適合工業化生產,成為目前最具潛力的大規模工業化生產L-酪氨酸的方式之一。但目前此方法生產L-酪氨酸依然存在產量和糖酸轉化率偏低及副產物較多等問題,這些問題亟待解決。

探究合適的發酵培養基配方且對發酵工藝進行優化是提升大腸桿菌發酵能力的有效方法之一[7]。而膽堿類物質是磷脂、卵磷脂合成過程中的前體物,在調節細胞生命活動中起到非常重要的作用[8-9]。研究表明,提供適量的氯化膽堿有利于菌體細胞膜的合成,可提高菌體生長速率[10];氯化膽堿作為甲基供體能夠在菌體代謝中的多種甲基化反應中提供所需的活性甲基,進而提高菌體活力,利于產酸[11]。因此,本試驗以氯化膽堿作為優化因素,以達到提升大腸桿菌L-酪氨酸發酵能力的目標。

本研究探究了發酵培養基中氯化膽堿的最佳添加量,并在此基礎上探究不同的添加方式對發酵能力的影響,從中選定最佳添加方式為全營養流加,并對此進行工藝優化。優化后的菌體量、L-酪氨酸產量及轉化率得到不同程度的提升,且副產物的積累也大幅度降低,為今后大腸桿菌工業發酵生產L-酪氨酸提供了一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

大腸桿菌TYR-05(PT7-aroGfbr+PT7-tyrAfbrtyrB+PxylF-T7RNAP+ΔpheLA):天津科技大學代謝工程實驗室保藏菌種。

1.1.2 培養基

斜面培養基:酵母浸出粉5 g/L,氯化鈉2.5 g/L,KH2PO41.0 g/L,MgSO40.2 g/L,牛肉膏10 g/L,瓊脂粉25 g/L,葡萄糖1 g/L,蛋白胨10 g/L,pH 7.0～7.2,121 ℃濕熱滅菌20 min。

種子培養基:葡萄糖30 g/L,微量元素混合液1 mL/L,檸檬酸鈉 2.0 g/L,酵母粉5 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,KH2PO43.0 g/L,蛋白胨2.0 g/L,(NH4)2SO44.0 g/L,FeSO4·7H2O 5 mg/L,MnSO4·H2O 1.2 mg/L,VH1 mg/L,VB混合液 0.5 mg/L,微量元素混合液 1 mL/L,pH 7.0～7.2,115 ℃濕熱滅菌15 min。

發酵培養基:葡萄糖10 g/L,檸檬酸鈉 2.0 g/L,FeSO4·7H2O 30 mg/L,酵母粉5.0 g/L,(NH4)2SO45.0 g/L,KH2PO4·3H2O 4.0 g/L,MgSO4·7H2O 2.0 g/L,MnSO4·H2O 10 mg/L,VH1 mg/L,VB混合液 0.5 mg/L,微量元素混合液 1.5 mL/L,pH 7.0～7.2,115 ℃濕熱滅菌15 min。

1.1.3 試劑

MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、(NH4)2SO4、KH2PO4、MnSO4·H2O(均為分析純):天津市光復科技發展有限公司;蛋白胨、酵母粉(均為生化試劑):英國Thermo Fisher Oxoid公司;NaCl(分析純):天津市登峰化學試劑廠;一水合葡萄糖(食品級):天津金匯太亞化學試劑有限公司;檸檬酸鈉(分析純):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;谷氨酸(分析純):天津希恩思生化科技有限公司;氯化膽堿、酪氨酸(均為分析純):上海麥克林生化科技有限公司;乙酸(色譜級)、乙腈(色譜純):國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV1800系列紫外分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;TG16-W高速臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;SBA-40E 生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所;YXQ-LB-100SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;5 L機械攪拌發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司;JADE-PAK?ODS-AQ C18高效液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 廣州太瑋生物科技有限公司;LC-UV100液相色譜儀 上海伍豐科學儀器有限公司;

1.3 方法

1.3.1 菌種培養與發酵

取試驗菌株大腸桿菌TYR-05劃線接種于活化斜面,37 ℃培養12 h后轉接至茄形瓶中繼續培養12 h;取適量無菌水于茄形瓶中,將菌液接入含種子培養基的發酵罐中繼續培養,pH維持在7.0～7.2,溫度恒定在37 ℃,溶氧在30%～50%;待種子菌體量(OD600 nm)達到25左右時,按照20%接種量將種子液接入新鮮的發酵培養基中,定容至3 L。發酵過程中pH控制在7.0～7.2,溫度維持在37 ℃,溶氧在30%～60%,每2 h取1～3 mL發酵液進行測定,pH通過蠕動泵流加氨水維持。

1.3.2 試驗方法

1.3.2.1 氯化膽堿添加濃度優化試驗

在不同批次發酵培養基底物中分別添加濃度為0,0.2,0.4,0.6 g/L的氯化膽堿進行5 L發酵罐試驗,確定最佳的濃度。

1.3.2.2 氯化膽堿添加方式優化試驗

氯化膽堿的添加方式見表1。

表1 氯化膽堿的添加方式Table 1 Addition methods of choline chloride

1.3.2.3 氯化膽堿全營養流加工藝優化試驗

氯化膽堿在底物培養基與流加培養基中比例優化試驗見表2,氯化膽堿的流加時間與流加速度優化試驗見表3。

表2 氯化膽堿在底物培養基與流加培養基中比例優化試驗Table 2 Optimization test of choline chloride ratio in substrate medium and fed-batch medium

表3 氯化膽堿的流加時間與流加速度優化試驗Table 3 Optimization test of feeding time and feeding speed of choline chloride

1.3.3 檢測方法

發酵過程中pH、溫度、溶氧、罐壓、通風量、菌體量、殘糖的測定方法見參考文獻[12]。

L-酪氨酸濃度的測定:將發酵液進行適當倍數的稀釋以使L-酪氨酸晶體全部溶解,以13 000 r/min離心2 min,再用去離子水將上清液稀釋至一定倍數,經0.22 μm微孔濾膜過濾后用高效液相色譜儀(HPLC)進行檢測。色譜條件:JADE-PAK?ODS-AQ C18高效液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為10%乙腈溶液,流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃,保留時間為12 min,紫外檢測波長為230 nm[13]。

1.3.4 糖酸轉化率的計算

糖酸轉化率的計算見參考文獻[14]。

1.3.5 乙酸等副產物的測定

乙酸的檢測見參考文獻[15],谷氨酸的檢測見參考文獻[16]。

2 結果與分析

2.1 氯化膽堿濃度對發酵能力的影響

在原發酵培養基中分別添加濃度為0,0.2,0.4,0.6 g/L的氯化膽堿,并以0 g/L的發酵組作為空白組,探究添加不同濃度的氯化膽堿對大腸桿菌發酵生產L-酪氨酸的影響。

2.1.1 氯化膽堿濃度對菌體生長與L-酪氨酸產量的影響

由圖1可知,隨著氯化膽堿添加濃度逐漸增加,發酵前期的生長速率也隨之加快,且進入菌體穩定期的時間縮短,當培養基中氯化膽堿添加量大于0.4 g/L時,菌體生長速率提升不明顯,最大菌體量也隨添加濃度的增加而提高。當氯化膽堿濃度為0.6 g/L時達最高,此時OD600 nm為86.6,較空白組提升了14.55%;隨著底物中氯化膽堿添加濃度逐漸增加,L-酪氨酸的最終產量也隨之增長,當添加量為0.6 g/L時達最高產量50.5 g/L,較空白組提高了7.91%。

圖1 氯化膽堿添加濃度對菌體量和L-酪氨酸產量的影響Fig.1 Effect of choline chloride addition concetration on biomass and L-tyrosine yield

2.1.2 氯化膽堿濃度對副產物與糖酸轉化率的影響

乙酸和谷氨酸都是大腸桿菌有氧發酵中常見的副產物,其中乙酸的積累不僅會限制菌體的生長[17-18],而且會抑制產物的合成[19],但蛋氨酸可以有效緩解乙酸積累對大腸桿菌的抑制作用[20],乙酸與谷氨酸的形成仍會造成碳源的流失進而降低糖酸轉化率[21]。

由圖2可知,隨著氯化膽堿添加濃度的提高,乙酸及谷氨酸的產量均呈上升趨勢,添加0.6 g/L氯化膽堿組最高,較空白對照組分別提高了53.23%、48.57%;糖酸轉化率隨氯化膽堿添加濃度的增加呈下降趨勢,0.2 g/L組、0.4 g/L組與0.6 g/L組較空白對照組分別下降了1.54%、2.32%、6.79%,其中0.6 g/L組下降幅度較大。

圖2 氯化膽堿添加量對副產物量與糖酸轉化率的影響Fig.2 Effect of choline chloride addition amount on the yied of by-products and sugar-acid conversion rate

以上試驗結果顯示,當氯化膽堿添加濃度為0.4,0.6 g/L時,對L-酪氨酸最終產量及菌體生長均有較明顯的促進作用,但兩組之間影響效果差異較小;除此之外,隨著氯化膽堿添加濃度的增加,乙酸等副產物增多,糖酸轉化率隨之下降,但0.4 g/L組下降趨勢較小,此時糖酸轉化率比0.6 g/L組高4.8%。故選擇氯化膽堿的最佳添加濃度為0.4 g/L,此時L-酪氨酸終產量和最大菌體量較空白組分別提升了6.2%、13.36%。

2.2 氯化膽堿的添加方式對L-酪氨酸發酵生產的影響

本部分試驗以2.1中底物添加0.4 g/L氯化膽堿濃度發酵組為對照組(對應圖3與圖4中A組),探究氯化膽堿的添加方式對L-酪氨酸發酵的影響。

圖3 氯化膽堿添加方式對L-酪氨酸發酵生產的影響Fig.3 Effect of choline chloride addition methods on L-tyrosine fermentation production

圖4 氯化膽堿添加方式對副產物產量和糖酸轉化率的影響Fig.4 Effect of choline chloride addition methods on the yield and sugar-acid conversion rate of by-products

由圖3和圖4可知,添加方式A組由于在底物培養基中一次性加入了全部量氯化膽堿,使得原體系中的營養充足,菌體在前10 h生物量的增長速度最快,但是隨著發酵的進行,方式A組的弊端逐漸顯露,后期由于氯化膽堿的缺乏,菌體無法保持前期的生長態勢。添加方式B組的結果顯示在補料添加后的4 h內,菌體量增長速度有一定程度的提升,隨后漲幅逐漸下降,最高的OD600 nm和產量分別為86.90,51.50 g/L,較方式A組分別提高了1.4%和3.6%。添加方式C組使得整個發酵周期內菌體所需的氯化膽堿都處于一個相對穩定的水平,在第20 h達到菌體量穩定期,較A組延長了4 h,從最終的結果來看,添加方式C組展現出了持續流加的優勢,最終的菌體生物量(OD600 nm)為88.98,較方式A組和方式B組分別提高了3.82%和2.39%,最終的L-酪氨酸產量為53.08 g/L,較方式A組和方式B組分別提高了6.79%和3.06%,除此之外,添加方式C組有效降低了乙酸和谷氨酸等副產物的產量,較方式A組分別降低了29.8%、26.7%,隨著糖酸轉化率的增加有所提高,較方式A組提升了4.58%。

2.3 氯化膽堿全營養流加工藝優化試驗

全營養流加工藝[22]是將傳統分批補料發酵工藝中全部的發酵培養基分成兩部分:一部分直接投入罐內,為發酵初期提供營養物質;另一部分單獨分裝,在發酵過程中按需流加,為不同生長階段的菌體提供最適的營養物質濃度。

2.3.1 底物與流加培養基中氯化膽堿添加比例對L-酪氨酸發酵生產的影響

本部分研究以2.2中添加方式C(底物添加∶流加添加為2∶8)發酵組為對照組。由圖5和圖6可知,C組菌體前期生長受到明顯的抑制,生長速度低于其余3組,但在18 h時,仍保持著一定活力,于第20 h達到菌體穩定期;E組、F組在發酵前期的菌體生長和產量增長曲線與D組基本類似,說明底物中30%的氯化膽堿達到菌體發酵前期需求的臨界值,隨著流加培養基的持續流入,發酵后半程依舊處于營養過飽和狀態,從而導致乙酸等副產物產量增高,糖酸轉化率降低,并不能發揮出流加的優勢;D組氯化膽堿的分配接近亞適量狀態,即最大程度利用營養物質,在各個發酵時期恰好夠支撐菌體生長,保持菌體活力。D組最終L-酪氨酸產量及最大菌體量(OD600 nm)分別為54.30 g/L、92.15,較對照組分別提高了2.3%、3.6%;副產物乙酸及谷氨酸分別為0.9,2.2 g/L,較對照組分別降低了25%、33%;此時糖酸轉化率達到最高,為23.2%,較對照組提升了1.5%。

圖5 底物與流加培養基中氯化膽堿不同的添加比例對L-酪氨酸發酵生產的影響Fig.5 Effect of different addition ratios of choline chloride in substrate medium and fed-batch medium on the fermentation production of L-tyrosine

圖6 底物與流加培養基中氯化膽堿不同的添加比例對副產物產量和糖酸轉化率的影響Fig.6 Effect of different addition ratios of choline chloride in substrate medium and fed-batch medium on the yield of by-products and sugar-acid conversion rate

2.3.2 流加培養基流加持續時間及各階段流加速度對L-酪氨酸發酵生產的影響

以2.3.1中D組(對應表3中恒速流加至發酵末期)為對照組,進一步對全營養流加工藝進行優化。

由表4可知,G組是將總量70%的氯化膽堿以恒速流加至菌體穩定期,菌體量和產量與對照組相比無明顯差異,但最終副產物乙酸及谷氨酸產量較對照組分別提升了8.7%、18.2%;糖酸轉化率下降了2.6%。H組隨菌體生長速度提高流加速度是指在葡萄糖亞適量[23]狀態下,始終保持穩定的低溶氧(dissolved oxygen,DO)變速流加。H組最大菌體量為98.32,較對照組提高了6.7%,但L-酪氨酸產量提升不明顯,副產物也大量積累,乙酸和谷氨酸產量較對照組分別提升了30.4%、27.3%,糖酸轉化率下降了2.6%。I組營養物質亞適量流加是指在葡萄糖亞適量狀態下,當DO緩慢上升時,提高補糖速率,DO未見明顯下降,此時流加營養物質,DO迅速下降,即認為此時為營養亞適量狀態[16],應提高流加培養基流加速度。I組最終L-酪氨酸產量達到55.7 g/L,較對照組提高了2.6%,最大菌體量(OD600 nm)為95.15,較對照組增長了3.3%,副產物乙酸及谷氨酸產量較對照組分別降低了65.2%、29.1%,糖酸轉化率提高了3.9%,為本優化試驗最佳方案。

表4 流加培養基流加持續時間及各階段流加速度對L-酪氨酸發酵生產的影響Table 4 Effect of feeding duration time of fed-batch medium and feeding speed at each stage on the fermentation production of L-tyrosine

3 結論

本文通過探究不同濃度的氯化膽堿對L-酪氨酸發酵生產的影響,發現適量添加氯化膽堿能夠有效加快菌體生長,提高菌體產酸能力,并且確定了氯化膽堿的最適添加濃度為0.4 g/L,在此基礎上探究不同的添加方式對發酵能力的影響,得出全營養流加工藝具有一定發酵優勢,并對該工藝進一步優化,最終確定了底物與流加培養基中氯化膽堿的添加比例為3∶7,流加培養基的流加速度隨罐內溶氧值的波動而變化,以維持營養物質亞適量狀態的全營養流加工藝。優化后的最大菌體量(OD600 nm)、L-酪氨酸產量及糖酸轉化率分別達到了95.15、55.7 g/L、24.1%,較優化前分別提升了25.9%、19.0%、7.7%;副產物乙酸和谷氨酸產量分別為0.32,1.56 g/L,較優化前分別降低了74.2%、55.4%。本研究所確定的新發酵工藝與原發酵策略相比,不僅實現了最大菌體量、L-酪氨酸產量及糖酸轉化率不同程度的提升,且大幅降低了副產物谷氨酸、乙酸的積累,為今后工業化發酵生產L-酪氨酸提供了一定的參考依據。