高耐受性氧化葡糖桿菌的篩選及鑒定

張珂,趙群,李靜,殷志航,譚海剛*

(1.青島農業大學 食品科學與工程學院,山東 青島 266000;2.濰坊職業學院食品藥品學院,山東 濰坊 261000)

醋作為我國主要的酸性調味品之一,釀造歷史悠久,食用人群廣泛[1]。醋酸菌是醋酸發酵階段的主要菌種,可將乙醇轉化為乙酸,并在該過程中產生獨特風味,影響成醋的品質[2]。目前,國內在工業上廣泛應用的醋酸菌種是中科AS1.41和滬釀1.01,但在生產過程中,普遍遇到了產酸能力不足、菌種衰退、發酵成醋口感不夠柔和、風味較單一等問題[3]。因此,篩選發酵性能好且具有良好耐受性的醋酸菌菌株是解決行業痛點的重要手段之一。Chen等[4]從醋醅中篩選得到一株對高溫、高醇耐受性好的醋酸菌AAB4,其在10%乙醇、37 ℃條件下,產乙酸達到42.0 g/L。劉靜等[5]從自然發酵的咖啡果醋中篩選出一株產酸能力較強的醋桿菌A9,其產酸能力達到3.62 g/dL。

本研究旨在從天然腐爛的無花果中篩選出一株產酸能力強、高溫耐受性、乙醇耐受性等性能較好的醋酸菌菌株,以期能夠為解決食醋工業生產中遇到的難題提供技術和理論參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

腐爛無花果:山東威海的布蘭瑞克熟果。

1.2 實驗試劑

葡萄糖、無水乙醇:萊陽市康德化工有限公司;碳酸鈣、酵母浸粉、瓊脂粉、DNA Marker:北京索萊寶生物科技有限公司;TAE緩沖液、溴化乙錠:生工生物工程(上海)股份有限公司;細菌DNA 基因組提取試劑盒:天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 實驗儀器

立式壓力蒸汽滅菌鍋 濟南德強儀器有限公司;全溫振蕩培養箱 天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司;電熱鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司;小型PCR 伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;凝膠成像系統 上海佳鵬科技發展有限公司;高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.4 培養基

普通固體培養基:1%酵母浸粉、2%葡萄糖、1.5%碳酸鈣、2%瓊脂,滅菌后加入2%無水乙醇。

乙醇脅迫固體培養基:以普通固體培養基為基礎,按需要加入無水乙醇。

液體基礎培養基:1%酵母浸粉、2%葡萄糖,pH 6.0,使用250 mL三角瓶分裝40 mL,121 ℃、15 min滅菌。

液體種子培養基:液體基礎培養基加入3%無水乙醇。

液體發酵培養基:液體基礎培養基加入5%無水乙醇。

乙醇脅迫發酵培養基:液體基礎培養基按需要加入無水乙醇。

乙酸脅迫液體培養基:液體種子培養基按需要加入乙酸。

1.5 實驗方法

1.5.1 醋酸菌分離與篩選

1.5.1.1 菌種分離

取腐爛無花果變酸部分1 g置于液體種子培養基,于30 ℃、180 r/min富集培養2 d,然后稀釋、涂布于普通固體培養基,30 ℃培養3 d,選取產生透明圈的菌株分別編號。

1.5.1.2 平板初篩

將分離的菌株分別點接到6%乙醇脅迫固體培養基(30 ℃)和普通固體培養基(37 ℃)培養3 d,選擇在兩種培養基上菌落的透明圈圈徑比均較大的菌株,利用FeCl3對選取的菌株進行乙酸定性分析[6]。

1.5.1.3 平板復篩

經平板初篩的菌株接入液體種子培養基,于30 ℃、180 r/min培養20 h,得種子液。取3 μL平板初篩的菌株種子液,點接到普通固體培養基30 ℃培養3 d,計算菌落透明圈圈徑比。

1.5.1.4 發酵篩選

取 5 mL平板復篩的菌株種子液接于液體發酵培養基,于30 ℃、180 r/min發酵4 d,測定發酵液中總酸含量,確定目標菌株。產酸量測定方法參考GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》[7]。

1.5.1.5 產乙酸能力分析

取5 mL目標菌株的種子液接于液體發酵培養基,于30 ℃、180 r/min發酵5 d,測定發酵液中乙酸含量。為確定所篩選目標菌株W-1產乙酸的能力,采用高效液相色譜法測定其在5%乙醇(30 ℃)條件下發酵5 d的發酵液中乙酸的含量,使用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);于紫外波長210 nm處檢測;柱溫25 ℃;流動相為0.05 mol/L的KH2PO4-H3PO4緩沖液(pH 2.8);流速0.7 mL/min;進樣量10 μL。乙酸標準曲線見圖1。該曲線擬合公式為y=2 396.37+4 879.77x,R2為0.999 8。

圖1 HPLC法測定乙酸標準曲線Fig.1 Standard curve of acetic acid determined by HPLC method

1.5.2 醋酸菌鑒定

1.5.2.1 生理生化鑒定

參照《伯杰氏系統細菌學手冊》[8]對菌株W-1進行生理生化鑒定。

1.5.2.2 16S rRNA鑒定

使用細菌DNA基因組提取試劑盒提取菌株W-1的DNA,使用細菌通用引物進行PCR擴增(上游引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';下游引物1492R:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。用1%(質量與體積比)瓊脂糖凝膠電泳分離擴增DNA,溴化乙錠染色后檢測。

委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rRNA測序,通過BLAST程序提交測序結果,在NCBI數據庫中進行同源序列檢索,并利用MEGA 6.06構建系統發育樹。

1.5.3 菌株W-1生理特性

1.5.3.1 菌株W-1對溫度的耐受能力

取3 μL菌株W-1的種子液點接到普通固體培養基,分別于30,35,37,39,41 ℃培養3 d,觀察醋酸菌生長及產酸情況。

1.5.3.2 菌株W-1對乙醇的耐受能力

取3 μL菌株W-1的種子液分別點接到含有2%、6%、8%、10%、12%乙醇的乙醇脅迫固體培養基,于30 ℃培養3 d,觀察醋酸菌生長及產酸情況。

1.5.3.3 菌株W-1生長曲線測定

取5 mL菌株W-1的種子液接于液體種子培養基,于30 ℃、180 r/min 培養,每隔2 h測定細胞濃度(波長540 nm處的吸光值,用OD540 nm表示),繪制菌株W-1生長曲線。

1.5.3.4 菌株W-1發酵曲線測定

取5 mL菌株W-1的種子液接于液體發酵培養基,于30 ℃、180 r/min發酵培養,每隔1 d測定細胞濃度和總酸含量,并計算產酸率,繪制菌株W-1發酵曲線。

1.5.3.5 菌株W-1遺傳穩定性

菌株W-1于試管斜面傳代10次,分別進行液體種子培養,各取5 mL種子液接于液體發酵培養基,于30 ℃、180 r/min發酵4 d,測定發酵液中細胞濃度和總酸含量。

2 結果和分析

2.1 醋酸菌分離與篩選

2.1.1 平板初篩

從腐爛無花果中分離出153株產生透明圈的菌株,分別以37 ℃(2%乙醇)和6%乙醇(30 ℃)作為脅迫條件進行平板初篩,挑選出在兩種條件下透明圈圈徑比均較大的8株菌株,分別為Z-3、Z-8、Z-11、Y-3、X-1、X-7、W-1、W-9。對這8株菌株發酵液進行乙酸定性分析,結果見圖2。

圖2 乙酸定性分析Fig.2 Qualitative analysis of acetic acid

由圖2可知,菌株的發酵液可以與FeCl3反應產生紅褐色沉淀,所以判斷發酵產物中存在乙酸。

2.1.2 平板復篩

由圖3和表1可知,菌落透明圈圈徑比較大的菌株分別是W-1、Z-8、Y-3和W-9,其中菌株W-1的圈徑比最大,為(3.16±0.08)。

表1 普通固體培養基平板復篩菌落透明圈圈徑比Table 1 Ratios of diameters of transparent circles of plate rescreened colonies on the common solid medium

圖3 普通固體培養基平板復篩菌落Fig.3 Rescreened colonies on the common solid medium

2.1.3 發酵篩選

由圖4可知,菌株W-1總酸含量最高,為(4.22±0.06) g/dL,比Z-8、Y-3和W-9分別提高了2.9%、17.35%、170.51%,最終確定菌株W-1為目標菌株。

圖4 菌株發酵篩選Fig.4 Screening and fermentation of strains

圖5 菌株W-1發酵液高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatogram of strain W-1 fermentation broth

2.1.4 產乙酸能力分析

通過圖1乙酸標準曲線計算乙酸含量為(4.01±0.16) g/dL。

2.2 醋酸菌鑒定

2.2.1 生理生化鑒定

由圖6和表2可知,菌株W-1為革蘭氏陰性菌株,菌體呈短桿狀,大小為(0.63～0.76) μm×(1.19～1.51) μm,可以氧化乙醇產生乙酸,不能氧化乙酸和乳酸,其他試驗結果也均符合葡糖桿菌屬的生理生化特征。

表2 菌株W-1生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain W-1

圖6 菌株W-1革蘭氏染色結果(G-)Fig.6 Gram staining results of strain W-1 (G-)

2.2.2 16S rRNA鑒定

對菌株W-1進行16S rRNA鑒定,其PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖7。

圖7 瓊脂糖凝膠電泳Fig.7 Agarose gel electrophoresis

由圖7可知,在1 500 bp左右有一條清晰的條帶,測得菌株W-1的16S rRNA基因序列,其含有1 394 bp堿基。通過BLAST程序提交序列,進行同源序列檢索,并通過MEGA 6.06軟件構建系統發育樹,結果見圖8。

圖8 菌株W-1系統發育樹Fig.8 Phylogenetic tree of strain W-1

菌株W-1與氧化葡糖桿菌GluconobacteroxydansDSM 3503(NR 026118.1)為同一種屬,基因序列同源性為99.64%,確定菌株W-1為氧化葡糖桿菌(CGMCC No.18500)。

2.3 菌株W-1生理特性

2.3.1 菌株W-1的高溫耐受能力

溫度過高導致菌體產酶能力下降,因此生長及產酸受到抑制[9]。將菌株W-1接種到普通固體培養基(2%乙醇),分別在不同溫度下培養,其生長及產酸結果見圖9。

圖9 菌株W-1的溫度耐受性Fig.9 Temperature tolerance of strain W-1

由圖9可知,菌株W-1在30～39 ℃范圍內生長沒有明顯差異,均能較快生長且沒有明顯的延滯期,這與Perumpuli等在斯里蘭卡椰子醋中篩選的醋酸菌Gluconobacter菌株SL13E-2和SL13E-3的耐高溫特性相近,但這兩株菌株延滯期長達2 d和3 d且乙酸產量較低,只有3.15 g/dL和3.02 g/dL[9]。

2.3.2 菌株W-1的乙醇耐受能力

將菌株W-1分別接種到含有不同乙醇濃度的固體培養基,30 ℃條件下培養,其生長及產酸結果見圖10。

圖10 菌株W-1的乙醇耐受性Fig.10 Ethanol tolerance of strain W-1

由圖10可知,菌株W-1在10%乙醇中可以生長并產酸,說明其乙醇耐受能力較熱帶醋桿菌JM2和巴氏醋桿菌B103強。同時可以看出,菌株W-1的生長和產酸能力隨著乙醇濃度的升高而逐漸變弱。在含2%～8%乙醇的固體培養基,菌株W-1生長1 d便形成了明顯的菌落,而在10%乙醇的培養基上2 d才形成菌落,說明乙醇對菌株W-1的生長及產酸產生抑制作用[10]。

2.3.3 菌株W-1生長曲線

由圖11可知,菌株W-1的延滯期為0～2 h,對數期為2～28 h,穩定期為28～36 h,處于對數期的細菌對外界因素敏感、形態典型、活性好,因此選擇菌株W-1的種子培養時間為20 h。

圖11 菌株W-1生長曲線Fig.11 Growth curve of strain W-1

2.3.4 菌株W-1發酵曲線

菌株W-1生長和產酸受到高濃度乙醇的抑制,因此菌株W-1在 3%乙醇(30 ℃)種子培養后,再將其種子液接于發酵培養基(5%乙醇、30 ℃)進行發酵,發酵曲線見圖12。

圖12 菌株W-1發酵曲線Fig.12 Fermentation curves of strain W-1

由圖12可知,菌株W-1發酵過程中,細胞濃度和總酸含量呈現逐漸增長的趨勢,而產酸率則先上升后下降。4 d時產酸率為(11.94±0.69) g/d,此時總酸含量達到(4.26±0.06) g/dL;4 d之后產酸率迅速降低,總酸含量增長緩慢,發酵6 d后總酸含量達到(4.70±0.02) g/dL。其總酸含量均高于已篩選的氧化葡糖桿菌E3[11]和葡糖桿菌Gra904[12],二者的總酸產量分別為3.35 g/dL和3.57 g/dL。

2.3.5 菌株W-1傳代穩定性

將菌株W-1傳代10次后分別在5%乙醇條件下發酵4 d,其生長和發酵情況見表3。

表3 菌株W-1傳代穩定性Table 3 Passage stability of strain W-1

由表3可知,菌株 W-1傳代10次后在波長540 nm處的吸光值維持在1.178～1.213之間,發酵液總酸含量維持在4.15～4.32 g/dL之間,生長和產酸情況均無明顯變化,說明菌株W-1穩定性較好。

3 結論

本研究以腐爛無花果為來源,采用平板分離法經過初篩、復篩及發酵篩選,最終篩選出一株高溫耐受性好、乙醇耐受能力強的醋酸菌菌株W-1,并經過生理生化鑒定、16S rRNA測序分析,確定該菌株為氧化葡糖桿菌。研究菌株W-1的生理特性發現,菌株W-1可以耐受39 ℃高溫或10%乙醇;在含5%乙醇的發酵培養基中,菌株W-1發酵4 d和6 d,總酸含量分別達到(4.26±0.06) g/dL和(4.70±0.02) g/dL,產酸能力較強;傳代穩定性實驗表明,菌株W-1的生長和產酸穩定性較好。