紫皮大蒜多酚分離純化及體外降血糖活性研究

李琳琳,王樂,尹衛(wèi),代爽,劉曉軍,梁健,王煜偉*

(1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室,西寧 810016;2.浙江清華長三角研究院,浙江 嘉興 314006)

大蒜(AlliumsativumL.)是百合科蔥屬植物,具有悠久的應(yīng)用歷史,被譽為天然的“藥用植物黃金”,是一種世界上廣泛種植的蔬菜種類之一[1]。大蒜中含有豐富的活性成分,如含硫化合物、揮發(fā)油、氨基酸、多糖、維生素、皂苷類化合物、多酚類化合物、黃酮類化合物、生物活性酶及微量元素等[2-4]。這些活性成分具有抗氧化、防治心血管疾病、抗腫瘤、降血脂等作用[5-7]。

多酚類化合物是果蔬中最重要的植物次生代謝產(chǎn)物之一[8]。多酚類化合物是天然的還原性物質(zhì),具有抗氧化、抗炎殺菌、抗腫瘤和抑制心血管疾病等多種生理功能[9-13]。其中大蒜多酚類化合物還有沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、芹菜素、鞣花酸、兒茶素、香豆酸、槲皮素和山奈酚等[14]。植物中多酚可以起到降血糖的作用[15-17],其能改善機體的胰島素功能和提高生物體的氧化還原作用。現(xiàn)有研究表明,多酚提取物可抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性,從而降低人體的血糖水平[18-20]。

多酚類化合物的分離純化在多種植物中已有研究報道,但是紫皮大蒜中多酚化合物的分離純化研究報道相對較少。本研究基于此,采用微波輔助溶劑提取法提取紫皮大蒜中的多酚物質(zhì),用XDA-7大孔樹脂對提取的紫皮大蒜多酚進行純化,以阿卡波糖為陽性對照組,研究了紫皮大蒜多酚對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制活性。通過增加紫皮大蒜多酚提取物的含量,促進紫皮大蒜酚類化合物的開發(fā)和使用,應(yīng)用于紫皮大蒜深加工技術(shù),為提高農(nóng)產(chǎn)品和副產(chǎn)品的綜合利用提供了參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大蒜樣品為課題組種植于青海樂都的蔥科蔥屬紫皮大蒜。

1.1.2 試劑

沒食子酸:天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;福林酚試劑:北京索萊寶科技有限公司;XDA-7大孔樹脂、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、脂肪酶、阿卡波糖、奧利司他:上海源葉生物科技有限公司;對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,PNPG):上海寶曼生物科技有限公司;其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;JP-060S超聲波清洗機 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;賽默飛Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀 北京昊諾斯科技有限公司;梅特勒FE28-Standard pH酸度計 上海右一儀器有限公司;NRY-2102C恒溫振蕩搖床 上海南榮實驗室設(shè)備有限公司。

2 試驗方法

2.1 紫皮大蒜多酚含量測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:精準(zhǔn)量取0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL質(zhì)量濃度為100 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液于6個25 mL容量瓶中,加入2.0 mL福林酚試劑靜置5 min,加入2.0 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的Na2CO3溶液,搖勻后靜置6 min,用蒸餾水定容后在25 ℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色60 min,以試劑空白作參比,于760 nm處測定吸光值,以沒食子酸質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光值Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.104 2X-0.061 9,R2=0.999 2。

多酚提取量(mg/g)=(C×N×V)/M。

式中:C為樣品濃度(mg/mL),N為稀釋倍數(shù),V為待測液體積(mL),M為樣品質(zhì)量(g)。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對紫皮大蒜多酚提取量的影響

稱取紫皮大蒜樣品2.0 g,在提取溫度30 ℃、料液比1∶10(g/mL)、提取時間60 min的條件下,研究20%、40%、60%、80%、100%的乙醇體積分數(shù)對紫皮大蒜中多酚提取量的影響。

2.2.2 提取溫度對紫皮大蒜多酚提取量的影響

稱取紫皮大蒜樣品2.0 g,在提取時間60 min、乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶10(g/mL)的條件下,研究20,30,40,50,60 ℃的提取溫度對紫皮大蒜中多酚提取量的影響。

2.2.3 提取時間對紫皮大蒜多酚提取量的影響

稱取紫皮大蒜樣品2.0 g,在提取溫度30 ℃、乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶10(g/mL)的條件下,研究10,20,40,60,80 min的提取時間對紫皮大蒜中多酚提取量的影響。

2.2.4 料液比對紫皮大蒜多酚提取量的影響

稱取紫皮大蒜樣品2.0 g,在提取溫度30 ℃、提取時間60 min、乙醇體積分數(shù)60%的條件下,研究1∶3、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(g/mL)的料液比對紫皮大蒜中多酚提取量的影響。

2.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗,以乙醇體積分數(shù)(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、料液比(D)作為4個變量因素,以紫皮大蒜多酚提取量為指標(biāo),采用L9(34)正交表,并分析結(jié)果范圍,進一步優(yōu)化提取紫皮大蒜多酚的工藝條件,見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.4 純化試驗

2.4.1 XDA-7樹脂預(yù)處理

將XDA-7樹脂先用去離子水沖洗,除去破碎的樹脂,在2倍量的95%乙醇中浸泡24 h后用去離子水重復(fù)清洗,除去乙醇,然后改用酸堿處理,將XDA-7樹脂浸入5% HCl溶液中24 h后用去離子水清洗直至pH變?yōu)橹行?然后浸入5% NaOH溶液中24 h后用去離子水清洗直至pH變?yōu)橹行?最后在去離子水中進行儲備。

2.4.2 XDA-7樹脂靜態(tài)吸附和解吸曲線

稱取15 g XDA-7大孔樹脂于三角瓶中,加入45 mL紫皮大蒜多酚粗提液,在100 r/min的頻率下?lián)u床振蕩3 h,每隔1 h測定一次紫皮大蒜多酚濃度,并繪制靜態(tài)吸附曲線;吸附結(jié)束后過濾,去除吸附液,將已吸附飽和的XDA-7樹脂置于三角瓶中,加入60 mL的 60%乙醇溶液,在100 r/min的頻率下?lián)u床振蕩3 h,每隔1 h測定一次紫皮大蒜多酚濃度,并繪制靜態(tài)解吸曲線。

2.4.3 吸附與解吸單因素試驗

2.4.3.1 大蒜多酚濃度對紫皮大蒜多酚純化的影響

稱取XDA-7樹脂30 g,在乙醇體積分數(shù)60%、解吸液pH為4的條件下,考察大蒜多酚濃度0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/mL對紫皮大蒜多酚純化的影響。

2.4.3.2 乙醇體積分數(shù)對紫皮大蒜多酚純化的影響

稱取XDA-7樹脂30 g,在大蒜多酚濃度2 mg/mL、解吸液pH為4的條件下,考察乙醇體積分數(shù)15%、30%、60%、75%、90%對紫皮大蒜多酚純化的影響。

2.4.3.3 解吸液pH對紫皮大蒜多酚純化的影響

稱取XDA-7樹脂30 g,在乙醇體積分數(shù)60%,大蒜多酚濃度2 mg/mL的條件下,考察解吸液的pH 1,2,3,4,5,6,7對紫皮大蒜多酚純化的影響。

2.5 降血糖活性試驗

2.5.1 紫皮大蒜多酚對α-淀粉酶的抑制作用

將0.25 mL的樣品溶液與0.25 mL的1 U/mLα-淀粉酶溶液混合,在37 ℃下預(yù)熱10 min,加入0.5 mL的0.1 g/mL底物溶液預(yù)熱10 min,放回37 ℃培養(yǎng)箱中孵化3 min,然后加入0.5 mL DNS顯色劑,混勻后沸水浴加熱8 min,冷卻至室溫。用超純水稀釋至5 mL后在540 nm處測定吸光值,每個樣品重復(fù)3次。以超純水作為空白對照組,以阿卡波糖作為陽性對照組。

抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100。

式中:A1為樣品組的吸光值,A2為樣品不加酶的吸光值,A3為空白對照組的吸光值,A4為空白對照不加酶的吸光值。

2.5.2 紫皮大蒜多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

在1 mL離心管中,依次加入磷酸緩沖液、抑制劑溶液和底物并混合均勻,在37 ℃培養(yǎng)箱中保溫10 min,結(jié)束后加入酶溶液,在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)20 min,加入200 μL的Na2CO3溶液終止反應(yīng),取200 μL反應(yīng)液于96孔板中,在405 nm處測吸光值。以不加抑制劑和酶溶液作為空白組,不加抑制劑溶液作為對照組,不加酶溶液作為樣品空白組,阿卡波糖作為陽性對照。

抑制率(%)=[1-(A4-A3)/(A2-A1)]×100。

式中:A1為空白組的吸光值,A2為對照組的吸光值,A3為樣品空白組的吸光值,A4為樣品組的吸光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 乙醇體積分數(shù)對紫皮大蒜多酚提取量的影響

由圖1可知,當(dāng)以不同體積分數(shù)的乙醇提取大蒜多酚時,大蒜多酚提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在體積分數(shù)為60%時達到最高值2.12 mg/g,是最低值的2.03倍,差異顯著(P<0.05)。因此,選擇最佳乙醇體積分數(shù)為60%。這可能是因為大蒜多酚在乙醇溶液中的溶解度隨乙醇體積分數(shù)的升高而逐漸增加,當(dāng)乙醇體積分數(shù)達到80%以上時,由于提取液中除多酚外的其他雜質(zhì)逐漸增多導(dǎo)致溶液的通透性變差,無法準(zhǔn)確測量其中的多酚含量。

圖1 乙醇體積分數(shù)對紫皮大蒜多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the extraction amount of polyphenols from purple-skin garlic

3.1.2 提取溫度對紫皮大蒜多酚提取量的影響

由圖2可知,大蒜多酚提取量在提取溫度為30 ℃時最高,達到0.94 mg/g,相對于20 ℃時的多酚提取量提高了1.58倍,差異顯著(P<0.05)。因此,選擇最佳提取溫度為30 ℃。可能的原因是紫皮大蒜中各物質(zhì)之間的氫鍵和疏水鍵被溫度上升所產(chǎn)生的大量熱能破壞,致使大量多酚物質(zhì)擴散出來;提取溫度達到30 ℃以后,紫皮大蒜中多酚提取量的下降可能與多酚的熱穩(wěn)定性或者多酚氧化酶催化作用的加強有關(guān)。

圖2 提取溫度對紫皮大蒜多酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction amount of polyphenols from purple-skin garlic

3.1.3 提取時間對紫皮大蒜多酚提取量的影響

由圖3可知,提取時間不同時,大蒜多酚提取量在40 min時最高,達到2.49 mg/g,相比于80 min時的多酚提取量提高了2.63倍,差異顯著(P<0.05)。因此,選取最佳提取時間為40 min。可能的原因是紫皮大蒜中多酚物質(zhì)的溶解程度隨著時間的增加而逐漸增強,在40 min時達到峰值,已接近于飽和,再繼續(xù)增加提取時間,多酚物質(zhì)會受光照、高溫、多酚氧化酶等外界因素的影響而氧化。因此,40 min后多酚提取量反而隨著時間的延長而下降。

圖3 提取時間對紫皮大蒜多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction amount of polyphenols from purple-skin garlic

3.1.4 料液比對紫皮大蒜多酚提取量的影響

由圖4可知,不同的料液比提取多酚時,多酚提取量呈先升高后低降的趨勢,在料液比為1∶5時最高,達到2.55 mg/g,相對于1∶20時的多酚提取量提高了1.41倍,差異顯著(P<0.05)。因此,選擇最佳料液比為1∶5。可能是因為隨著溶劑量的增加,紫皮大蒜中的多酚物質(zhì)在提取液中的溶解度逐漸降低。

圖4 料液比對紫皮大蒜多酚提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction amount of polyphenols from purple-skin garlic

3.2 紫皮大蒜多酚提取工藝正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上通過正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化,研究乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間和料液比對紫皮大蒜多酚提取量的影響。以單因素試驗結(jié)果作為試驗數(shù)據(jù)范圍,以乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間、料液比作為考察因素,以多酚提取量作為指標(biāo),正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results

由表2可知,多酚作為極性有機溶劑,在萃取過程中,受到提取劑濃度、提取時間、提取溫度、料液比等各種外界條件的影響。通過紫皮大蒜中多酚物質(zhì)提取的正交試驗結(jié)果分析可知,4個因素對紫皮大蒜多酚提取量的影響主次順序為提取時間(C)>提取溫度(B)>乙醇體積分數(shù)(A)>料液比(D)。其中提取時間對紫皮大蒜多酚提取量的影響最大,料液比對紫皮大蒜多酚提取量的影響最小,優(yōu)化后的最優(yōu)組合為A2B2C2D2,即乙醇體積分數(shù)60%、提取溫度30 ℃、提取時間40 min、料液比1∶5。在此條件下紫皮大蒜多酚提取量最高,為2.92 mg/g。

3.3 純化試驗

3.3.1 XDA-7樹脂靜態(tài)吸附和解吸曲線

由圖5可知,XDA-7樹脂對紫皮大蒜多酚物質(zhì)的吸附呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在接近120 min時,吸附作用逐漸平緩并趨于飽和,因此,吸附時間選擇120 min為宜。

圖5 吸附曲線Fig.5 Adsorption curve

由圖6可知,XDA-7樹脂對紫皮大蒜多酚物質(zhì)的解吸呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢,在60 min之后,紫皮大蒜多酚物質(zhì)基本完全解離,因此,解吸時間選擇60 min為宜。

圖6 解吸曲線Fig.6 Desorption curve

3.3.2 吸附與解吸單因素試驗

3.3.2.1 大蒜多酚濃度對紫皮大蒜多酚純化的影響

由圖7可知,紫皮大蒜多酚濃度對樹脂吸附能力具有顯著影響,當(dāng)紫皮大蒜多酚的濃度逐漸增加時,大孔樹脂的吸附能力隨之增強。由于溶液中酚類化合物濃度過高時,酚類化合物分子間相互作用,產(chǎn)生絮凝現(xiàn)象,從而阻塞樹脂孔洞,不利于樹脂對酚類化合物的吸附,因此,紫皮大蒜多酚濃度選擇2.5 mg/mL為宜。

圖7 大蒜多酚濃度對純化紫皮大蒜多酚的影響Fig.7 Effect of garlic polyphenol concentration on the purification of purple-skin garlic polyphenols

3.3.2.2 乙醇體積分數(shù)對紫皮大蒜多酚純化的影響

由圖8可知,隨著乙醇體積分數(shù)的增加,解吸量呈先增加后減少的趨勢。當(dāng)乙醇體積分數(shù)為60%時,解吸量最大,并且60%乙醇的極性最接近紫皮大蒜多酚。因此,解吸液選擇60%的乙醇為宜。

圖8 解吸液濃度對純化紫皮大蒜多酚的影響Fig.8 Effect of desorption solution concentration on the purification of purple-skin garlic polyphenols

3.3.2.3 解吸液pH對紫皮大蒜多酚純化的影響

由圖9可知,當(dāng)解吸液pH為1～4時,紫皮大蒜多酚含量差別不大,而當(dāng)pH為5左右時,紫皮大蒜多酚濃度明顯上升。結(jié)果表明酸性環(huán)境對解吸是有利的,因為60%乙醇體積分數(shù)本身的pH值約為5,因此無需調(diào)節(jié)pH值。

圖9 解吸液pH對純化紫皮大蒜多酚的影響Fig.9 Effect of pH of desorption solution on the purification of purple-skin garlic polyphenols

3.4 紫皮大蒜多酚降血糖活性研究

3.4.1 紫皮大蒜多酚對α-淀粉酶活性的抑制作用

由圖10和圖11可知,隨著紫皮大蒜多酚濃度和阿卡波糖濃度的增加,它們對α-淀粉酶的抑制率也逐漸增大,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。計算得出紫皮大蒜多酚和阿卡波糖的IC50值分別為5.076 mg/mL和7.613 mg/mL。阿卡波糖是目前控制2型糖尿病的主要藥物,有腹脹、腸道脹氣、腹泄等副作用,還可能伴有紅斑、皮疹等。這種副作用是由于過度抑制胰腺中的α-淀粉酶,導(dǎo)致未消化的碳水化合物在結(jié)腸中被不良的細菌發(fā)酵。相比之下,紫皮大蒜多酚對α-淀粉酶的IC50值比阿卡波糖的低,說明紫皮大蒜多酚比阿卡波糖抑制α-淀粉酶的活性更強,如果代替阿卡波糖用于治療2型糖尿病,因為過度抑制α-淀粉酶消化而引起的副作用將可以減少。

圖10 紫皮大蒜多酚對α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.10 The inhibitory effect of purple-skin garlic polyphenols on α-amylase activity

圖11 阿卡波糖對α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.11 The inhibitory effect of acarbose on α-amylase activity

3.4.2 紫皮大蒜多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

由圖12和圖13可知,隨著紫皮大蒜多酚濃度和阿卡波糖濃度的增加,它們對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用逐漸增強。試驗中,PNPG底物在α-葡萄糖苷酶的作用下釋放出對硝基苯,對硝基苯在405 nm處有最大吸收峰,通過測定對硝基苯的含量變化即可確定抑制劑對酶的抑制能力。計算得出紫皮大蒜多酚和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度IC50值分別為5.501 mg/mL和8.068 mg/mL,表明紫皮大蒜多酚對α-葡萄糖苷酶有抑制作用。

圖12 紫皮大蒜多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.12 The inhibitory effect of purple-skin garlic polyphenols on α-glucosidase activity

圖13 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.13 The inhibitory effect of acarbose on α-glucosidase activity

4 結(jié)論

紫皮大蒜多酚最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶5、提取時間40 min、提取溫度30 ℃,此時紫皮大蒜多酚提取量為2.92 mg/g。使用XDA-7大孔樹脂進行紫皮大蒜多酚純化試驗,得到最佳純化條件是吸附時間2 h,紫皮大蒜多酚濃度2.5 mg/mL;解吸時間1 h,解吸溶液為60%乙醇溶液,溶液的pH為5.0。最后通過驗證,純化后的紫皮大蒜多酚含量為5.32 mg/g,多酚含量提高了1.82倍。降血糖活性研究結(jié)果顯示,紫皮大蒜多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50值分別為5.076 mg/mL和5.501 mg/mL,紫皮大蒜多酚可以通過抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性從而達到降血糖的作用。