鮰魚蛋白ACE抑制肽的酶法制備及分離純化

李佳伶,關詩琦,蔣思雨,蔡寅川,郝剛*

(1.西南民族大學 食品科學與技術學院,成都 610041; 2.四川阿壩州工業經濟研究所,四川 汶川 623000)

高血壓是引發心血管疾病的重要危險因素,嚴重威脅著人類的健康。血管緊張素轉化酶抑制劑(angiotensin I-converting enzyme inhibitor,ACEI)作為有效治療高血壓的藥物被廣泛用于臨床治療。化學合成類抑制劑通常藥效短,停藥后易反彈,長期服用還具有一定的毒副作用[1-2]。食源性ACE抑制肽由于安全性高、副作用小、易吸收,逐漸成為國內外研究的熱點。許多研究表明魚源蛋白是很好的ACE抑制肽來源。目前已通過酶解方法生產出多種ACE抑制肽,如鲅魚源ACE抑制肽[3]、鰱魚源ACE抑制肽[4]、鱈魚源ACE抑制肽[5]、沙丁魚ACE抑制肽等[6]。斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)具有適養范圍廣、生長速度快、體積大、肉質優良等特點[7]。中國鮰魚產量占世界產量的比例基本穩定在65%左右[8]。隨著市場需求的提高,鮰魚養殖業的規模逐漸擴大,我國鮰魚產業面臨著供大于求、品種淘汰等諸多問題[9]。因此,大力開發轉化鮰魚加工產品、促進國內市場發展是改變現狀的不二選擇。

在酶解魚類蛋白生產ACE抑制肽過程中,為了維持pH值恒定需不斷加入堿液,導致酶解產物鹽分過高,用大孔樹脂脫鹽具有吸附、解吸迅速、回收率高、再生容易等優點。許多研究表明ACE抑制肽呈現分子量小的特點[10],因此可采用超濾和分子排阻色譜根據分子量大小對ACE抑制肽進行分離純化。本試驗以脫脂后的鮰魚肉為原料,采用分步酶解法制備ACE抑制肽[11-12],對制備工藝進行優化,并對酶解產物進行分子量分布分析,采用超濾離心、大孔吸附樹脂和葡聚糖凝膠G-15對酶解產物進行分離純化,獲得活性更高的ACE抑制肽,為拓寬國內市場,開發來源廣泛、安全性高的鮰魚加工產品提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

斑點叉尾鮰魚:農貿市場;胰蛋白酶(250 U/g)、胃蛋白酶(3 000 U/mg)和堿性蛋白酶(200 000 U/g):北京鴻潤寶順科技有限公司;血管緊張素轉化酶(ACE)和馬脲酰組氨酰亮氨酸(HHL):美國Sigma公司;馬尿酸(HA)、羅恩試劑、2,4,6-三硝基苯磺酸:北京伊諾凱科技有限公司;DA201-C大孔樹脂和葡聚糖凝膠Sephadex G-15:北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為國產分析純與色譜純。

Centrifuge 5804R高速離心機 德國Eppendorf(艾本德)公司;真空冷凍干燥機 德國Christ公司;UV1810S紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;1260高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;3 000 Da超濾離心管 Millipore公司;玻璃層析柱(1.6 cm×50 cm)、恒流泵、自動部分收集器、紫外檢測器和電腦采集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

采用離心法脫脂[13],將魚肉清洗后去皮,用蒸餾水漂洗20 min后,以4 000 r/min離心10 min,得到脫脂后的魚肉,分裝,于-20 ℃備用。

1.2.2 雙酶分步酶解鮰魚蛋白的用酶篩選

向預處理的魚肉中加入蒸餾水,勻漿后調節第一種酶的最適pH值、溫度、底物濃度及酶活/底物量,加入酶攪拌均勻,置于控溫磁力攪拌器酶解,保持反應體系pH值、溫度恒定,達到反應時間后調節第二種酶的最適pH值、溫度,加入第二種酶繼續反應。反應結束后,將酶解液置于80 ℃水浴鍋中滅酶20 min,冷卻后,以10 000 r/min離心20 min,取上清液,測定水解度及ACE抑制活性,酶解條件及酶解組合順序見表1和表2。酶解液冷凍干燥后待用。

表1 不同蛋白酶酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

表2 分步酶解組合Table 2 Stepwise enzymatic hydrolysis combinations

1.2.3 鮰魚蛋白酶解條件的優化

以pH、溫度、酶解反應時間、底物濃度和酶活/底物量5個酶解條件為因素,以水解度為指標,考察各因素對酶解的影響。根據單因素試驗結果設計三因素三水平正交試驗,用統計分析軟件SPSS 18.0對正交試驗結果進行數據分析,確定最佳酶解工藝。

1.2.4 水解度(DH)的測定

采用TNBS法測定水解度,參考周慧江等[14]的方法略作修改。配制濃度為0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 mmol/L的亮氨酸標準液。吸取0.1 mL亮氨酸標準液,加入2 mL 50 ℃預熱的0.2 mol/L、pH為8.2的磷酸鹽緩沖液(PBS),加入1 mL 0.1%的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)快速振蕩,于50 ℃水浴鍋中避光反應60 min,再加入4 mL 0.1 mol/L的HCl快速終止反應,于室溫下靜置30 min后在340 nm波長下測定吸光值,以蒸餾水代替亮氨酸反應作參比,以亮氨酸濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標,繪制亮氨酸標準曲線。其標準曲線方程為y=0.124 3x,R2為0.999 2。

取酶解液1 mL(空白對照為純水),加入15 mL 1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液,得到待測液。吸取0.1 mL待測液,加入2 mL 50 ℃預熱的0.2 mol/L、pH 8.2的PBS,加入1 mL 0.1%的TNBS快速振蕩,于50 ℃水浴鍋中避光反應60 min,再加入4 mL 0.1 mol/L的HCl快速終止反應,室溫下靜置30 min后于340 nm下測定吸光值,測定供試液的吸光度為B。水解度DH(%)的計算公式如下:

(1)

式中:B為樣品在340 nm下的吸光度;M為酶解樣品的質量,g;Pro%為酶解樣品中的蛋白質含量,g/g;htot為蛋白質總肽鍵數。

1.2.5 ACE抑制活性的測定

采用HPLC法測定ACE抑制活性,參考王毅梅[15]的方法并略作修改。配制pH為8.3、濃度為0.1 mol/L的硼酸鹽緩沖液(含300 mmol/L NaCl),用此緩沖液配制0.1 U/mL的ACE溶液和6.5 mmol/L的HHL溶液。于1.5 mL離心管中加入10 μL 的抑制劑樣品(空白對照用硼酸鹽緩沖液代替抑制劑)與30 μL HHL混合均勻,放置于37 ℃水浴中預熱5 min,然后加入20 μL ACE溶液于37 ℃下恒溫反應1 h,最后在反應液中加入70 μL 1 mol/L的HCl終止反應,得到供試液,以硼酸鹽緩沖液為空白,供試液總體積130 μL。

色譜柱:ODS C18分析型色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);檢測波長:UV 228 nm;流速:0.8 mL/min;流動相A:水(含0.05%三氟乙酸);流動相B:乙腈(含0.05%三氟乙酸);進樣量:10 μL;柱溫:25 ℃;梯度洗脫條件:0～10 min,流動相B:10%～60%;10～12 min,流動相B:60%～10%。ACE抑制率的計算:

(2)

式中:A0為對照組中生成馬尿酸的峰面積;A1為加入抑制劑組中生成馬尿酸的峰面積。

1.2.6 分子量分布分析

參考吳悅[16]、姜惠敏[17]的方法并略作修改。吸取上清液2 mL,添加流動相稀釋至100 mL,經0.45 μm孔徑的微孔濾膜過篩后上樣分析。色譜條件:TSKgel 2000 SWXL色譜柱(300 mm×7.8 mm,10 μm);柱溫:25 ℃;流動相:乙腈∶水為45∶55(其中含TFA 0.1);紫外檢測波長:220 nm;流速:0.5 mL/min。通過Waters M32GPC軟件自動進行數據處理及計算。

選用細胞色素C (Mw=12 500 Da)、抑肽酶(Mw=6 500 Da)、桿菌酶(Mw=1 450 Da)、Gly-Gly-Tyr-Arg(Mw=451 Da)和Gly-Gly-Gly(Mw=189 Da)5種分子量不同的標準多肽樣品繪制分子質量(Mw)校正曲線,得到分子質量與保留時間的線性回歸方程為lgMw=5.441 8-0.054 1t。其中r=0.996 0,P<0.01,說明各標準品分子質量的對數值與其保留時間具有良好的線性關系,因此可以由保留時間準確定量酶解產物中多肽的分子質量。多肽的分子質量除以氨基酸平均分子質量(128 Da)即為多肽大小。

1.2.7 超濾分離

用超純水將3 kDa分子量的超濾離心管的濾膜完全淹沒,冰浴10 min,然后將水倒出,將10 mL適當濃度的酶解液緩慢移入超濾離心管中,4 ℃下4 000 r/min離心20 min。收集濾液,經冷凍干燥后測定ACE抑制活性。

1.2.8 DA201-C大孔樹脂吸附

1.2.8.1 DA201-C大孔樹脂靜態吸附試驗

向50 mL錐形瓶中加入預處理過的干樹脂5 g,乙醇浸泡溶脹后,加入蒸餾水洗凈乙醇,吸干水分。向錐形瓶中加入超濾后的酶解液20 mL,濃度為10 mg/mL,將錐形瓶放置于30 ℃恒溫搖床中振蕩,轉速110 r/min,每隔2 h在280 nm紫外波長下測定一次吸光度,反應總時長12 h,計算大孔樹脂對酶解液的吸附量及吸附率,繪制關系曲線。吸附量及吸附率計算公式如下:

(3)

(4)

式中:A0為原液蛋白濃度,mg/mL;A1為吸附液蛋白濃度,mg/mL;V為原液體積,mL;m為干樹脂質量,g。

1.2.8.2 DA201-C大孔樹脂靜態解吸試驗

稱取完全吸附飽和的樹脂5 g,加入70%的乙醇洗脫液15 mL,置于恒溫搖床中振蕩,每隔60 min測定一次洗脫液的吸光值,反應總時長6 h,計算大孔樹脂對酶解液的解吸率,繪制解吸率與時間的關系曲線。解吸率的計算公式如下:

(5)

式中:A0為原液蛋白濃度,mg/mL;A1為吸附液蛋白濃度,mg/mL;A2為解吸液蛋白濃度,mg/mL;V0為原液體積,mL;V1為解吸液體積,mL。

1.2.8.3 DA201-C大孔樹脂動態吸附-解吸試驗

配制適當濃度的ACE抑制肽溶液,以2 mL/min的流速上樣大孔樹脂層析柱,上樣完成后用75%的乙醇溶液流經層析柱進行洗脫,每5 min收集一管洗脫液,A280 nm≤0.05時停止洗脫[18]。洗脫液冷凍干燥后測定ACE抑制率。

1.2.9 葡聚糖凝膠G-15柱層析

經大孔樹脂純化后的ACE抑制肽用凝膠柱層析進一步分離純化。色譜條件:凝膠柱:1.6 cm×50 cm;上樣濃度:10 mg/mL;上樣量:1 mL;洗脫液:超純水;流脫流速:1 mL/min。按峰收集各組分,各組分冷凍干燥后測定ACE抑制率。

2 結果與分析

2.1 最佳雙酶酶解組合的確定

由表3可知,3種蛋白酶的酶解產物對ACE均有一定的抑制作用,酶的種類對水解度及ACE抑制率的影響較大,水解度由大到小排序為3>1>2,ACE抑制率與水解度呈正相關關系,由水解度及ACE抑制率結果選擇3號酶解組合,即選用胰蛋白酶為第一步酶解用酶,酶解1 h;選用堿性蛋白酶為第二步酶解用酶,酶解4 h,此條件下測定酶解產物的水解度為5.7%,ACE抑制率為16.3%。試驗結果也表明只使用堿性蛋白酶(組1)也能獲得接近雙酶(組2)的酶解效果,說明在對鮰魚蛋白酶解中起主要作用的是堿性蛋白酶,因此接下來主要對堿性蛋白酶的水解條件進行優化。

表3 雙酶分步酶解試驗結果Table 3 Stepwise enzymatic hydrolysis test results of double enzymes

2.2 酶解條件的優化

根據堿性蛋白酶酶解的單因素試驗結果,選擇溫度、pH、酶活/底物量3個反應條件作為試驗因素,以水解度為指標,設計三因素三水平正交試驗,見表4。正交試驗結果、極差分析結果見表5,方差分析結果見表6。

表4 酶解反應的正交試驗因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal test of enzymatic hydrolysis reaction

表5 堿性蛋白酶正交試驗 L9(33)結果表Table 5 Results of orthogonal test L9(33) of alkaline protease

表6 堿性蛋白酶正交試驗L9(33)方差分析表Table 6 Analysis of variance of orthogonal test L9 (33) of alkaline protease

極差分析和方差分析結果表明,影響堿性蛋白酶酶解反應的3個因素中,pH對反應的影響最顯著,溫度次之,酶活/底物量對反應的影響不是很顯著。以水解度為指標,由K值大小可以判斷出3個因素的最優水平,得出蛋白酶酶法制備的最佳酶解工藝為A2B2C2,即水解溫度50 ℃、pH 9.0、酶活/底物量6 U/mg。對該最佳酶解工藝進行驗證,結果表明,鮰魚蛋白經雙酶分步酶解,即選用胰蛋白酶為第一步酶解用酶,酶解1 h;選用堿性蛋白酶為第二步酶解用酶,酶解4 h,此條件下酶解產物的水解度為12.63%,ACE抑制率為18.7%。

2.3 分子量分布分析

鮰魚蛋白酶解液分子量分布HPLC圖見圖1。

圖1 鮰魚蛋白酶解液分子量分布HPLC圖Fig.1 HPLC diagram of molecular weight distribution of longsnout catfish protein enzymatic hydrolysate 注:圖中數值為 Mp值(峰位分子量)。

相比于游離氨基酸,小分子肽被人體吸收具有速度快、消耗能量低、轉運效率高、載體不易飽和等優勢[19]。本試驗采用雙酶分步酶解能使鮰魚蛋白酶解得更充分,從而得到小分子肽。采用HPLC法對最優酶解條件下制備的酶解產物進行分子量分布分析,由表7可知,酶解產物中分子量低于1 000 Da的組分占總體的99.6%,主要分布在500 Da以下,即4肽以下的肽占多肽總量的98.23%。研究發現海洋源ACE抑制肽中,分子量最小的二肽(Gly-Gly)分子量為132 Da,分子量最大的三肽(Trp-Trp-Trp)分子量為576 Da[20]。本試驗所得的酶解產物分子量處于此范圍內,由此表明,酶解產物主要為二肽和三肽,可被人體不經消化直接吸收[21]。

表7 鮰魚蛋白酶解液分子量分布分析Table 7 Analysis of molecular weight distribution of longsnout catfish protein enzymatic hydrolysate

2.4 超濾分離

超濾技術是一種利用膜對溶質按分子量大小進行分離的技術[22]。用3 kDa的超濾離心管來篩分溶液中的多肽物質,得到經初步分離的鮰魚肽組分。由圖2中(a)、(b)色譜圖可以計算出超濾后的ACE抑制率為35.4%,高于原酶解液的16.7%。

(a)未加入抑制劑

(b)加入抑制劑圖2 超濾離心組分ACE抑制活性HPLC圖Fig.2 HPLC diagrams of ACE inhibitory activity of ultrafiltration centrifugal components

2.5 DA201-C大孔樹脂吸附

2.5.1 DA201-C大孔樹脂的靜態吸附曲線

大孔吸附樹脂是一類新型的高分子吸附劑,其具有良好的再生能力和機械強度[23],本試驗選用DA201-C大孔樹脂對超濾離心后的組分進一步分離純化。由圖3可知,前4 h內大孔樹脂對酶解液的吸附量及吸附速率與時間呈正相關,但隨著時間的增加,吸附量及吸附率不再提高。這是由于在大孔樹脂吸附過程中,被吸附物質具有疏水性基團,通過疏水相互作用與樹脂的疏水部分結合,由于隨時間延長樹脂表面的結合位點逐漸減少,樹脂會出現一種吸附飽和的現象。大孔吸附樹脂已經趨于飽和,吸附趨于平衡狀態,大孔樹脂對多肽的吸附屬于快速平衡型[24],12 h時吸附率為54.6%,吸附量為44.6 mg/g。

(a)靜態吸附時間-吸附量關系曲線

(b)靜態吸附時間-吸附率關系曲線圖3 DA201-C大孔樹脂靜態吸附曲線Fig.3 Static adsorption curves of DA201-C macroporous resin

2.5.2 DA201-C大孔樹脂的靜態解吸曲線

本試驗采用體積分數70%的乙醇作為洗脫劑。DA201-C大孔樹脂靜態解吸曲線見圖4,在2 h內大部分多肽可被乙醇洗脫下來,此時解吸率為62.1%,2 h后解吸曲線趨于平緩。由DA201-C大孔樹脂對鮰魚ACE抑制肽解吸達到平衡所需的時間較短可以判斷,解吸性能良好,屬于快速平衡型。

圖4 DA201-C大孔樹脂靜態解吸曲線Fig.4 Static desorption curve of DA201-C macroporous resin

2.5.3 DA201-C大孔樹脂對酶解液的動態吸附-解吸試驗

DA201-C大孔樹脂吸附層析圖見圖5。經吸附得到單一組分,該組分ACE抑制活性HPLC圖見圖6。

圖5 大孔吸附樹脂層析圖Fig.5 Chromatogram of macroporous adsorption resin

(a)未加入抑制劑

(b)加入抑制劑圖6 大孔樹脂吸附組分ACE抑制活性色譜圖Fig.6 Chromatograms of ACE inhibitory activity of the adsorption components of macroporous resin

由圖6可知,經大孔樹脂純化后的組分ACE抑制率可達到56.6%,高于超濾離心組分21.2%,說明大孔樹脂吸附可有效去除組分中的無機鹽等雜質,進一步提高了組分的ACE抑制活性。

2.6 葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析

組分經大孔樹脂吸附后采用Sephadex G-15凝膠柱層析,超純水洗脫進一步分離純化。根據采集圖譜,按峰收集各組分,測定各組分ACE抑制活性。Sephadex G-15層析圖譜見圖7。

圖7 Sephadex G-15層析圖譜Fig.7 Sephadex G-15 chromatogram

由圖7可知,Sephadex G-15層析分離酶解物,分離出3個組分,分別標記為G1、G2、G3,凝膠層析分離是按照組分分子量大小進行分離的,分子量較小的后被洗脫出來,因此,3個組分分子量大小為G2>G1>G3。3個組分經上樣分析,計算出G1組分ACE抑制率為60.3%,G2組分ACE抑制率為66.9%,G3組分ACE抑制率為57.7%,G2組分ACE抑制率最大,高出大孔樹脂純化組分10.3%。為進一步提高酶解液純度及ACE抑制活性,在后期研究中可以將活性最強的G2組分用來進一步分離純化。

3 結論

本文以脫脂鮰魚肉為原料,水解度和ACE抑制活性為考察指標,采用胰蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶分步酶解的方法對鮰魚肉進行酶解,最佳酶解工藝:調節pH 為8,溫度37 ℃,底物濃度0.17 g/mL,加入胰蛋白酶,酶活/底物量為6 U/mg,水解1 h,再調節pH為 9,溫度55 ℃,加入堿性蛋白酶,酶活/底物量為6 U/mg,水解4 h,此時水解度為12.63%,酶解產物的ACE抑制率為18.7%。分子量分布分析發現酶解產物分子量主要分布在500 Da以下,即4肽以下的肽占多肽總量的98.23%。

經分子量為3 kDa的超濾離心管分離后的組分ACE抑制活性為35.4%。用DA201-C大孔吸附樹脂對超濾組分進一步脫鹽,靜態吸附結果表明,吸附約在4 h內達到飽和,12 h時吸附率為54.6%,吸附量為44.6 mg/g;靜態解吸結果表明,大孔樹脂約在2 h內解吸完全,解吸率為62.1%,DA201-C大孔樹脂展現出良好的吸附和解吸性能。大孔樹脂脫鹽后的組分ACE抑制率可達56.6%,是超濾離心組分的1.6倍。采用Sephadex G-15凝膠柱層析進一步分離純化,得到3個組分G1、G2、G3,其中G2組分的抑制活性最高,為66.9%,是大孔樹脂分離組分的1.2倍。經過分離純化后的ACE抑制肽活性相比原酶解液提高了3.6倍。