不同發酵階段藍莓產品的功能成分及抗氧化活性

武紅,黃瓊,李登明

(山西工商學院,太原 030006)

藍莓,又稱甸果,屬于杜鵑花科[1],廣泛分布于世界各地。藍莓果實中VC含量是蘋果的幾十倍,因其含有糖類、有機酸、黃酮、氨基酸、花青素等生物活性成分,表現出顯著的抗氧化活性[2—3],故有“漿果之王”的美譽。藍莓成熟采摘期多集中在夏季,高溫下長時間放置會引起果實腐爛變質。因此,對藍莓進行深加工,可以延長藍莓產品的生產和食用周期。

果醋是用生果通過酒精發酵或果酒作為原料,在醋酸桿菌的振蕩培養作用下發酵制成的醋類產品,具有較好的抗氧化活性[4—7]。果酒是以新鮮的藍莓果實為原料,通過酒精發酵而制得的,具有降血壓和促進細胞增殖等作用[8—9]。

本文通過研究藍莓果汁、果酒、果醋的總糖、總酸、總酚、維生素C、總黃酮等功能成分和其對DPPH、ABTS+、羥自由基清除能力等抗氧化能力的變化規律,對比分析藍莓不同產品的功能成分及抗氧化活性,為藍莓果實的深加工提供了參考。

1 材料和方法

1.1 材料

藍莓:山西省太原市小店區沃爾瑪超市;酵母菌:安琪酵母股份有限公司;醋酸菌:山東和眾康源生物科技有限公司。

1.2 試劑

福林酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁:廈門安永博科技有限公司;蘆丁、DPPH、ABTS、過硫酸鉀:安徽酷爾生物工程有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過硫酸鉀、水楊酸、鐵氰化鉀:天津市北晨區方正試劑廠。

1.3 主要儀器與設備

L3-C1榨汁機、TGL-16GB離心機、SRJ-150恒溫培養箱 常州市金壇大地自動化儀器廠;752型紫外分光光度計、XMTD-8222恒溫水浴鍋 上海精密科學儀器有限公司;LDZX-50L高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械有限公司;VD-650超凈工作臺 上海鼎科科學儀器有限公司;PHS-3C型實驗室pH計 上海佑科儀器儀表有限公司;WZ-108折光儀 北京萬成北增精密儀器有限公司。

1.4 藍莓原汁的制備

選取顆粒飽滿和表面帶有白霜的藍莓,用清水浸泡20 min,加入5倍無菌常溫蒸餾水,在無菌打漿機內打漿,果漿經過3層無菌紗布過濾,濾液放入干凈容器中備用,剩余果漿不經過過濾,用于進一步的發酵[10]。

1.5 藍莓果酒的制備

在藍莓原汁中添加VC(80 mg/dL)、果膠酶(300 mg/dL)、偏重亞硫酸鉀(400 mg/dL);調整果汁的糖度為22 °Bx,pH值為3.5;調整完成后,在果汁中加入0.05%的釀酒酵母(酵母粉用10倍以上35 ℃的2%蔗糖水活化30 min),置于恒溫培養箱中,26 ℃下進行酒精發酵5 d,發酵完成后經過濾、殺菌得到酒精度為10%的藍莓果酒[11—13]。

1.6 藍莓果醋的制備

將藍莓果酒的pH值調整為4.0,酒精度調整為7.0%,接種15%的醋酸菌活化液后在30 ℃、202 r/min的搖床培養箱中培養10 d,最終得到醋酸含量為1.575 g/dL的藍莓果醋[14]。

1.7 理化指標的測定

總酸的測定參照GB 12456—2021中的酚酞指示劑法;總糖的測定參照GB/T 5009.7—2003中的直接滴定法。

1.8 功能成分的測定

1.8.1 Vc含量

參照GB 5009.86—2016進行測定。量取適量的樣品溶液,置于100 mL容量瓶中,用偏磷酸醋酸溶液定容至100 mL,充分混勻,用高嶺土脫色,靜置過濾后備用。取4 mL樣品濾液,用標準抗壞血酸溶液標定過的2,6-二氯靛酚溶液進行滴定操作,滴定終點為溶液為微粉色且30 s不發生顏色變化。與此同時用蒸餾水做空白試驗。

1.8.2 總酚的測定

采用福林酚法[15]。取樣品稀釋液1 mL,加6 mL去離子水和1 mL 1.0 mol/L福林酚試劑,搖勻,靜置6 min,再加入10.6%的碳酸鈉溶液4 mL,搖勻,室溫靜置60 min,在760 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸含量為橫坐標,相應的吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線,見圖1。建立擬合回歸方程:y=0.336 1x+0.023 3,相關系數R2=0.996 6。根據標準曲線方程計算樣品溶液中總酚的含量。

圖1 總酚標準曲線Fig.1 Standard curve of total phenols

1.8.3 總黃酮的測定

采用硝酸鋁絡合法[16],參照GB/T 20574—2006進行測定。吸取5 mL樣品溶液,加入乙醇至總體積為15 mL,加入100 g/L硝酸鋁和9.8 g/L醋酸鉀溶液各1 mL,搖勻,靜置1 h,于415 nm處測定吸光度。總黃酮含量以蘆丁含量計,繪制標準曲線,見圖2。擬合出回歸方程:y=4.896 4x-0.000 8,相關系數R2=0.998 8。依據標準曲線計算總黃酮的含量。

圖2 總黃酮標準曲線Fig.2 Standard curve of total flavonoids

1.9 抗氧化活性的測定

1.9.1 DPPH自由基清除能力

取3支試管分別編號1,2,3,在1號試管中加入1 mL樣品溶液和1 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液;在2號試管中加入1 mL無水乙醇和1 mL樣品溶液;在3號試管中加入1 mL無水乙醇和DPPH溶液;搖勻,于黑暗處反應30 min,取上清液,于517 nm處測定其吸光度[17]。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中:A1為1號試管的吸光度;A2為2號試管的吸光度;A3為3號試管的吸光度。

1.9.2 ABTS+自由基清除能力

取3支試管分別編號1,2,3,在1號試管中加入0.2 mL樣品溶液和0.8 mL ABTS+溶液;在2號試管中加入0.2 mL樣品溶液和0.8 mL無水乙醇;在3號試管中加入0.2 mL無水乙醇和0.8 mL ABTS+溶液;搖勻,靜置6 min,在734 nm處測定其吸光度[7]。

ABTS+自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中:A1為1號試管的吸光度;A2為2號試管的吸光度;A3為3號試管的吸光度。

1.9.3 羥自由基清除能力

取3支試管分別編號1,2,3,在1號試管中加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、1 mL樣品溶液、1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液和1 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液;在2號試管中加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、1 mL樣品溶液、1 mL蒸餾水和1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液;在3號試管中加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、1 mL蒸餾水、1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液和1 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液;混勻后取上清液并在510 nm處測定其吸光度。

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中:A1為1號試管的吸光度;A2為2號試管的吸光度;A3為3號試管的吸光度。

1.10 數據處理

所有項目重復測定3次取平均值,用Origin 2021進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同藍莓產品總糖和總酸含量變化

由圖3可知,藍莓果汁的總糖含量最高,在果酒和果醋階段,總糖含量降低,可能是由于果酒發酵過程中糖分被酵母轉化為酒精,果醋的發酵也需要利用部分糖轉化為醋酸,從而導致總糖含量減少。從果汁到果醋階段,產品的總酸含量逐漸上升,這可能是由于酵母在酒精發酵過程中產生有機酸,醋酸菌在醋酸發酵過程中將乙醇氧化為乙酸,有機酸和乙酸二者的累積導致果醋的總酸含量最高。

圖3 不同藍莓產品總糖和總酸含量Fig.3 The content of total sugar and total acids of different blueberry products

2.2 不同產品功能成分的變化

由圖4可知,藍莓的3種產品中,總酚含量順序為果醋>果汁>果酒,果酒與果醋的差異性不顯著,VC含量順序為果汁>果酒>果醋,總黃酮含量順序為果醋>果酒>果汁。

圖4 藍莓果汁、果酒和果醋功能成分特征雷達圖Fig.4 Characteristic radar chart of functional components of blueberry juice, fruit wine and fruit vinegar

在酒精發酵階段,VC含量下降,這可能是發酵前的滅菌操作和發酵過程中酵母菌的生長消耗造成產品中VC的熱敏性損失;總黃酮含量升高,可能與藍莓果汁在發酵過程中緩慢水解溶出有關。在醋酸發酵階段,總黃酮和總酚含量呈現較快的上升趨勢,VC含量下降明顯,可能是醋酸發酵導致總黃酮和總酚溶出和積累,酒精發酵結束的殺菌操作和醋酸發酵消耗也會導致VC減少[18]。

2.3 不同產品抗氧化活性的變化

2.3.1 DPPH自由基清除能力變化

由圖5可知,3種產品的DPPH自由基清除率為果汁>果酒>果醋,清除率分別為87.57%、83.84%、79.81%。隨著酵母厭氧發酵和醋酸有氧發酵的不斷進行,從果汁到果醋階段,雖然產品對該自由基的清除能力逐漸減弱,但是清除率都維持在79%以上,這與發酵過程中抗氧化物質總黃酮和總酚的溶出有關,說明酒精發酵和醋酸發酵能保持藍莓產品較高的DPPH自由基清除率。

圖5 藍莓果汁、果酒和果醋DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging rates of blueberry juice, fruit wine and fruit vinegar

2.3.2 ABTS+自由基清除能力變化

由圖6可知,在果汁到果醋的整個發酵過程中,ABTS+自由基清除率呈逐漸上升趨勢。其中,果醋的清除率最高,為86.74%。這與總黃酮在發酵過程中的變化規律一致,ABTS+自由基的清除能力隨著總黃酮含量的增加而逐漸提高。

圖6 藍莓果汁、果酒和果醋ABTS+自由基清除率Fig.6 ABTS+ radical scavenging rates of blueberry juice, fruit wine and fruit vinegar

2.3.3 羥自由基清除能力變化

由圖7可知,羥自由基清除能力順序為果醋>果酒>果汁,分別為73.51%、63.08%、44.45%。同樣與總黃酮在發酵過程中的變化規律一致,總黃酮含量的增加可能提高了羥自由基的清除能力。

圖7 藍莓果汁、果酒和果醋羥自由基清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging rates of blueberry juice, fruit wine and fruit vinegar

2.3.4 不同產品抗氧化活性的差異顯著性分析

由表1可知,在藍莓的不同發酵階段,其產品的抗氧化活性呈現不同的變化規律。ABTS+和羥自由基清除率在整個發酵過程中呈現升高的趨勢,其中羥自由基清除率在果酒發酵階段上升較明顯;而DPPH自由基清除率在酒精和醋酸發酵階段均略有下降[19],但清除率仍然維持在較高水平,這與藍莓果實自身具有較高的DPPH自由基清除能力有關。藍莓3種產品的抗氧化活性變化差異極顯著(P<0.01),說明酒精發酵和醋酸發酵賦予了藍莓較高的ABTS+和羥自由基清除能力。

表1 不同藍莓產品抗氧化活性Table 1 Antioxidant activities of different blueberry products

2.4 不同產品功能成分與抗氧化活性的相關性分析

基于“2.2”和“2.3”的試驗結果,通過皮爾遜相關性分析,探究不同產品功能成分與抗氧化活性的相關性變化,見表2。

表2 不同藍莓產品抗氧化活性與功能成分的相關性Table 2 Correlation between antioxidant activities and functional components of different blueberry products

DPPH自由基清除率與Vc含量之間存在正相關關系,由表2可知,Vc含量和DPPH自由基清除率變化規律一致,說明VC含量對DPPH自由基清除率有重要影響;DPPH自由基清除率與總酚含量、總黃酮含量之間存在負相關關系,DPPH自由基清除率仍然維持在80%左右,酒精發酵和醋酸發酵對DPPH自由基清除率的影響不顯著。ABTS+自由基清除率與總黃酮含量變化一致,為顯著正相關關系(P<0.05),羥自由基清除率與總黃酮含量呈極顯著正相關關系(P<0.01),分析原因可能是總黃酮主要參與了ABTS+和羥自由基的清除,說明醋酸發酵賦予了藍莓產品豐富的品質,提高了產品的抗氧化能力。

3 結論

本試驗通過測定3種藍莓產品的功能性成分和抗氧化活性,并對這些指標進行差異顯著性分析,結果表明,3種藍莓產品的功能性成分差異明顯,果汁的VC含量較高,果醋的總酚和總黃酮含量較高,這可能和不同的微生物發酵作用有關。在抗氧化方面,果醋整體抗氧化能力較高,可能是果醋中總酚和總黃酮含量較高所致。

本研究對藍莓果汁、果酒和果醋產品進行分析,對比得出3種產品之間的差異性,為藍莓產品成分分析提供了參考,也為發展藍莓的深加工產業提供了理論依據。