響應面法優化草魚魚丸復合抗凍劑的研究

韓冰,姜曉涵,徐英楠,韓雪,遇世友,夏昆源,張根生

(哈爾濱商業大學 食品工程學院,哈爾濱 150028)

草魚是我國重要的養殖淡水魚,年產量居我國“四大家魚”之首,2021年其總產量高達575.51萬噸,占淡水魚養殖產量的21.80%[1]。我國淡水魚消費多采用“鮮活銷售”和“家庭烹飪”相結合的方式,淡水魚的深加工比例較低,而魚糜制品具有高蛋白質、低脂肪和低膽固醇等優點[2],所以魚糜制品的開發成為近年來研究的熱點[3],而魚丸、魚豆腐、魚糕和魚腸等魚糜制品已成為當前深受歡迎的速凍調理食品。速凍魚丸在生產、運輸和儲存過程中由于溫度波動的影響,冰晶逐漸增多,品質快速下降[4-5],因此提升魚丸凍融穩定性受到廣泛關注。

目前主要從兩方面進行速凍食品凍融穩定性的提高,一方面是控制冰晶的形成,另一方面是抑制肌原纖維蛋白氧化變性。其中,抑制肌原纖維蛋白氧化變性主要利用抗凍劑來完成[6]。傳統的商業抗凍劑常采用4%的蔗糖與4%的山梨糖醇混合后使用,抗凍效果較好,但蔗糖與目前人們追求的“低甜和低熱”的消費趨勢不符,不適于糖尿病患者食用;多聚磷酸鹽的攝入存在加重高血壓或慢性腎病的風險[7-8]。因此,對抗凍效果好且符合消費趨勢的抗凍劑的研究尤為重要。

實驗表明,抗凍劑對反復凍融期間的魚丸的品質具有顯著影響[9]。鑒于此,本研究首先以草魚魚糜為原料,添加不同含量的海藻糖、VE和蔗糖脂肪酸酯,研究其對魚丸凝膠特性和感官評價的影響,反映抗凍劑對魚丸品質的影響情況,最終通過響應面實驗確定最佳配方。本研究為魚丸復合抗凍劑的開發與發展提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚:哈爾濱前進大市場;食鹽、味精、白砂糖、蒜粉、白胡椒粉、雞蛋、白酒、馬鈴薯淀粉、大豆分離蛋白、大豆油、海藻糖、VE、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇等:市售;硫代巴比妥酸、氧化鎂:天津市富宇精細化工有限公司;丙二醛、1,1,3,3-四乙氧基丙烷:德州潤昕實驗儀器有限公司;鹽酸、三氯乙酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙二胺四乙酸:蘇州瑞測檢測技術服務有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-4型數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司;LA8080全自動凱氏定氮儀 日本株式會社日立高新技術科學那柯事業所;BR4I離心機 上海安亭科學儀器廠;722型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;ALC-2100.2型電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司;CS-800型色差儀 杭州彩譜科技有限公司;C21-SK805型電磁爐 美的生活電器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 草魚魚糜的制備

原料魚→前處理→采肉→漂洗→精濾→脫水→擂潰→成型→凝膠→熟化→冷卻→成品。

1.3.2 持水率的測定

采用Campbell等[10]的方法測定魚丸凝膠的持水率并稍作修改。準確稱取質量為m(3.00 g)的魚丸,平攤在兩層濾紙上包裹好,置于50 mL離心管中,在10 000 r/min下離心15 min,離心后取出稱重,質量記為m1,每組樣品測定3次,取平均值,通過下式計算持水率:

(1)

式中:m為離心前樣品質量(g);m1為離心后樣品質量(g)。

1.3.3 TBARS值的測定

參照GB 5009.181-2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》中的分光光度法并稍作修改。首先稱取魚丸5.00 g,加入50 mL三氯乙酸混合液,在50 ℃下勻漿30 min后冷卻至室溫,過濾棄沉淀,然后在上清液中加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液,混勻,90 ℃反應30 min后冷卻,最后在532 nm處測定樣品溶液的吸光度值,丙二醛含量由1,1,3,3-四乙氧基丙烷標準曲線確定,吸光度值(y)對TBARS值(x)的標準曲線為y=0.802 9x+0.053 5,TBARS值的計算公式為:

(2)

1.3.4 揮發性鹽基氮含量的測定

參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》中的凱氏定氮法。

1.3.5 低場核磁共振的測定

參考Jiao等[11]的方法并稍加修改。首先將魚丸在室溫下恒溫30 min,然后切取約2 g樣品放入核磁管中,最后采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列進行自旋-自旋弛豫時間T2、T2峰比例的測定。

1.3.6 感官品質的評定

感官評價由受過專業培訓的感官評定小組(10人)根據表1對魚丸的感官品質進行綜合評定。將魚丸切成1 cm左右的薄片,通過品嘗來評價魚丸反復凍融后的風味、色澤、形態和質地,計算感官評價得分。

表1 感官評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria

1.3.7 單因素實驗設計

1.3.7.1 海藻糖添加量對魚丸品質的影響

以魚糜質量為基準,分別添加淀粉15%、蛋清10%、大豆油5%、白砂糖5%、白酒4%、蒜粉1%、味精0.3%、白胡椒粉0.2%、水12%、食鹽2.5%和大豆分離蛋白4%,考察海藻糖添加量(0%、2%、4%、6%、8%)對魚丸持水率、TBARS值、揮發性鹽基氮、水分遷移和感官評分的影響。

1.3.7.2 VE添加量對魚丸品質的影響

以魚糜質量為基準,分別添加淀粉15%、蛋清10%、大豆油5%、白砂糖5%、白酒4%、蒜粉1%、味精0.3%、白胡椒粉0.2%、水12%、食鹽2.5%和大豆分離蛋白4%,考察VE添加量(0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%)對魚丸持水率、TBARS值、揮發性鹽基氮、水分遷移和感官評分的影響。

1.3.7.3 蔗糖脂肪酸酯添加量對魚丸品質的影響

以魚糜質量為基準,分別添加淀粉15%、蛋清10%、大豆油5%、白砂糖5%、白酒4%、蒜粉1%、味精0.3%、白胡椒粉0.2%、水12%、食鹽2.5%和大豆分離蛋白4%,考察蔗糖脂肪酸酯添加量(0%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%)對魚丸持水率、TBARS值、揮發性鹽基氮、水分遷移和感官評分的影響。

1.4 復合抗凍劑的響應面實驗設計

根據單因素實驗的結果,選取海藻糖添加量(A)、VE添加量(B)和蔗糖脂肪酸酯添加量(C)3個因素的3個水平,以持水率(Y1)和不易流動水占比(Y2)作為復合抗凍劑最優配方的響應值進一步設計響應面實驗,復合抗凍劑響應面實驗因素水平見表2。

表2 復合抗凍劑響應面實驗因素水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment of compound cryoprotectant

1.5 數據統計與分析

每組實驗重復3次,最后的結果用平均值±標準差表示,數據采用SPSS 24.0進行方差和顯著性分析,P<0.05為差異顯著;采用Origin 2021軟件進行繪圖,采用Design-Expert V8.0.6統計軟件進行實驗設計與數據分析。

2 結果與分析

在冷凍的條件下,細菌的氧化代謝及酶活性會受到一定程度的抑制[12]。但是隨著凍藏時間的延長,魚肉在內源酶和細菌代謝酶等物質的作用下,蛋白結構會發生變化,導致魚肉的持水率下降、品質變差和機械性損傷等問題[13-16]。因此,通過對魚丸進行持水率、TBARS值、TVB-N值、水分分布和感官評價的檢測來反映不同物質對凍融循環魚丸品質的影響。

2.1 海藻糖添加量對凍融循環魚丸品質及水分遷移的影響

2.1.1 海藻糖添加量對凍融循環魚丸品質的影響

海藻糖對細胞和生物體的活力具有保護作用,被稱為“生命之糖”[17]。近年來,海藻糖作為天然抗凍保護劑逐漸應用于冷凍食品品質改善的研究。海藻糖添加量對魚丸的持水率、TBARS值和揮發性鹽基氮的影響見圖1。

圖1 海藻糖添加量對魚丸持水率、TBARS值、揮發性鹽基氮的影響Fig.1 Effect of trehalose addition amount on the water holding rate, TBARS value and volatile basic nitrogen of fish balls注:不同字母表示差異顯著(P<0.05),下圖同。

由圖1可知,魚丸的持水率隨著凍融次數的增加呈現持續降低的趨勢,TBARS值和揮發性鹽基氮值則呈現持續升高的趨勢。反復凍融3次后,添加4%海藻糖魚丸的持水率為86.27%,明顯優于海藻糖添加量0%、2%、6%、8%的實驗組(P<0.05)。與此同時,TBARS值和揮發性鹽基氮值分別升至0.304 mg/kg和15.096 mg/100 g,明顯低于0%、2%、6%、8%海藻糖實驗組(P<0.05)。這可能是由于海藻糖的添加使魚丸組織的電解質含量降低,通過改變蛋白分子中的結合水狀態,抑制蛋白的變性,進而減少了冰晶的生成[18]。海藻糖添加量過高可能會促使魚丸的細胞膜及細胞器破裂,蛋白質劣變加速,血紅素鐵的釋放加快[19],從而持水率降低速率加快,脂肪氧化速度和微生物的生長速度加快,品質逐漸下降,這與余璐涵等[20]的研究結果一致。

海藻糖添加量對魚丸感官評分的影響見圖2。

圖2 海藻糖添加量對魚丸3次凍融后感官評分的影響Fig.2 Effect of trehalose addition amount on the sensory score of fish balls after repeated freeze-thaw for three times

由圖2可知,添加4%海藻糖的魚丸經過3次凍融后,品質明顯高于海藻糖添加量為0%、2%、6%、8%的實驗組,這可能是由于添加適量的海藻糖可以抑制冰晶的生成和脂肪氧化,提升了凍融后魚丸的感官品質。

2.1.2 海藻糖添加量對凍融循環魚丸水分遷移的影響

不易流動水與肉類持水率密切相關[21],是本實驗中最主要的研究對象,海藻糖添加量對魚丸水分遷移的影響見圖3。

圖3 海藻糖添加量對3次凍融魚丸水分遷移的影響Fig.3 Effect of trehalose addition amount on the water migration of fish balls after repeated freeze-thaw for three times

由圖3可知,添加不同含量海藻糖的魚丸中有4個峰,分別對應的橫向弛豫時間為T21、T22、T23和T24,合并為3種狀態的水,分別為結合水(0.1～10 ms)、不易流動水(10～100 ms)和自由水(100～1 000 ms)。PT21和PT22代表結合水,PT23代表不易流動水,PT24代表自由水。由圖3可知,反復凍融3次后,4%海藻糖魚丸組的PT23和PT24明顯優于其他4組。當海藻糖添加量為4%時,不易流動水含量較高,自由水含量較低,此時凝膠效果較好,增加了魚丸凍融的穩定性。這可能是因為海藻糖可以有效地保護蛋白質分子的天然結構,降低蛋白質的冷凍變性,增加耐凍性,抑制冰晶的形成,減少水分的流失[22],因此可以對魚糜樣品起到良好的保水作用。

2.2 VE添加量對凍融循環魚丸品質及水分遷移的影響

2.2.1 VE添加量對凍融循環魚丸品質的影響

VE添加量對魚丸持水率、TBARS值和揮發性鹽基氮的影響見圖4。

圖4 VE添加量對魚丸持水率、TBARS值和揮發性鹽基氮的影響Fig.4 Effect of VE addition amount on the water holding rate, TBARS value and volatile basic nitrogen of fish balls

由圖4可知,隨著凍融次數的增加,魚丸的持水率持續下降,TBARS值和揮發性鹽基氮值持續升高。反復凍融3次后,添加0.1% VE的魚丸持水率為83.20%,TBARS值和揮發性鹽基氮值分別升至0.303 mg/kg和12.588 mg/100 g,明顯優于添加0%、0.05%、0.15%、0.2% VE的實驗組(P<0.05)。這可能是因為VE對持水率的提升作用與其對細胞膜的修復作用有關,因此,當添加適量的VE時,反復凍融后魚丸的持水率降低速率減慢。同時,適量的VE對脂肪氧化和微生物的生長均有一定的抑制作用,隨著凍融次數的增加,抑制效果逐漸明顯。這可能是因為VE阻礙脂肪氧化發生鏈式反應[23]的同時也延緩了蛋白質的分解,從而抑制了TVB-N值的上升。因此通過本實驗可知,添加0.1% VE對抑制魚丸的脂肪氧化效果顯著,這與Tang等[24]的研究結果一致。

VE添加量對魚丸感官評分的影響見圖5。

圖5 VE添加量對魚丸感官評分的影響Fig.5 Effect of VE addition amount onthe sensory score of fish balls

由圖5可知,添加0.1% VE的魚丸經過3次凍融后,品質明顯高于VE添加量為0%、0.05%、0.15%、0.2%的實驗組,這可能是由于適量的VE會抑制脂肪氧化和微生物的生成,從而保證了魚丸的感官品質。

2.2.2 VE添加量對凍融循環魚丸水分遷移的影響

由圖6可知,VE添加量不同的魚丸中水分有4個峰,添加0.1% VE時不易流動水占比(PT23)高于其他4組,自由水占比(PT24)低于其他4組。由此結果可以看出,當VE添加量為0.1%時,不易流動水含量較高,自由水含量較低,凝膠效果較好,凍融后的魚丸更加穩定。這可能是因為魚丸中含有大量脂肪,VE作為抗氧化劑可以有效地抑制脂肪的氧化程度,抑制不易流動水和自由水的遷移。

圖6 VE添加量對凍融3次魚丸水分遷移的影響Fig.6 Effect of VE addition amount on the water migration of fish balls after repeated freeze-thaw for three times

2.3 蔗糖脂肪酸酯添加量對凍融循環魚丸品質及水分遷移的影響

2.3.1 蔗糖脂肪酸酯添加量對凍融循環魚丸品質的影響

蔗糖脂肪酸酯是一種乳化劑,魚丸中含有大量的脂肪、蛋白質和水分等物質,蔗糖脂肪酸酯可以很好地將互不相溶的成分相互混合[25],從而提高魚丸的穩定性。蔗糖脂肪酸酯添加量對魚丸持水率、TBARS值和揮發性鹽基氮的影響見圖7。

圖7 蔗糖脂肪酸酯添加量對魚丸持水率、TBARS值和揮發性鹽基氮的影響Fig.7 Effect of sucrose fatty acid ester addition amount on the water holding rate, TBARS value and volatile basic nitrogen of fish balls

由圖7可知,隨著凍融次數的增加,魚丸的持水率呈現持續降低的趨勢,TBARS值和揮發性鹽基氮值持續升高。反復凍融3次后,添加0.09%蔗糖脂肪酸酯的魚丸持水率為85.67%,TBARS值和揮發性鹽基氮值分別升至0.313 mg/kg和14.170 mg/100 g,明顯優于0%、0.06%、0.12%、0.15%蔗糖脂肪酸酯的實驗組(P<0.05)。一方面,隨著凍融次數的增加,肌原纖維蛋白結構遭到破壞,凝膠網絡劣化,導致魚丸的持水率持續下降[9]。另一方面,魚丸在凍藏過程中,脂肪氧化加速了肌原纖維蛋白的變性,從而導致魚丸的持水率下降[26]。而添加0.09%的蔗糖脂肪酸酯可以有效地延緩魚丸的水分流失,使魚丸中互不相溶的成分相互混合,形成乳化現象,致使魚丸的脂肪和蛋白質更加穩定,不易被氧化。同時,也有研究表明,蔗糖脂肪酸酯對微生物有一定的抑制作用,因此適量的蔗糖脂肪酸酯會抑制微生物的生成[27],從而使TVB-N值上升緩慢。

蔗糖脂肪酸酯添加量對魚丸感官評分的影響見圖8。

圖8 蔗糖脂肪酸酯添加量對魚丸感官評分的影響Fig.8 Effect of sucrose fatty acid ester addition amount on the sensory score of fish balls

由圖8可知,添加0.09%蔗糖脂肪酸酯的魚丸經過3次凍融后,感官品質明顯高于蔗糖脂肪酸酯添加量為0%、0.06%、0.12%、0.15%的實驗組。這可能是由于蔗糖脂肪酸酯起到了乳化作用,將互不相溶的成分相互混合,進而抑制脂肪氧化。

2.3.2 蔗糖脂肪酸酯添加量對凍融循環魚丸水分遷移的影響

蔗糖脂肪酸酯添加量對凍融3次魚丸水分遷移的影響見圖9。

圖9 蔗糖脂肪酸酯添加量對凍融3次魚丸水分遷移的影響Fig.9 Effect of sucrose fatty acid ester addition amount on the water migration of fish balls after repeated freeze-thaw for three times

由圖9可知,反復凍融3次后,添加0.09%蔗糖脂肪酸酯時魚丸的不易流動水占比(PT23)高于其他4組,自由水占比(PT24)低于其他4組。這說明3次凍融導致魚丸內部細小的冰晶重結晶,不易流動水逐漸向自由水轉化,水的流動性增強,較多的自由水擴散到凍藏環境中,從而導致持水率逐漸下降。由此結果可以看出,當蔗糖脂肪酸酯添加量為0.09%時,不易流動水含量較高,凝膠效果較好,魚丸凍融后更加穩定。

2.4 抗凍劑響應面實驗結果

在單因素實驗的基礎上,以海藻糖添加量(A)、VE添加量(B)和蔗糖脂肪酸酯添加量(C)為影響因子,以魚丸的持水率(Y1)和不易流動水占比(Y2)兩個指標作為響應值,進行響應面分析實驗,Box-Behnken 實驗設計見表3。

表3 Box-Behnken 實驗設計Table 3 Box-Behnken experiment design

通過Design Expert軟件對所得數據進行回歸分析,分別獲得了持水率(Y1)和不易流動水占比(Y2)與自變量海藻糖添加量(A)、VE添加量(B)和蔗糖脂肪酸酯添加量(C)的二次多項回歸方程:

Y1=87.128+0.182 5A+0.285B+0.16C-0.3AB-0.295AC-0.52BC-2.764A2-0.629B2-1.359C2。

Y2=88.574+0.706 25A-0.457 5B+0.213 75C-0.13AB-0.057 5AC-0.92BC-1.755 75A2-1.538 25B2-0.939 75C2。

進一步對該回歸模型進行方差分析,持水率的回歸模型及方差分析見表4,不易流動水占比的回歸模型及方差分析見表5。

表4 Y1的回歸模型及方差分析Table 4 Regression model and variance analysis of Y1

表5 Y2的回歸模型及方差分析Table 5 Regression model and variance analysis of Y2

由表4可知,Y1模型的P值<0.000 1,說明該模型達到極顯著水平,模型是穩定的。失擬項的F值為5.749,P=0.062 1>0.05,說明失擬項差異不顯著,能充分反映情況。確定系數R2=0.986,校正決定系數RAdj2=0.968,說明96.8%的響應值變化能用該模型來解釋,模型的擬合程度良好,實驗誤差小。FA=2.716、FB=6.626和FC=2.088,即各因素對持水率的影響程度大小順序為VE添加量>海藻糖添加量>蔗糖脂肪酸酯添加量。海藻糖添加量與VE添加量的交互作用顯著(P<0.05),VE添加量與蔗糖脂肪酸酯添加量的交互作用極顯著(P<0.01)。

由表5可知,Y2模型極顯著(P<0.01),失擬項不顯著(P>0.05),模型選擇正確。確定系數R2=0.970 0,校正決定系數RAdj2=0.931 3,說明響應值變化的93.13%能用該模型來解釋,模型擬合程度較好。各因素對不易流動水占比的影響程度大小順序為海藻糖添加量>VE添加量>蔗糖脂肪酸酯添加量,且VE添加量與蔗糖脂肪酸酯添加量之間具有極顯著的交互作用(P<0.01)。

2.5 響應面分析交互作用

海藻糖添加量、VE添加量、蔗糖脂肪酸酯添加量之間的交互作用對魚丸持水率和不易流動水占比的響應面曲線圖見圖10和圖11。

圖10 各因素交互作用對持水率的影響Fig.10 Effect of interaction of various factors on the water holding rate

圖11 各因素交互作用對不易流動水占比的影響Fig.11 Effect of interaction of various factors on the proportion of immobilized water

由圖10可知,響應曲面的坡度較陡,說明海藻糖添加量(A)與VE添加量(B)的交互作用、海藻糖添加量(A)與蔗糖脂肪酸酯添加量(C)的交互作用和VE添加量(B)與蔗糖脂肪酸酯添加量(C)的交互作用對持水率的影響較敏感。交互作用顯著性從大到小依次是BC>AB>AC。

由圖11可知,響應曲面的坡度較陡,說明海藻糖添加量(A)與VE添加量(B)的交互作用、海藻糖添加量(A)與蔗糖脂肪酸酯添加量(C)的交互作用和VE添加量(B)與蔗糖脂肪酸酯添加量(C)的交互作用對不易流動水占比的影響較敏感。交互作用顯著性從大到小依次是BC>AB>AC。

2.6 驗證實驗

對二次多項回歸模型進行最優求解,選擇海藻糖添加量3.01%、VE添加量0.1%、蔗糖脂肪酸酯添加量0.09%為最優方案。預測持水率為87.090 7%和不易流動水占比為88.680 4%。為檢驗實驗的可靠性,采用上述優化參數進行驗證實驗,實際實驗結果為平均持水率87.54%和平均不易流動水占比88.16%。持水率和不易流動水占比的驗證結果與理論值無顯著性差異(P>0.05)。因此,二者皆說明回歸模型準確,模型能夠較好地預測持水率和不易流動水占比的變化情況。

3 結論

根據單因素實驗和響應面優化的實驗結果,以凍融循環后魚丸的持水率、TBARS、TVB-N、水分遷移和感官評價作為指標,確定復合抗凍劑的最佳工藝為海藻糖添加量3.01%、VE添加量0.1%和蔗糖脂肪酸酯添加量0.09%。對最佳工藝參數進行驗證實驗,得到的魚丸持水率和不易流動水占比與模型理論值接近,證明其工藝可行。本研究采用海藻糖、VE和蔗糖脂肪酸酯作為復合抗凍劑,在保留魚丸感官的前提下,為探究制作魚丸的抗凍劑提供了參考依據。