ROO·氧化對核桃蛋白結構的影響

王旭敏,陳潔如,王瑞,狄建兵

(山西農業大學 食品科學與工程學院,山西 晉中 030801)

蛋白質氧化第一次出現在人們的視野中是在醫學領域,后來慢慢引入食品領域,在醫學上,血漿、組織細胞中的蛋白質被氧化后,蛋白質的結構被破壞,發生變化,導致細胞功能受損[1]。在食品領域中,蛋白質氧化是指在直接或間接氧化作用下,蛋白質內部發生變化,原本的共價結構被破壞,發生改變,并且有分子間的鏈接、肽鏈斷裂等現象發生,使蛋白質的功能特性進一步惡化,風味下降,營養損失[2]。

近年來,使用植物蛋白代替動物蛋白引起人們的廣泛關注,植物蛋白對人體健康有生理調節作用,具有降低心血管疾病風險、延長慢性腎病患者生命周期、預防糖尿病等作用[3]。我國是核桃種植及生產大國,2021年,我國核桃種植面積達1.2億畝,產量達540.4萬噸[4]。核桃蛋白營養均衡,深受大眾喜愛,是人們重點關注的植物蛋白資源,核桃蛋白富含活性肽,具有很好的抗氧化活性[5]。近年來,許多水解后的植物蛋白被加工成各種增加產品風味的調味品[6],榨油后的核桃粕保留了核桃的主要營養成分,以核桃粕為原料生產核桃醬油,提高了核桃的綜合利用率,也為生產高檔醬油提供了方向[7]。

脂質過氧化是一個非常復雜的反應過程,其主要的中間產物包括R·、RO·、ROO·等,在不同的氧化過程中,都有ROO·的存在與參與,它的存在使脂質過氧化與蛋白質氧化密切相連,而且ROO·的擴散距離遠、半衰期長,造成的損害也較大,因此常研究ROO·氧化對核桃蛋白的影響[8]。

為了了解ROO·氧化對核桃蛋白的影響,本文利用不同濃度AAPH形成的不同程度的脂質過氧化系統對核桃蛋白進行了不同程度的氧化,對氧化后的不同指標進行了一系列分析,為抑制核桃蛋白氧化、提高核桃的綜合利用率提供了理論依據。

1 材料、試劑與設備

1.1 主要材料

核桃粕粉:秋香核桃榨油后的粕粉。

1.2 主要試劑

實驗試劑見表1。其他試劑均為實驗室用分析純。

表1 實驗試劑Table 1 The experimental reagents

1.3 主要設備

實驗儀器與設備見表2。

2 實驗方法

2.1 核桃分離蛋白的制備

根據劉巖等[9]的方法略加修改,脫脂核桃粉與水按1∶26的比例混合,調節蛋白溶液的pH至11,磁力攪拌1.5 h,離心(5 000×g,20 min),用鹽酸調節上清液的pH,當pH達到4.5時停止,室溫下磁力攪拌1 h,離心(9 000×g,20 min),得沉淀,用氫氧化鈉溶液將沉淀的pH調節至7.0,倒入液氮快速冷凍,在超低溫冰箱中放置24 h,取出放入真空凍干機進行干燥,得到核桃分離蛋白,于4 ℃冰箱中保存。

2.2 ROO·氧化蛋白的制備

將2.1制得的分離蛋白用磷酸緩沖液配制成25 mg/mL的溶液備用,加入濃度分別為0,0.04,0.2,1,5,25 mmol/L的AAPH,放入恒溫振蕩器中,37 ℃、避光條件下振蕩24 h,取出后迅速放于冰浴中,使溫度快速降至4 ℃以下,將不同溶度的溶液各取出5 mL備用,隨后將溶液透析72 h,期間每6 h換一次水,目的是除去未參與反應的AAPH,透析結束后用液氮快速冷凍,隨后放入凍干機中,獲得ROO·核桃氧化蛋白,于4 ℃冰箱中貯藏備用。

2.3 回收率的測定

取5 mL 2.2中的溶液進行回收率的測定,將樣品離心(4 ℃、10 000×g、30 min),測定上清液中蛋白含量,計算回收率。

2.4 溶解度的測定

將2.2制得的核桃氧化蛋白配制成10 mg/mL的溶液,離心(25 ℃、10 000×g、20 min),取出上清液備用,測定上清液中蛋白含量,進一步計算其溶解度。

2.5 巰基含量的測定

采用DTNB比色法[10]。稱取15 mg核桃ROO·氧化蛋白加入5 mL Tris-Gly-8 mol Urea緩沖液中,使用漩渦振蕩儀在高速模式下對其進行振蕩分散,然后加入4 mg/mL的DTNB溶液50 μL,迅速搖勻,保溫30 min,以緩沖液為空白對照,測定其A412 nm,公式如下:

式中:SH為巰基含量,μmol/g;c為蛋白質溶液的濃度,mg/mL。

2.6 粒徑、電位的測定

將2.2制得的核桃氧化蛋白用配好的磷酸鹽緩沖液進行溶解,得到0.02%的蛋白溶液,離心(25 ℃、10 000×g、20 min),取上清液,過0.45 μm水膜,用納米粒度及Zeta電位分析儀進行測定。

2.7 表面疏水性的測定

將2.2制得的ROO·核桃氧化蛋白溶解于PBS緩沖液中,配成1%的溶液,攪拌,離心(25 ℃、10 000×g、20 min),取上清液,測定其蛋白含量,繼續用磷酸鹽緩沖液對上清液進行稀釋,稀釋后在其中再加入5 μL 8 mmol/L的ANS溶液,設定激發波長與吸收波長分別為395 nm和470 nm,測定熒光強度,用熒光強度對蛋白質濃度作圖,曲線斜率即為蛋白質表面疏水指數。

2.8 二級結構的測定

稱取0.01 g核桃氧化蛋白,加入溴化鉀,研磨,壓片,采用傅里葉紅外光譜儀對核桃氧化蛋白進行全波段掃描,對蛋白進行結構分析[11]。

2.9 內源熒光光譜的測定

將2.2制得的核桃氧化蛋白樣品溶解于10 mmol/L、pH 7.0的PBS緩沖液中,配制成1%的蛋白溶液,25 ℃離心(10 000×g,20 min),以PBS緩沖液為空白對照測定其光譜。熒光光譜為295 nm,發射光譜為300～400 nm[12]。

2.10 數據處理分析

每個實驗進行3次平行實驗,使用SPSS 26.0、Origin 21.0對數據進行分析繪圖。

3 結果與分析

3.1 蛋白質氧化對核桃氧化蛋白回收率的影響

蛋白質的回收率是影響其能否廣泛應用于食品行業的關鍵因素之一[13]。由圖1可知,當樣品中不加入AAPH時,回收率為77.79%,AAPH濃度為0.04,0.2 mmol/L時,即低濃度氧化時,回收率略微升高,分別為80.67%、79.98%;當核桃氧化蛋白中AAPH濃度達到1 mmol/L時,蛋白回收率達到最高,為87.56%;隨著AAPH濃度的進一步提高,蛋白回收率出現快速下降的現象,下降到41.11%;當濃度為25 mmol/L時,蛋白回收率降到最低值,為25.54%。由此可知,低濃度氧化能夠提高核桃蛋白的回收率,但是隨著氧化程度的逐漸加深,蛋白回收率明顯降低,蛋白結構被破環,蛋白變性,產生了不溶性聚集物,進一步影響核桃蛋白在食品工業中的應用。

圖1 不同AAPH濃度對回收率的影響Fig.1 Effect of different AAPH concentrations on the recovery rate

3.2 蛋白質氧化對核桃氧化蛋白溶解度的影響

溶解度通常指某種物質在溶劑中的溶解程度,對功能特性有重要的影響,也常常被用來表示核桃蛋白的聚集程度。不同AAPH濃度對核桃氧化蛋白溶解度的影響見圖2。

圖2 不同AAPH濃度對溶解度的影響Fig.2 Effect of different AAPH concentrations on the solubility

由圖2可知,核桃氧化蛋白中不加入AAPH時,溶解度為77.59%,低濃度氧化時,蛋白溶解度升高,在AAPH濃度為0.2 mmol/L時溶解度達到最高,為92.12%;當AAPH濃度進一步增加,氧化程度進一步加深,溶解度開始降低,最終下降到68.60%。由此可知,低濃度氧化可以提高溶解度,氧化進一步進行,溶解度開始降低。這可能是因為ROO·可以氧化主肽鏈以及側鏈基團,使得疏水作用被改變,暴露出來的基團相互作用,形成聚集體,繼續氧化,聚集體會再度聚集,溶解度上升;而當AAPH濃度高、氧化加深時,聚集體會轉變成不溶性聚集物,溶解度會隨之降低。

3.3 蛋白質氧化對核桃氧化蛋白巰基含量的影響

巰基在蛋白質結構中是一種比較重要的官能團,它不僅可以維持蛋白質的三級結構,而且可以反映蛋白質的變性程度[14],所以經常用來評判蛋白質的氧化程度。不同AAPH濃度對核桃氧化蛋白巰基含量的影響見圖3。

圖3 不同AAPH濃度對巰基含量的影響Fig.3 Effect of different AAPH concentrations on the sulfhydryl content

由圖3可知,當核桃氧化蛋白中AAPH濃度越來越大時,巰基含量呈現下降的趨勢,從82.593 μmol/g最終下降到40.983 μmol/g。可能是因為AAPH裂解,產生ROO·,其與游離巰基發生反應后會生成一種新的物質——亞磺酰基自由基,然后與氧分子結合,誘導蛋白質氧化,巰基含量下降。

3.4 蛋白質氧化對核桃氧化蛋白粒徑的影響

粒徑通常用來反映蛋白的聚集程度[15]。由圖4可知,核桃蛋白粒徑峰值都出現在300 nm左右。當AAPH濃度為0.2 mmol/L時,峰值的范圍變寬,此時顆粒分布比較分散;當AAPH濃度從0.2 mmol/L上升至1 mmol/L時,小的可溶性聚合體發生斷裂,生成了更小的小分子物質,出現粒徑變小的現象,氧化濃度增加時,可溶性部分發生共價交聯和非共價聚合,轉化為不溶性物質,粒徑變大;當AAPH濃度達到25 mmol/L時,在接近1 000 nm處出現一個小峰,說明在高濃度氧化時,會導致不溶性物質的出現,聚集在一起,粒徑變大。

圖4 不同AAPH濃度對粒徑的影響Fig.4 Effect of different AAPH concentrations on the particle size

3.5 蛋白質氧化對核桃氧化蛋白電位的影響

由圖5可知,當AAPH濃度從0 mmol/L上升到0.04 mmol/L時,Zeta電位并未發生顯著變化,當AAPH濃度上升到1 mmol/L時,Zeta電位明顯降低,達到了-11.09 mV,AAPH濃度為5 mmol/L時,Zeta電位發生小幅度變化,上升為-7.53 mV。當AAPH濃度為1 mmol/L時,Zeta電位絕對值最大,此時體系最穩定,隨著氧化的進一步加深,絕對值逐漸變小,吸引力明顯超過了排斥力,核桃蛋白體系的分散被破壞,發生凝聚現象,體系變得不穩定。

圖5 不同AAPH濃度對電位的影響Fig.5 Effect of different AAPH concentrations on the potential

3.6 蛋白質氧化對核桃氧化蛋白表面疏水性的影響

疏水基之間的相互作用對于維持蛋白質的三級結構是不可或缺的一環,在天然蛋白質中,疏水鍵的生成起到了避免水相的作用,從而疏水作用在蛋白質的穩定性和構象中起著非常重要的作用[16]。通過對表面疏水性的測定與分析,可以得到疏水性氨基酸在其表面的分布情況[17]。不同AAPH濃度對核桃氧化蛋白表面疏水性的影響見圖6。

圖6 不同AAPH濃度對表面疏水性的影響Fig.6 Effect of different AAPH concentrations on the surface hydrophobicity

由圖6可知,表面疏水指數與AAPH濃度成反比。其原因可能是蛋白質氧化導致構象破壞、結構展開、疏水基暴露,疏水基相互作用形成聚集體,疏水指數下降;或者氧化作用使核桃蛋白的結構展開和重組,疏水基嵌入并形成新的親水基團,疏水指數下降[18]。

3.7 蛋白質氧化對核桃氧化蛋白二級結構的影響

圖7 不同AAPH濃度對二級結構的影響Fig.7 Effect of different AAPH concentrations on the secondary structure

圖8 不同AAPH濃度在酰胺I帶處的影響Fig.8 Effect of different AAPH concentrations on the amide I band

由圖7可知,不同AAPH濃度對紅外譜圖的走勢沒有大的影響,說明不同程度的蛋白質氧化并未改變核桃蛋白中的特定基團。對酰胺I帶進行二階求導,可以得到各個特征峰,其中1 612～1 641 cm-1處為β-折疊;1 641～1 656 cm-1處為無規則卷曲;1 656～1 664 cm-1處為α-螺旋;1 664～1 678 cm-1處為β-轉角;1 678～1 687 cm-1處為β-折疊;1 687～1 700 cm-1處為β-轉角[20]。

由圖8可知,隨著AAPH濃度的增加,圖中的峰越發明顯,說明蛋白質的氧化可以形成核桃蛋白聚集體,但當AAPH濃度達到5,25 mmol/L時,即高濃度氧化時,圖譜發生變化,可能是因為高濃度氧化使得核桃蛋白肽鏈發生變化,破裂,結構進一步發生變化。

3.8 蛋白質氧化對核桃氧化蛋白內源熒光的影響

內源熒光光譜通常通過反映色氨酸殘基的微環境變化來表示蛋白質的結構變化[21]。用芳香族氨基酸暴露的程度來表示熒光強度,并進一步反映蛋白質的三級構象變化,當芳香族氨基酸暴露較多時,熒光波長轉移到長波長處;當更多發色團嵌入時,熒光波長轉移到更短波長處[14]。不同AAPH濃度對核桃氧化蛋白內源熒光的影響見表3。

表3 不同AAPH濃度對內源熒光的影響Table 3 Effect of different AAPH concentrations on the endogenous fluorescence

由表3可知,當AAPH濃度低于1 mmol/L時,最大吸收波長均在335 nm處,隨著AAPH濃度的增加,最大吸收波長發生藍移,可能是因為隨著氧化的加深,色氨酸發生轉移,進入到更加疏水的環境中。當AAPH濃度增加時,熒光強度呈現持續降低的趨勢,這可能是因為蛋白質中的烷過氧自由基發生反應,使得分子聚集在一起,色氨酸殘基被包埋,顯示不出來,也有可能是因為烷過氧自由基對色氨酸殘基有熒光淬滅作用[22]。

4 小結

ROO·氧化改變了蛋白質結構。隨著AAPH濃度的增加,巰基含量與表面疏水指數呈現降低的趨勢,蛋白質構象被破壞,內部結構展開,發生結合,數值下降;回收率與溶解度均先上升后下降,都在1 mmol/L時達到最大值,說明低濃度氧化對核桃蛋白的回收率與溶解度都有一定的提升作用,但在高濃度氧化作用下,可溶性聚集物轉化成不溶性聚集物,回收率與溶解度開始降低;由粒徑結果可以看出,低濃度氧化時粒徑變小,這是由于小的可溶性聚集體斷裂,變成更小的小分子,隨著氧化濃度的增加,粒徑變大,可能是其中可溶性的部分通過共價交聯和非共價聚集轉變成不溶性物質;Zeta電位絕對值先升高后降低,說明適當的氧化使得核桃蛋白體系更加穩定;高濃度氧化時,吸引力大于排斥力,核桃蛋白體系分散被破壞;由紅外光譜圖可以看出,低濃度氧化可以形成核桃蛋白聚集體,所以圖譜中的峰變得越發明顯,而在高濃度氧化時,蛋白質肽鏈斷裂,結構發生變化;由熒光結果可以看出,高濃度氧化時蛋白質最大吸收波長發生藍移,蛋白質內部的色氨酸轉移到更加疏水的環境中,熒光強度呈現持續降低的趨勢,說明烷過氧自由基導致蛋白質分子發生聚集,蛋白質結構變化。

近年來,對于核桃的研究都圍繞著的核桃蛋白進行,張雪春等[23]研究了沒食子酸、兒茶素、楊梅素對核桃蛋白氧化穩定性的影響,經過氧自由基氧化后,核桃蛋白的功能性質下降,經過3種多酚干預后,一定程度上降低了核桃蛋白的氧化程度,其中兒茶素的效果最明顯。張雪春等[24]建立了羥自由基氧化體系,對核桃蛋白結構的變化進行研究,結果表明適度的氧化可以改善核桃蛋白的乳化性能及起泡性能。孫領鴿等[25]采用不同濃度的丙二醛處理核桃蛋白,結果表明適度的氧化可以改變核桃蛋白的界面性質,過度氧化對核桃蛋白的泡沫性質產生負面影響。本研究表明ROO·氧化對核桃蛋白的結構產生了一定的影響,對核桃蛋白的綜合利用及貯藏有一定的理論意義。