植物乳桿菌強化發酵茖蔥泡菜條件優化研究

肖雄峻,胡蘭馨,劉麗娟,王浩杰,杜悅,毛祥*

(1.四川輕化工大學 生物工程學院,四川 宜賓 644000;2.瀘州國之榮耀酒業有限公司,四川 瀘州 646000)

茖蔥(AlliumvictorialisL.)別名山蔥、隔蔥、鹿耳蔥、角蔥,廣泛分布于我國黑龍江、吉林、遼寧、河北、山西、內蒙古、陜西、甘肅(東部)、湖北、河南和浙江(天目山)、四川(北部)等地區[1]。近年來,對茖蔥的藥理研究發現,茖蔥揮發性提取物中分離得到的含硫化合物及黃酮化合物等是其重要的活性成分,在防治心血管疾病、降血脂、降血糖、抗腫瘤及抗炎等方面有著潛在的療效,極具開發價值[2-3]。目前,國內民眾對茖蔥的認識大多還停留在藥用價值方面,對于我國東北地區民眾來講,茖蔥早已成為人見人愛的健康野菜。其在歐美、日、韓等國也備受推崇[4],特別是日、韓兩國還長期從我國東北地區進口茖蔥,僅日本一國年消費量在800噸以上且還有擴大的趨勢,在韓國也只有高星級的酒店才會提供[5],由此可以看出人們對茖蔥的喜愛。但新鮮茖蔥采摘期短(一般在2個月左右),不耐儲存,極易腐爛,這給茖蔥的跨距離、跨季節銷售帶來了嚴峻挑戰。因此,對茖蔥進行精深加工對解決這一現實矛盾具有重要意義。

近年來,國內外學者對茖蔥做了大量研究,一是對茖蔥的化學成分組成及藥理學進行研究,如Nishimura首次從茖蔥揮發油中提取了甲基烯丙基硫醚(methyl allyl sulfide)、二甲基二硫(dimethyl disulfide)、二烯丙基硫醚(diallyl sulfide)、甲基丙基二硫醚(methyl propyl disulfide)等14種物質[6]。從茖蔥中提取的烯丙基三硫化合物(allyl trisulfides)和阿焦烯(ajoene)有很好的抗凝劑作用,而且二硫化物和三硫化物對降低膽固醇、降血脂和預防癌癥有較強的作用[7]。在含硫化合物中起抗凝劑作用的主要成分是乙烯基二半胱亞砜(vinyldithiins)[8]。Li等還從茖蔥鱗莖中分離出兩種類黃酮(flavonoid)和一種類固醇皂苷(steroidal saponins)[9]。胡興鵬等[10]通過一維、二維核磁、高分辨質譜等手段鑒定了8種黃酮類物質,其中兩種為新型結構的黃酮類物質。黃翠菊[11]對茖蔥中分離的黃酮粗提物、皂苷粗提物進行組合實驗,驗證了二者對小白鼠的免疫系統具有良好調節效果。李雅萌[12]的研究結果顯示茖蔥 70%乙醇提取物可改善煙霧所致小鼠肺功能損傷,抑制炎性因子水平,提高抗氧化能力,對香煙煙霧誘導的抗慢性阻塞性肺疾病具有一定的抗炎及抗氧化損傷作用,且以高劑量(0.32 g/kg)作用更明顯,表明茖蔥中含有豐富的風味物質,極具營養價值和藥用價值。二是茖蔥種植、栽培及育種等方面的研究,關于茖蔥有性繁殖與無性繁殖的初步研究、栽培技術[13]、物種分類[14]等方面的研究已經比較成熟,對茖蔥的推廣、消費起到了極大的促進作用,但是針對后續茖蔥產品開發相關研究卻未得到同步發展,極大地束縛了茖蔥消費市場空間的發展。加之當前對茖蔥進行深加工的研究報道較少,因此本研究在借鑒四川泡菜制作工藝的基礎上,以感官評分為標準,針對茖蔥接種乳酸菌進行強化發酵,以期開發出一款具有良好風味和較好品質的茖蔥泡菜,為茖蔥產品的開發及精深加工提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮茖蔥:購自四川綿陽;商品茖蔥泡菜(500 g/袋):丹東榮正食品有限公司;食鹽、花椒、八角、桂皮、香葉、蔗糖、高度白酒:均購于當地超市。其他試劑:均為分析純,成都市科隆化學品有限公司。

菌種:植物乳桿菌hd01(Lactobacillusplantarum),保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏編號為CCTCC No.:M2015184,下文簡稱“乳酸菌”。

MRS固體培養基:蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL,自然pH,116 ℃,濕熱滅菌20 min。

1.2 主要儀器與設備

A390型紫外可見分光光度計 翱藝儀器(上海)有限公司;UPT-I-20T優普超純水機 四川優普超純科技有限公司;XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司;ME204E/02電子天平、FE28 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;ZWY-211C恒溫培養振蕩器、ZHJH-C1118C超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司;BSP-400生化培養箱、BG2-140電熱鼓風干燥箱、BXM-75立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與計數

菌種活化:將保藏的植物乳桿菌菌種接種于MRS固體培養基上,37 ℃培養48 h,重復操作活化兩代,轉接斜面備用。

菌懸液制備:使用10 mL無菌生理鹽水將活化后的乳酸菌從試管斜面洗下,轉移至250 mL無菌三角瓶(含3粒玻璃珠)中,混勻后制成菌懸液,于600 nm波長處,用生理鹽水將其濁度稀釋至1 OD。

菌落計數:采用澆注平板法對上述菌懸液進行計數,濁度為1 OD的乳酸菌菌懸液中含有1.18×108CFU/mL的活細胞。

1.3.2 茖蔥泡菜制作工藝

茖蔥泡菜的制作參照敖軍等報道的四川泡菜制作工藝進行[15],見圖1。

圖1 茖蔥泡菜制作工藝流程圖Fig.1 Production process flow chart of Allium victorialis pickles

1.3.3 單因素試驗優化茖蔥泡菜制作工藝

于250 mL燒杯中,添加50 g茖蔥和150 mL泡菜水,分別對食鹽添加量(1%、2%、3%、4%、5%,食鹽質量與泡菜水體積比)、增脆劑氯化鈣添加量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%,氯化鈣質量與泡菜水體積比)、乳酸菌接種量(3%、4%、5%、6%、7%,1.18×108CFU/mL的乳酸菌液體積與泡菜水體積比)、蔗糖添加量(1%、2%、3%、4%、5%,蔗糖質量與泡菜水體積比)、發酵溫度(22,27,32,37,42 ℃)進行優化,發酵時間為6 d,以模糊數學綜合感官評分為主評價茖蔥泡菜的品質,確定最佳制作工藝條件,同時監測其總酸和游離酸含量。在優化各單因素試驗時,其他因素均為最佳條件,每組試驗做3個生物學重復。

1.3.4 Box-Behnken設計優化茖蔥泡菜制作工藝

從食鹽添加量、乳酸菌接種量、增脆劑添加量、蔗糖添加量、發酵溫度中選出對茖蔥泡菜品質影響最大的3個因素及相應水平,用Design Expert軟件進行三因素三水平Box-Behnken響應面優化設計,以模糊數學綜合感官評分為主要評價指標,確定最佳制作工藝條件組合,同時監測其總酸和游離酸含量,Box-Behnken三因素三水平設計表見表1。

表1 Box-Behnken 因素水平設計表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5 茖蔥泡菜的模糊數學綜合感官評價

1.3.5.1 感官評價標準表

邀請10名人員對茖蔥泡菜的色澤、滋味、組織狀態和香氣進行感官評價及評分,要求評定人員在評定前12 h內不吸煙、不飲酒、不食辛辣等刺激性食物,評定一個樣品后以清水漱口,間隔10 min再評定下一個樣品,最后填好評分表并簽名[16]。將各評定人員的評定結果收集起來進行分析。

1.3.5.2 感官評價因素權重的確定

感官評價因素權重表示各評分因素對茖蔥泡菜感官影響的相對重要性。評價因素占比之和為1,表示為X=(x1,x2,x3,…xn)。本次茖蔥泡菜試驗由10名評定人員對商品茖蔥泡菜的色澤、滋味、組織狀態、香氣4個質量因素在感官評價(見表2)中的權重進行評分,總分為10分,認為最重要的質量因素占的權重最大,評分越高。統計各指標的得分在總分中的占比,計算得出各因素的權重X=(0.21,0.3,0.29,0.20)。

表2 茖蔥泡菜感官評價標準表Table 2 Sensory evaluation criteria for Allium victorialis pickles

1.3.5.3 模糊矩陣的建立

以色澤、滋味、組織狀態、香氣4項指標組成因素集U=(色澤,滋味,組織狀態,香氣)=(u1,u2,u3,u4)。模糊評價以好、一般、差對各因素進行評價,3個指標的評語集記為V=(好,一般,差)=(v1,v2,v3)T,在感官評分時,v1=8～10,v2=4～7,v3=0～3,樣品的模糊矩陣R=U×V。

1.3.5.4 模糊數學綜合評分矩陣方程

1.3.6 游離酸及總酸測定

茖蔥泡菜游離酸的測定采用pH計法進行測定,總酸的測定參照國標GB 12456-2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》的方法進行[17]。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 食鹽添加量對發酵茖蔥泡菜品質的影響

食鹽在泡菜制作過程中具有防腐和增味的作用[18],是影響泡菜發酵過程的重要環境因素。由圖2中A可知,在食鹽添加量為1～3 g/dL時,茖蔥泡菜的綜合感官評分隨著食鹽添加量的增加而增加,說明在低濃度鹽含量條件下,鹽對茖蔥泡菜的風味具有提升作用,可能是因為低鹽發酵茖蔥泡菜中雜菌生長代謝抑制不明顯,影響了茖蔥泡菜的風味(滋味和氣味);然而隨著食鹽添加量的增加,茖蔥泡菜的綜合感官評分反而降低,一方面是因為高濃度的鹽對茖蔥泡菜生產過程中微生物無差別地抑制,影響了茖蔥泡菜風味的形成;另一方面是因為食鹽是泡菜的重要呈味物質,使茖蔥泡菜的咸味增加,影響了茖蔥泡菜的綜合感官評分。由圖2中B可知,茖蔥泡菜中總酸隨著食鹽添加量的增加而呈下降趨勢,pH則隨食鹽添加量的增加而升高,說明食鹽添加量對茖蔥泡菜發酵過程中總酸及pH的影響較大,泡菜制作過程中的主要有機酸為乳酸、乙酸等[19],這些有機酸在泡菜中電離出H+,使茖蔥泡菜的pH值下降,當pH值在3.7～4.9之間時,茖蔥泡菜即可顯示出明顯的酸感,若pH值低于3.0,則酸味過強,難以適口。簡而言之,在茖蔥泡菜發酵過程中,適當的食鹽添加量能賦予泡菜風味,抑制雜菌生長,增強泡菜的風味。茖蔥泡菜制作時食鹽添加量為3 g/dL時,其綜合感官評分最高,為7.156分。

圖2 不同食鹽添加量對茖蔥泡菜品質的影響Fig.2 Effect of different salt addition amount on the quality of Allium victorialis pickles注:A為食鹽添加量對茖蔥泡菜綜合感官評分的影響,B為食鹽添加量對茖蔥泡菜總酸、pH值的影響;同一折線不同小寫字母表示組間顯著性差異(P<0.05)。

2.1.2 乳酸菌接種量對發酵茖蔥泡菜品質的影響

大量研究表明泡菜發酵過程中的優勢菌群是乳酸菌,其迅速繁殖,并利用泡菜原料產生有機酸(乳酸、醋酸、檸檬酸)、氨基酸及多種芳香風味物質[20],因此我們探究了乳酸菌對茖蔥泡菜品質的影響。由圖3中A可知,乳酸菌接種量在3%～5%時,茖蔥泡菜的綜合感官評分呈上升趨勢,之后隨著乳酸菌接種量的升高,茖蔥泡菜的綜合感官評分呈下降趨勢,原因可能是泡菜中接種乳酸菌數量增多,對應乳酸菌菌群達到穩定期的時間縮短,代謝產物積累的時間也相應縮短,致使高于6%乳酸菌接種量的茖蔥泡菜中總酸含量偏高,pH值降低(見圖3中B),酸感變強,影響產品的感官評分。乳酸菌接種量為5%時,綜合感官評分最高,為7.578,故選擇最佳乳酸菌接種量為5%。

圖3 不同乳酸菌接種量對茖蔥泡菜品質的影響Fig.3 Effects of different inoculation amount of lactic acid bacteria on the quality of Allium victorialis pickles 注:A為乳酸菌接種量對茖蔥泡菜綜合感官評分的影響,B為乳酸菌接種量對茖蔥泡菜總酸、pH值的影響;同一折線不同小寫字母表示組間顯著性差異(P<0.05)。

2.1.3 增脆劑氯化鈣添加量對發酵茖蔥泡菜品質的影響

茖蔥是一種葉類蔬菜,由于其在發酵過程中容易變軟易碎,影響茖蔥泡菜的美觀,而氯化鈣能保持果蔬加工制品的脆度和硬度[21],因此研究了添加0.01～0.05 g/dL氯化鈣對發酵茖蔥泡菜品質的影響。由圖4可知,氯化鈣添加量為0.01～0.03 g/dL時,總酸呈上升趨勢,pH逐漸下降,但均未達到顯著水平(P>0.05),同時,綜合感官評分也得到提升;說明氯化鈣對茖蔥泡菜質構品質方面起到了一定作用。添加量為0.03～0.05 g/dL時,總酸呈下降趨勢,pH逐漸上升,綜合感官評分開始下降。可能的原因是食品添加劑氯化鈣的添加量不宜過大,否則產品會產生苦澀味,影響口感[22],當氯化鈣添加量為0.03 g/dL時,總酸和pH最適宜,綜合感官評分最高,為7.911,按FAO/WHO規定,氯化鈣在酸黃瓜中單用或與其他凝固劑合用量不應超過0.25 g/kg(以Ca2+計),約為氯化鈣0.69 g/kg,茖蔥泡菜中增脆劑添加量符合該規定的使用劑量,故選擇氯化鈣的最佳添加量為0.03 g/dL。

圖4 不同增脆劑氯化鈣添加量對茖蔥泡菜品質的影響Fig.4 Effects of different embrittling agent calcium chloride addition amount on the quality of Allium victorialis pickles注:A為增脆劑氯化鈣添加量對茖蔥泡菜綜合感官評分的影響,B為增脆劑氯化鈣添加量對茖蔥泡菜總酸、pH值的影響;同一折線不同小寫字母表示組間顯著性差異(P<0.05)。

2.1.4 蔗糖添加量對發酵茖蔥泡菜品質的影響

糖類物質不僅會影響最終產品的滋味,還可以作為乳酸菌通過代謝途徑產生有機酸、醇類和酯類等重要風味物質的底物[23],也是許多傳統泡菜的制作原料。由圖5可知,蔗糖添加量為1～2 g/dL時,對茖蔥泡菜的綜合感官評分影響不明顯,但添加量繼續增加,茖蔥泡菜呈現出明顯甜味,影響食品的綜合感官評分。但蔗糖添加量由1 g/dL增加至2 g/dL時,茖蔥泡菜中總酸及pH值的變化均達到顯著水平(P<0.05),在茖蔥泡菜發酵過程中添加蔗糖,能為泡菜微生物發酵提供更充足的碳源,促進乳酸菌、酵母菌等產酸微生物代謝酸類物質,形成酸味,進而影響泡菜的感官。當蔗糖添加量超過2 g/dL后,蔗糖在茖蔥中的甜味變得明顯,反而會影響茖蔥泡菜的綜合感官評分。蔗糖添加量達到5 g/dL時,茖蔥泡菜中的總酸含量下降,左旦[22]也報道5 g/dL的蔗糖會抑制泡菜發酵過程中總酸的增加,原因可能是茖蔥泡菜發酵體系中蔗糖、食鹽及無機鹽等對微生物滲透作用的疊加,影響微生物生長,減緩了茖蔥泡菜的發酵進程。綜上所述,選擇最佳蔗糖添加量為2 g/dL時綜合感官評分最高,為7.873。

圖5 不同蔗糖添加量對茖蔥泡菜品質的影響Fig.5 Effects of different sucrose addition amount on the quality of Allium victorialis pickles注:A為蔗糖添加量對茖蔥泡菜綜合感官評分的影響,B為蔗糖添加量對茖蔥泡菜總酸、pH值的影響;同一折線不同小寫字母表示組間顯著性差異(P<0.05)。

2.1.5 發酵溫度對發酵茖蔥泡菜品質的影響

大多數乳酸菌的最適生長溫度為37 ℃左右,因此研究了發酵溫度對茖蔥泡菜品質的影響,由圖6可知,隨著發酵溫度的升高,茖蔥泡菜的綜合感官評分呈下降趨勢,說明提高發酵溫度能縮短乳酸菌的發酵周期,加速“亞硝峰”出現,但發酵茖蔥泡菜的質量也有所下降[24]。相較于27 ℃,采用22 ℃發酵時,會有乳酸菌生長緩慢的現象出現,導致總酸偏低,且發酵周期會延長,而 27 ℃發酵時,泡菜的綜合感官評分雖有所下降,但總酸和pH都達到一個理想水平。當發酵溫度在22～32 ℃之間,其pH值變化不顯著(P>0.05),發酵溫度在27 ℃時,總酸含量最高(0.51 g/100 g),在22,32 ℃條件下發酵的茖蔥泡菜總酸含量變化未達到顯著水平;當溫度進一步升高,茖蔥泡菜中總酸含量顯著下降,pH值顯著上升,在42 ℃條件下,茖蔥泡菜的綜合感官評分下降顯著,同時泡菜液顏色變深,風味也產生了變化,有異味,可能是乳酸菌生長受到了抑制,導致丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)等雜菌生長[25]。綜合分析,選擇27 ℃為茖蔥泡菜的最佳發酵溫度。

圖6 不同發酵溫度對茖蔥泡菜品質的影響Fig.6 Effects of different fermentation temperatures on the quality of Allium victorialis pickles注:A為不同發酵溫度對茖蔥泡菜綜合感官評分的影響,B為不同發酵溫度對茖蔥泡菜總酸、pH值的影響;同一折線不同小寫字母表示組間顯著性差異(P<0.05)。

2.2 Box-Behnken響應面條件優化分析

2.2.1 三因素三水平的確定

綜合考慮單因素試驗結果,最終選擇食鹽添加量(A)、蔗糖添加量(B)及發酵溫度(C)進行響應面試驗設計,試驗結果見表3,該模型方差分析結果見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計及響應值Table 3 Box-Behnken test design and response values

表4 Box-Behnken感官評分方差分析結果Table 4 Results of variance analysis of sensory score byBox-Behnken

2.2.2 基于綜合感官評分結果的響應面回歸模型的建立與分析

由表4可知,該回歸模型的P=0.040 1(<0.05),達到顯著水平,相關系數R2=0.837 8,說明模型擬合度較好,信噪比=5.150 3(>4),表明該模型受外部因素的影響較小;C.V.=4.11%,表明該模型的離散程度較小,失擬項不顯著。綜上所述,表明該模型可信度高,可用于茖蔥泡菜發酵試驗結果的模擬預測。

以綜合感官評分為因變量(Y3),對食鹽添加量(A)、蔗糖添加量(B)、發酵溫度(C)為自變量擬合得到非線性回歸方程:Y3=7.79-0.039A+0.014B-0.079C-0.003AB+0.086AC-0.0035BC-0.59A2-0.52B2-0.20C2。根據F值大小判斷各因素對茖蔥泡菜綜合感官評分的影響大小為發酵溫度>食鹽添加量>蔗糖添加量,在二次項中,A2、B2均達到極顯著水平(P<0.01)。而各因素對綜合感官評分的交互影響均未達到顯著水平。

結合等高線和響應面(見圖7)可知,發酵溫度對綜合感官評分的影響最大。當發酵溫度恒定時,pH受蔗糖添加量和發酵溫度的協同作用影響較小,曲面坡度較緩;當蔗糖添加量或食鹽添加量恒定時,綜合感官評分較大程度上受到食鹽添加量和發酵溫度、蔗糖添加量和發酵溫度的協同作用影響,對應的響應面較陡峭。

圖7 不同發酵條件對茖蔥泡菜感官評分影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface diagrams and contour lines of effects of different fermentation conditions on the sensory scores of Allium victorialis pickles

綜上,響應面模型分析優化得到的最佳發酵工藝條件為食鹽添加量2.95 g/dL、蔗糖添加量3.01 g/dL、發酵溫度25.93 ℃,結合試驗的可操作性,將其修正為食鹽添加量3 g/dL、蔗糖添加量3 g/dL、發酵溫度26 ℃。

2.3 驗證Box-Behnken優化試驗結果

為驗證回歸模型預測值的有效性,按照響應面試驗條件接種5%乳酸菌(1.18×108CFU/mL),添加0.03 g/dL的增脆劑氯化鈣、3 g/dL食鹽、3 g/dL蔗糖于26 ℃條件下發酵6 d進行試驗驗證(n=3),在該條件下,茖蔥泡菜的綜合感官評分為(7.851±0.124)分,總酸含量為0.39 g/dL,pH值為3.77,與Box-Behnken試驗模型的預測值基本保持一致,表明模型預測結果可信度較高。

3 總結

通過對成品茖蔥泡菜進行感官品評,確定了茖蔥泡菜的綜合感官評分中色澤、滋味、組織狀態、香氣的占比為21∶30∶29∶20,并建立了茖蔥泡菜的模糊數學綜合感官評價體系;以綜合感官評價體系為自制強化發酵茖蔥泡菜的評價指標,對食鹽添加量、蔗糖添加量、增脆劑氯化鈣添加量、乳酸菌接種量、發酵溫度等條件進行單因素試驗,結果表明,茖蔥泡菜最佳強化發酵條件為食鹽添加量3 g/dL、乳酸菌接種量5%、增脆劑氯化鈣添加量0.03 g/dL、蔗糖添加量3 g/dL、27 ℃發酵6 d;在單因素條件優化基礎上,對自制強化發酵茖蔥泡菜進行Box-Behnken響應面條件優化,結果表明在食鹽添加量3 g/dL、蔗糖添加量3 g/dL、發酵溫度26 ℃條件下發酵的茖蔥泡菜綜合感官評分最高,為(7.851±0.124)分,總酸含量為0.39 g/dL,pH為3.77,此時茖蔥的口感最佳,酸甜適宜,脆嫩多汁,同時伴有茖蔥獨特的蔥香和蒜香。