宰后冷藏初期活性氧調控糖酵解對牛肉嫩度的影響

郭雨軒，陳 騁*，師希雄，郭兆斌，馬國源，張玉斌，張 麗，余群力

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

牛肉的嫩度作為評價肉品質的適口性指標，是決定消費者購買意向的重要因素[1]，而宰后冷藏過程中糖酵解對嫩度的改善發揮著重要作用。動物屠宰放血后，肌肉細胞能量代謝方式轉變為無氧糖酵解，后者引起肌肉內環境酸化進而導致結構蛋白變性、降解以及細胞凋亡，這些變化最終破壞肌肉結構，從而改善嫩度[2]。近年來，大量學者從飼喂管理、屠宰工藝以及宰后冷藏等方面對影響糖酵解反應的因素進行調控和干預，以改善肉的嫩度及相關品質。例如，在飼料中增加直鏈淀粉含量可影響糖酵解底物濃度和關鍵酶活性，間接調節pH值變化速率，從而減少豬肉的滴水損失和蒸煮損失[3]。屠宰后利用低壓電刺激促進糖酵解反應，能夠加速pH值下降、激活鈣蛋白酶，有效促進牛肉的宰后嫩化進程[4]。此外，有研究指出宰后冷藏初期調控牛肉蛋白質翻譯后修飾（乙?；?、磷酸化）水平能夠改變糖酵解速率而影響肉的嫩度[5]。由此可見，宰后動物糖酵解水平直接影響肉的嫩度，而糖酵解反應受到眾多因素影響，且具體影響機制尚不完全清楚。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）作為分子氧還原過程的產物，在宰后動物肌肉細胞中大量積累，并參與包括糖酵解在內的多種生化反應調控[6]。近期研究指出，ROS可能通過以下途徑參與宰后動物肌肉糖酵解反應的調控：一是引起細胞基質中Ca2＋釋放，后者通過激活腺苷酸活化蛋白激酶信號通路提升糖酵解水平[7]；二是通過激活低氧誘導因子信號通路間接誘導糖酵解限速酶活化，加速宰后初期糖原向乳酸的轉變[8]。此外，有研究指出癌細胞中的ROS可以通過調控葡萄糖轉運蛋白3的表達提升糖酵解底物的轉運效率，以此提高糖酵解能力[9]。糖酵解是由10 種酶催化的復雜反應過程，該過程可能為ROS提供了多個調控位點。因此，有必要深入研究ROS影響牛肉糖酵解進程的具體機制及其靶點蛋白質。

一項研究通過串聯質譜標簽（tandem mass tags，TMT）蛋白質組學技術發現肌肉細胞中與糖酵解相關的酶可作為肌肉關鍵品質的生物標志物[10]。例如，張蘭等[11]利用TMT定量蛋白質組學技術鑒定出磷酸甘油激酶、己糖激酶等7 種蛋白是調節牦牛低氧適應性的關鍵表達因子，為低氧適應性的研究提供了一定理論基礎。Gao Xiaoguang等[12]利用組學技術發現參與糖酵解的丙酮酸激酶和腺苷酸激酶同工酶1可作為肉色的生物標志物，為肉類變色提供了預測因子。但是，ROS是否能夠引起宰后牛肉糖酵解相關蛋白表達水平及嫩度的差異尚未得到證實。

因此，本研究選取牛胴體背最長肌，分別采用ROS激活劑過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）、ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）和生理鹽水處理新鮮肉樣，探究宰后不同冷藏時間（0.5、6、12、24、48 h）ROS對牛肉糖酵解代謝水平和嫩度的影響，并利用TMT蛋白質組學技術對宰后冷藏24 h的H2O2處理組和對照組樣品的差異表達蛋白進行鑒定與定量分析，篩選出糖酵解通路中的關鍵蛋白，進而明確ROS調控糖酵解通路的機制及其在牛肉嫩化過程中的作用，以期進一步完善肉品質形成和調控理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉樣采于甘肅康美現代農牧產業集團有限公司，選取健康無病、體質量（500±50）kg、飼養條件相同且平均年齡3 歲的安格斯雜交公牛6 頭。

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、尿素、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM） 美國Sigma公司；TMT試劑盒上海晶萊生物技術有限公司；H2O2、NAC 北京拜爾迪生物技術有限公司；胰蛋白酶（100 U/mg） 美國Promega公司；糖原、乳酸檢測試劑盒 上海梵態生物科技有限公司；甲酸、磷酸二氫鉀、氯化鉀 無錫市晶科化工有限公司。

1.2 儀器與設備

Q-Exactive System質譜儀、Easy-nLC 1000超高效液相色譜儀、C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）美國賽默飛世爾科技公司；MK-40A離心機 湖南邁克爾實驗儀器有限公司；RH-N50肉品嫩度測定儀 廣州潤湖儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集與處理

肉牛擊暈后以頸部三管齊斷方式屠宰，并于45 min內取右側胴體背最長肌，剔除筋膜，每個背最長肌分別切取5 份質量約為100 g的肉塊（6 cm×6 cm×3 cm）。將所有肉塊（30 塊）隨機分為H2O2處理組、NAC處理組和對照組，每組10 塊肉樣。各組肉樣分別用注射器按照肉樣質量與注射體積比為5∶1的比例均勻注射20 mmol/L H2O2溶液、20 mmol/L NAC溶液和0.9 g/100 mL生理鹽水。每塊肉樣分多次注射，針頭扎入深度約1.5 cm（肉樣厚度一半）、注射距離間隔2 cm，注射后在注射部位緩慢揉壓30 s，使其充分均勻擴散。處理后的肉樣在4 ℃冷藏0.5、6、12、24 h和48 h，并在每個時間點測定pH值和嫩度指標，每個指標重復3 次。同時取適量肉樣立即用液氮冷凍，在－80 ℃條件下保存備用。

1.3.2 糖酵解指標的測定

參考Wang Huajie等[13]的方法并略作修改，稱取2 g肉樣置于離心管中，加入18 mL 0.9 g/100 mL氯化鈉溶液（pH 7.1）冰浴勻漿，勻漿液以3 500×g、4 ℃離心10 min，棄去沉淀保留上清液，然后按照試劑盒說明書步驟測定糖原和乳酸含量，每個樣品重復測定3 次。

1.3.3 肉品質指標的測定

pH值：參考李華健等[14]的方法，首先使用標準溶液對pH計進行校準，肉樣吸除多余水分，使用pH計探頭在肉樣隨機部位測定3 次，記錄讀數。

剪切力：參考Suliman等[15]的方法，將肉樣置于水浴鍋中蒸煮至中心溫度達到75 ℃，取出后冷卻至室溫，然后沿著肌纖維方向切成長2 cm、直徑1.27 cm的柱狀體。使用嫩度儀測定剪切力，測定結果單位為N，每個樣品重復測定3 次。

肌原纖維小片化指數（myofibril fragmentation index，MFI）：參考Weimer等[16]的方法，取適量肉樣切碎，稱取2 g，加入18 mL緩沖液（含100 mmol/L氯化鉀、1 mmol/L氯化鎂、11.2 mmol/L磷酸氫二鉀、8.8 mmol/L磷酸二氫鉀、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L疊氮化鈉，下同）混合，冰浴勻漿，勻漿液以1 000×g、4 ℃離心15 min，棄去上清液，上述步驟重復2 次。沉淀加入10 mL緩沖液，以200 目篩過濾，調節濾液蛋白質量濃度至0.5 mg/mL，再于540 nm波長處測定吸光度，按照下式計算MFI，每個樣品重復測定3 次。

1.3.4 TMT蛋白質組學分析

1.3.4.1 蛋白提取和肽段酶解

參考馬聰聰等[17]的方法提取蛋白質，用蛋白檢測試劑盒進行定量。取100 μg蛋白樣品，加入4 倍體積10 mmol/L DTT溶液于56 ℃還原1 h。待冷卻至室溫后，添加55 mmol/L IAM溶液避光孵育30 min，然后將溶液轉移到超濾裝置（10 kDa），在4 ℃、7 500×g條件下離心15 min，棄去洗脫液，滴加1 mL緩沖液（8 mol/L尿素、150 mmol/L氯化氫緩沖液，pH 8.0），相同條件下離心20 min，重復上述操作兩次。加入100 μL胰蛋白酶混勻，在37 ℃下孵育過夜后，用體積分數1%甲酸溶液酸化，使用C18Cartridge移液器吸頭對肽段進行脫鹽處理，完成后加入40 μL裂解緩沖溶液復溶。

1.3.4.2 TMT標記和色譜分級

每個處理樣品取100 μg肽段，按照TMT試劑盒操作方法進行同位素標記。TMT標記的多肽混合后進行層析分級。將多肽置于流動相A（體積分數25%甲酸-10 mmol/L磷酸二氫鉀，pH 2.7）中溶解，利用流動相B（500 mmol/L氯化鉀-10 mmol/L磷酸二氫鉀-體積分數25%甲酸，pH 2.7）以恒定流速（1 mL/min）進行梯度洗脫：0～25 min、0%～10%；25～32 min、10%～20%；32～42 min、20%～45%；42～52 min、45%～100%；52～60 min、100%。間隔1 min收集餾分冷凍干燥，在C18Cartridge色譜柱上脫鹽。

1.3.4.3 液相色譜-串聯質譜檢測

使用Easy-nLC 1000超高效液相色譜儀對樣品進行分離，色譜條件為：體積分數0.1%甲酸-乙腈（16∶84，V/V）為流動相A，體積分數0.1%甲酸溶液為流動相B，流速250 nL/min，梯度洗脫程序：0～50 min、0%～35% A；50～58 min、35%～100% A；58～60 min、100% A。待分離完成后，樣品通過Q-Exactive System質譜儀分析處理，使用多肽片段和串聯質譜鑒定蛋白質，質譜掃描范圍為300～1 800m/z、分辨率為70 000，全質譜掃描自動增益控制為3×106，選擇前10 個肽段離子進入高能碰撞誘導解離（high-energy dissociation，HCD）碎裂，進入二級質譜并采集數據。

蛋白質在UniProt數據庫中進行匹配，設置肽段鑒定錯誤發現率（false discovery rate，FDR）小于等于0.01，一級離子質量容差為±20×10－6，二級離子質量容差為0.1 Da。根據差異倍數大于1.5或小于0.667且P＜0.05篩選差異表達蛋白。

1.3.4.4 生物信息學分析

使用基因本體論（gene ontology，GO）注釋、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集差異表達蛋白，并利用STRING數據庫對其進行蛋白質網絡互作（protein-protein interaction，PPI）分析，篩選糖酵解通路差異表達蛋白。

1.4 數據處理與分析

結果以3 次重復測定的平均值±標準差表示。采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan法進行多重比較，差異顯著性水平P＜0.05。采用OriginPro 2021軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 宰后冷藏過程中牛肉糖酵解水平變化

宰后冷藏過程中肌肉內正常的氧氣供應中斷，能量代謝方式從有氧氧化轉化為無氧糖酵解，糖原和乳酸作為糖酵解反應的底物和產物，其含量的變化直接反映了糖酵解水平和速率[18]。如圖1A所示，3 組樣品的糖原含量均隨著冷藏時間的延長而下降，其中H2O2處理組的糖原含量在6～24 h內顯著低于對照組和NAC處理組（P＜0.05）。H2O2處理組在6～24 h的糖原凈消耗分別是對照組和NAC處理組的1.31 倍和1.84 倍。如圖1B所示，隨冷藏時間延長，3 組樣品乳酸含量呈顯著上升趨勢，H2O2處理組乳酸含量在6～24 h內顯著高于其余兩組（P＜0.05），并在12 h達到最高水平，其0.5～12 h乳酸含量增量分別比NAC處理組和對照組高9.21%和4.96%，這與圖1A中糖原的快速消耗相對應。上述結果表明H2O2處理顯著提升了牛肉糖酵解水平，使糖原消耗和乳酸積累速率加快，而NAC處理則抑制了糖酵解進程。Luo Ya等[19]研究發現，蔗糖誘導的高水平ROS會加速肌肉糖原代謝速率，使糖原分解和乳酸積累顯著提高，與本研究的結果一致。此外，Chen Zuodong等[20]研究指出，外源H2O2處理能夠誘導牛肉中內源ROS生成，后者通過激活己糖激酶和磷酸果糖激酶提升宰后冷藏初期肌肉糖酵解水平。值得注意的是，Ma Jibing等[21]比較快速和慢速糖酵解牛肉中MFI的差異，發現快速糖酵解牛肉冷藏過程中MFI水平顯著提升，有利于牛肉的嫩化進程。因此，本研究推測H2O2處理提升宰后冷藏初期牛肉的糖酵解水平，可能對肉嫩度產生一定影響。

圖1 宰后冷藏過程中牛肉糖酵解水平的變化Fig.1 Changes in glycolysis level of bovine muscle during postmortem cold storage

2.2 宰后冷藏過程中牛肉品質指標變化

為探究ROS是否通過調控糖酵解水平影響牛肉的嫩度，對肉樣的pH值、剪切力和MFI進行測定。由圖2A可以看出，3 組樣品的pH值在0.5 h時沒有顯著差異，但隨著冷藏時間的延長均呈現顯著下降的趨勢，其中H2O2處理組pH值在6～24 h顯著低于其余兩組（P＜0.05），并在12 h達到極限pH值，比對照組和NAC處理分別提前了12 h和36 h。這與乳酸含量的變化趨勢（圖1B）相符，說明H2O2處理能夠提升宰后冷藏初期牛肉糖酵解水平，加速乳酸積累并引起pH值迅速下降。pH值變化速率直接影響肉的嫩度，在肉品質的形成過程中發揮重要作用[22]。pH值降低使肌肉內環境酸化，促使肌球蛋白和肌動蛋白形成永久橫橋，肌肉收縮而導致宰后僵直[23]。此外，pH值降低引起肌漿網功能受損，導致細胞內鈣離子過載，引起鈣蛋白酶、組織蛋白酶和細胞凋亡蛋白酶的活化，進而使這些酶迅速分解肌原纖維蛋白質，最終改善肉的嫩度[24-25]。

圖2 宰后冷藏過程中牛肉品質指標變化Fig.2 Changes in meat quality attributes of bovine muscle during postmortem cold storage

從圖2B可以看出，3 組樣品的剪切力隨冷藏時間的延長均呈先上升后下降的趨勢。其中，H2O2組的剪切力在12 h時達到最大（宰后僵直過程），比其余兩組提前12 h，表明H2O2能夠縮短僵直期，從而使肌肉嫩化進程提前。這可能與H2O2組較快的pH值下降速率有關。宰后冷藏過程中，當pH值下降到6.0以下時，肌肉細胞中μ-鈣蛋白酶被激活，后者迅速水解肌原纖維蛋白質，導致肌肉剪切力迅速下降[26]。上述作用可能是H2O2處理組在12 h時pH值達到最低且剪切力呈現顯著降低趨勢的原因。此外，Zhao Yan等[27]研究發現，宰后冷藏24 h內pH值快速下降能夠促進肌肉僵直，并且使最終剪切力顯著降低。邢通[28]指出較高初始濃度的ROS可通過激活磷酸葡萄糖變位酶等代謝蛋白加快糖酵解反應，破壞肌肉結構進而使剪切力顯著下降，這與本研究結果一致。

MFI可反映肌原纖維降解的程度，是評價肌肉嫩度的主要指標。由圖2C可以看出，3 組樣品的MFI均呈現顯著上升趨勢，6～48 h內H2O2處理組的MFI顯著高于對照組和NAC處理組（P＜0.05）。相反，NAC處理組MFI在6～48 h內均顯著低于對照組（P＜0.05）。MFI與肌肉纖維的破壞程度呈正相關，肌肉pH值的下降會激活μ-鈣蛋白酶、Caspases-3和組織蛋白酶B/D/L等重要的蛋白酶，進而加速肌原纖維結構蛋白的分解，造成肌原纖維及肌節的橫向斷裂，最終導致MFI上升和剪切力下降[29]。Ma Jibing等[21]研究發現，較高的ROS水平和pH值的快速下降是引起宰后冷藏期間牛肉MFI增加的主要原因，由此推測ROS通過加快糖酵解過程，從而間接促進了牛肉的嫩化進程。本研究同樣發現H2O2處理加速了牛肉pH值的降低，顯著縮短了肌肉僵直期并促進了MFI的升高。因此，較高的ROS水平可以通過加快糖酵解反應改善肉的嫩度。但是，關于ROS調控糖酵解通路的具體分子機制和靶點蛋白質仍不明確。

2.3 糖酵解差異蛋白鑒定結果

本研究發現H2O2處理能夠提升宰后冷藏初期牛肉糖酵解水平，并且有利于肉嫩度的改善。為探究ROS在復雜糖酵解反應進程中的作用機制，進一步采用TMT定量蛋白質組學技術對冷藏24 h時H2O2處理組和對照組樣品進行蛋白質組學分析。如表1所示，從兩組樣品共得到二級質譜譜圖總數170 424 個，鑒定肽段匹配到的譜圖數26 711 個，肽段總數7 090 個。在扣除空白值、確定可信蛋白的基礎上，以上調倍數大于1.5或下調倍數小于0.667、P＜0.05的條件篩選差異表達蛋白。如圖3所示，共篩選出271 個差異表達蛋白，其中上調蛋白135 個，下調蛋白136 個。

表1 冷藏24 h時H2O2處理組和對照組樣品蛋白質鑒定結果Table 1 Statistics of protein identification results in H2O2 treated versus control groups during 24 hours of refrigeration

圖3 冷藏24 h時H2O2處理組和對照組樣品蛋白質分析火山圖Fig.3 Volcano plot of differential proteins in H2O2 treated versus control groups during 24 hours of refrigeration

為確定數據的準確性，使用層次聚類算法對差異表達蛋白進行聚類分析，結果如圖4所示，H2O2處理組的樣品聚為一類并與對照組樣品分離，且H2O2處理組差異表達蛋白A0A4W2CXP9到A0A3Q1M3G5表達量（黃綠色區域）高于對照組，但對照組差異表達蛋白L8IJH1到A0A4W2CB58表達量（黃綠色區域）卻高于H2O2處理組，表明不同處理樣品的蛋白組具有顯著差異。同時，不同處理組之間層次分明，表明差異表達蛋白的合理性，驗證了差異表達蛋白生物性重復良好。

圖4 H2O2處理組和對照組樣品差異表達蛋白聚類熱圖Fig.4 Cluster heatmap of differentially expressed proteins between H2O2 treated versus control groups

2.4 生物信息學分析結果

為明確ROS調控糖酵解改善肉嫩度的差異表達蛋白，對差異表達蛋白進行GO注釋、KEGG功能富集、PPI分析。GO注釋分為細胞成分、生物過程、分子功能，其中前10 個條目如圖5A所示。不同處理下差異表達蛋白主要分布在細胞、細胞部分，所參與的生物過程集中在代謝和單生物過程，涉及的分子功能有催化活性和結合。肌肉細胞內不同通路互相協調，共同調節細胞生物學行為。對篩選出的差異表達蛋白進行KEGG富集分析，共富集到197 條通路，其中丙酮酸代謝、糖酵解/糖異生、肌肉收縮通路富集最為顯著（圖5B）。通過GO注釋與KEGG富集篩選出糖酵解差異表達蛋白，使用String 10.0數據庫對其進行PPI分析，結果如圖5C所示，差異表達蛋白磷酸甘油酸變位酶（phosphoglycerate mutase，PGAM）、醛脫氫酶7家族成員A1（aldehyde dehydrogenase 7 family member A1，ALDH7A1）、醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2 family member，A L D H 2）、醛脫氫酶3 家族成員A 2（a l d e h y d e dehydrogenase 3 family member A2，ALDH3A2）、2-磷酸-D-甘油酸水解酶（enolase，ENO）、丙酮酸脫氫酶E1亞基β（pyruvate dehydrogenase E1 subunit β，PDHB）、果糖-二磷酸醛縮酶C（aldolase C, fructose-bisphosphate，ALDOC）、乳酸脫氫酶B（lactate dehydrogenase B，L D H B）、丙酮酸脫氫酶E 1 亞基α（p y r u v a t e dehydrogenase E1 subunit α，PDHA）、丙酮酸激酶M1/2（pyruvate kinase M1/2，PKM2）形成網狀結構，彼此之間相互交叉，其中以PGAM、ENO、PDHB為主要節點，共同作用激活糖酵解酶相關基因，加速糖酵解的表達。

圖5 H2O2處理組和對照組樣品差異表達蛋白生物信息學分析結果Fig.5 Annotation enrichment analysis of differential proteins in H2O2 treated versus control groups

2.5 ROS調控糖酵解通路機制

通過對差異表達蛋白進行GO注釋和KEGG通路分析，確定差異表達蛋白參與的生物過程與富集通路，并對富集的糖酵解通路進行PPI分析，在此基礎上篩選出10 種糖酵解關鍵表達蛋白，H2O2處理使其中8 種蛋白表達上調、2 種蛋白表達下調，具體如表2所示。

表2 通過PPI分析篩選出的10 種糖酵解相關差異表達蛋白Table 2 Differential proteins associated with glycolysis screened by protein-protein interaction (PPI) analysis

從生物信息學分析結果來看，不同ROS水平下PGAM、ENO和PDHB是調控糖酵解反應的關鍵節點蛋白（圖5C）。其中PGAM催化3-磷酸甘油酸反應生成2-磷酸甘油酸，是糖酵解過程中的關鍵酶[30]。近期研究發現，PGAM可作為一種重要蛋白質調節肉的嫩度、色澤、pH值，與乳酸積累呈顯著正相關[31]。Li等[32]指出，高表達的PGAM會在線粒體外膜上積累，導致代謝方式轉變為糖酵解，而當采用蒿甲醚處理抑制PGAM活性時，能夠檢測到糖酵解水平顯著降低[33]。因此，推斷PGAM是調控糖酵解改善嫩度的關鍵蛋白之一。ENO是由ENO1、ENO2等復合的一種多功能蛋白。過量表達的ENO1會激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B及其下游信號，從而上調糖酵解進程[34]。羅建杰[35]利用蛋白質組學研究發現，ENO1、丙酮酸羧激酶2和磷酸甘油酸激酶1的上調增強了肉仔雞的能量代謝水平，在改善肌肉色澤和風味方面發揮重要作用。PDH是丙酮酸還原酶復合物的組成部分，負責催化丙酮酸產生乙酰輔酶A參與三羧酸循環。通過免疫印跡分析表明，脯氨酰羥化酶3可以與PDHB相互作用上調PDH，提高細胞氧化磷酸化途徑的能量代謝水平[36]。

除上述3 個節點蛋白外，ALDH7A1、ALDH3A2、ALDH2同屬于醛脫氫酶，醛脫氫酶是多種酶的復合體，主要存在細胞質、線粒體等位置[37-39]。GO注釋表明分子功能為氧化還原酶活性，可將醛、氧基團中的輔酶I磷酸化為輔酶II，進而調節糖酵解、脂肪酸氧化等途徑。同時，過表達的醛脫氫酶會加快糖酵解和三羧酸循環[40-41]，對肉品質的改善發揮積極作用。有研究指出，醛脫氫酶與ENO相互作用對穩定癌細胞糖酵解途徑的能量供應發揮重要作用[42]。ALDOC作為糖酵解途徑中的關鍵酶，負責催化果糖-1,6-二磷酸向甘油醛-3-磷酸和磷酸二羥基丙酮的可逆轉化。Wang Gang等[43]探究發現，高糖酵解水平下的烯醇化酶會磷酸化蛋白激酶B，進而上調ALDOC等糖酵解酶的表達，改善肉的嫩度。Chang Yuchan等[44]對惡性腫瘤影響因素的轉錄組學分析結果證實了ALDOC與糖酵解信號傳導密切相關，前者的積累會加快乳酸的釋放，促使糖酵解反應提前完成。LHD是調控細胞中乳酸積累的關鍵酶，具有LDHA和LDHB兩種亞型，后者催化丙酮酸鹽轉化為乳酸鹽[45]。Wang Feng等[46]通過生物信息學分析鑒定得到8 個糖酵解相關基因，其中就包括LDHB，這與本研究篩選的關鍵糖酵解差異表達蛋白一致。Jeong等[47]發現，缺氧狀態下LDHB活力顯著升高，促使葡萄糖消耗和乳酸積累加劇，導致pH值下降、糖酵解反應提前完成。上述研究表明調控LDHB對肉嫩度的改良具有重要借鑒意義。而PDHA表達量的下調則會降低丙酮酸和乙酰輔酶A產生還原型輔酶I的速率，進而反向促進無氧糖酵解途徑的能量代謝水平[48]，本研究也證實了這一點。結合上述關鍵差異表達蛋白的調控機制及糖酵解、嫩度的結果，可以推測H2O2處理可促進上述糖酵解通路中關鍵蛋白的表達，進而提升宰后冷藏初期牛肉的糖酵解水平，導致pH值下降速率加快，為牛肉嫩度的改善創造了有利條件。

3 結 論

宰后冷藏初期H2O2處理能夠提高牛肉糖原消耗和乳酸積累速率，使肌肉快速達到極限pH值，縮短宰后僵直期。同時，與對照組和NAC處理組相比，H2O2處理顯著提升了牛肉MFI，顯著降低了牛肉成熟后期的剪切力，說明ROS可通過促進糖酵解發揮改善嫩度的作用。進一步利用蛋白質組學技術研究發現，H2O2處理使牛肉糖酵解通路中的8 種蛋白表達上調、2 種蛋白表達下調，其中以PGAM、ENO、PDHB為核心的8 種上調蛋白與下調的PDHA相互協調，加快糖酵解進程。由此證實，ROS通過調控糖酵解通路中關鍵蛋白質的表達提升牛肉糖酵解水平，進而間接促進肉嫩度的改善。上述機制的發現有助于完善宰后冷藏過程中基于能量代謝的肉品質形成機理，為預測和改善肉品質提供一定的理論依據。