虎杖苷促進大鼠骨質疏松性骨折的作用及對SIRT1/FoxO1信號通路的影響

李明哲 羅國廠 張仲博 岳宗進

1南陽醫學高等?？茖W校,河南 南陽 473000

2河南省中醫院,河南 鄭州 450000

骨質疏松癥是一種全身性骨骼疾病,其特點是骨量低、骨強度受損、骨折風險增加[1]。隨著人口老齡化程度的不斷加劇,骨質疏松癥引發的骨折發生率日益升高[2]。沉默信息調節因子1(SIRT1)/叉頭狀轉錄因子O1(FoxO1)信號通路是與自噬密切相關的通路,也是機體調節炎癥相關的信號通路之一[3]。據報道,SIRT1/FoxO1信號通路可調控炎癥小體發揮對創傷性腦損傷小鼠的神經保護作用[4]。同時,手法治療能夠通過SIRT1/FoxO1信號通路抑制氧化應激和炎癥,延緩大鼠椎間盤衰老[5]。有研究表明,大蒜素能夠通過預防破骨細胞形成、提高抗氧化活性以及激活SIRT1/FoxO1信號通路對鉛誘導的小鼠骨質流失發揮保護作用[6]?；⒄溶帐侵参锘⒄鹊奶崛∥?具有平喘、抗菌、調節激素、抗炎和抗腫瘤的功效[7]。Zhan等[8]研究報道,虎杖苷可促進骨髓間充質干細胞向神經元分化,從而治療脊髓損傷。研究發現,虎杖苷對骨質疏松癥有較好的治療效果,可促進成骨細胞生成來改善骨質疏松[9]。目前關于虎杖苷對骨質疏松性骨折后愈合情況的效果還未見報道,因此本研究基于SIRT1/FoxO1信號通路,探究虎杖苷對骨質疏松性大鼠骨折愈合的療效及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物:SPF級別雌性SD大鼠,8～10周齡,體重245～272 g,購自南京偉沃生物科技有限公司,生產許可證號:SCXK(蘇)2022-0005,所有大鼠均飼養于溫度為(22±2)℃、相對濕度為(60±5)%、自動光/暗交替(12 h/12 h)的飼養房中,自由飲食進水,本研究經南陽醫學高等?？茖W校倫理委員會批準(LZS2022-03-04)。

1.1.2藥物與試劑:虎杖苷(批號RKL1093,原料藥,純度≥98.5%)購自江蘇齊氏生物科技有限公司;阿侖膦酸鈉片(批號20220225)購自成都天臺山制藥有限公司;I型膠原交聯羧基末端肽(CTX-Ⅰ)、骨鈣素(OC)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒、Trizol試劑、反轉錄試劑盒、蛋白裂解液(批號分別為MY-59849、MY-42628、MY-63114、MY-70257、MY-17584、MY-51584、MY-21449)均購自寧波邁躍生物科技有限公司;HE染色試劑盒、PCR試劑盒、BCA試劑盒、ECL發光液(批號分別為BH-10409、BH-12594、BH-15986、BH-24585)均購自濟南博航生物技術有限公司;兔源SIRT1、FoxO1、β-肌動蛋白(β-actin)一抗、羊抗兔二抗(批號分別為BF-11482、BF-20700、BF-10652、BF-24729)均購自杭州比格飛序生物科技有限公司。

1.1.3儀器:雙能X線骨密度儀(型號XYH-1000B)、酶標儀(型號M200Pro)、顯微鏡(型號LW200ET-A)均購自鄭州邦泰生物科技有限公司;小動物X線片機(型號Posvet-100HF)、熒光定量PCR儀(型號ForeQuant F6)、凝膠成像系統(型號BOT-870)均購自山東綠都生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1模型的建立及分組給藥:參照文獻[10]構建骨質疏松性大鼠骨折模型:大鼠適應性喂養一周,經腹腔注射2 %戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉,在無菌條件下切開大鼠背部雙側,摘除雙側卵巢后縫合創口并消毒;另取12只大鼠作為對照組,僅暴露卵巢,不切除。3個月后通過雙能X線骨密度儀檢測大鼠股骨骨密度(bone mineral density, BMD),以去卵巢大鼠股骨BMD與對照組大鼠股骨BMD相比顯著降低且有統計學意義視為骨質疏松模型大鼠構建成功,成功造模48只骨質疏松模型大鼠。用2 %戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉所有大鼠,將其右側股骨皮膚切開,暴露關節面,鋸斷股骨干中段,克氏針固定斷肢,閉合傷口并消毒。將建模成功的48只骨質疏松性骨折大鼠隨機分為模型組、虎杖苷低劑量組、虎杖苷高劑量組、阿侖膦酸鈉組,每組12只。建模結束后,虎杖苷低、高劑量組大鼠分別給予30 mg/kg、60 mg/kg虎杖苷灌胃給藥[11](將虎杖苷和生理鹽水混溶成濃度分別為3、6 mg/mL的混懸液,灌胃體積10 mL/kg);阿侖膦酸鈉組大鼠給予0.5 mg/kg阿侖膦酸鈉灌胃給藥[12](將阿侖膦酸鈉片和生理鹽水混溶成濃度為0.05 mg/mL的混懸液,灌胃體積10 mL/kg);對照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃。各組給藥每天1次,連續8周。

1.2.2大鼠骨折愈合程度評分及骨折處BMD的測定:末次給藥結束后次日,給大鼠拍攝X光片,進行骨折愈合程度評分[13],標準如下:骨折線清晰,無骨膜為0分;骨折處模糊,輕度骨膜反應,無骨痂為1分;骨折處邊緣模糊,骨膜反應淺,少量骨痂生成為2分;骨折處痕跡不明顯,骨痂生成增多,密度增加,邊緣較清晰為3分;骨折處痕跡不可見,骨痂填滿缺損部位,且密度與正常骨組織基本相同為4分。由三位專業人士對X光片進行評判,取平均值為骨折愈合程度評分,評分越高代表骨折愈合程度越好。同時采用雙能X線掃描儀對大鼠骨折處BMD進行測定。

1.2.3大鼠血清中OC、CTX-1、TNF-α、IL-1β水平的測定:用2 %戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠,使用非抗凝管心臟取血3 mL,4 ℃、5 200 r/min條件下離心15 min,取上清于一支新的離心管中,根據ELISA試劑盒說明書中的方法檢測大鼠血清中OC、CTX-1、TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4大鼠骨組織病理學變化檢測:取血后處死大鼠,骨折處取大鼠骨組織,分為兩部分。一部分置于- 80 ℃冰箱中保存;另一部分用4 %多聚甲醛固定24 h,脫鈣,石蠟包埋,切片,HE染色,觀察骨組織病理學變化。

1.2.5大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1信使RNA(mRNA)水平的測定:取1.2.4中大鼠骨組織,加入液氮充分研磨,Trizol法提取骨組織總RNA,逆轉錄為cDNA,運用熒光定量PCR法檢測SIRT1、FoxO1 mRNA水平,內參為GAPDH。引物由杭州比格飛序生物科技有限公司設計合成,引物序列見表1。反應條件和環境參照PCR試劑盒進行配置,通過2-△△Ct法計算靶基因mRNA水平。

表1 引物序列

1.2.6大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平的測定:取1.2.4中大鼠骨組織,加入液氮充分研磨后,加入蛋白裂解液裂解,BCA試劑盒定量總蛋白,電泳分離后轉膜,脫脂牛奶(5 %)在室溫下封膜1 h,加入兔源SIRT1(1∶1 200)、FoxO1(1∶1 500)、β-actin(1∶1 600)一抗4 ℃下孵育過夜,加入羊抗兔二抗(1∶2 400),室溫孵育1 h,ECL試劑顯影,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以β-actin為內參,計算SIRT1、FoxO1蛋白水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 虎杖苷對骨質疏松性骨折大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD的影響

與對照組相比,模型組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD顯著降低(P<0.05);與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組,阿侖膦酸鈉組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD顯著升高(P<0.05);與虎杖苷低劑量組相比,虎杖苷高劑量組、阿侖膦酸鈉組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD顯著升高(P<0.05);阿侖膦酸鈉組和虎杖苷高劑量組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD水平的比較

2.2 虎杖苷對骨質疏松性骨折大鼠血清中OC、CTX-1、TNF-α、IL-1β水平的影響

與對照組相比,模型組大鼠血清中OC水平顯著降低,CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組,阿侖膦酸鈉組大鼠血清中OC水平顯著升高,CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平顯著降低(P<0.05);與虎杖苷低劑量組相比,虎杖苷高劑量組、阿侖膦酸鈉組大鼠血清中OC水平顯著升高,CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平顯著降低(P<0.05);阿侖膦酸鈉組和虎杖苷高劑量組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中OC、CTX-1、TNF-α、IL-1β水平的比較

2.3 虎杖苷對骨質疏松性骨折大鼠骨組織病理學變化的影響

對照組大鼠骨組織骨小梁結構正常;模型組大鼠骨組織的骨小梁變細、數量減少且連續性較差,同時骨小梁間距增寬;虎杖苷低、高劑量組大鼠上述病理學變化程度依次減輕,骨小梁明顯增多且有序排列,有大量成骨細胞;阿侖膦酸鈉組和虎杖苷高劑量組大鼠骨組織病理學變化無顯著差異。見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織病理學變化(HE染色,×200)

2.4 虎杖苷對骨質疏松性骨折大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平的影響

與對照組相比,模型組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組,阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平顯著升高(P<0.05);與虎杖苷低劑量組相比,虎杖苷高劑量組、阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平顯著升高(P<0.05);阿侖膦酸鈉組和虎杖苷高劑量組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平的比較

2.5 虎杖苷對骨質疏松性骨折大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平的影響

與對照組相比,模型組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組,阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平顯著升高(P<0.05);與虎杖苷低劑量組相比,虎杖苷高劑量組、阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平顯著升高(P<0.05);阿侖膦酸鈉組和虎杖苷高劑量組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白印跡圖

圖3 各組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平的比較

3 討論

引起機體骨質疏松的因素較復雜,且目前研究認為機體雌激素水平的失調是導致骨質疏松癥的重要因素之一,當大鼠去掉卵巢后,常常伴隨出現機體激素代謝紊亂、雌激素水平降低,增加骨質疏松的發生率[14]。骨質疏松癥可誘發骨折,當機體成骨細胞功能正常時,骨細胞結構正常,并且排列整齊,由于各種因素引起機體產生骨質疏松時,機體成骨細胞結構和功能發生病理性變化,進而導致BMD的降低,增加骨折的風險[15]。CTX-Ⅰ是破骨細胞活性的標志物,OC是成骨細胞分泌的特異性蛋白,是成骨細胞功能敏感標志,OC和CTX-1水平可有效反應機體的成骨細胞和破骨細胞的活性[16]。TNF-α、IL-1β是反映機體炎癥的常見指標,其水平越高代表炎癥反應越劇烈[17]。本研究結果發現模型組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD、血清中OC水平較對照組顯著降低,CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平較對照組顯著升高。病理學結果顯示,對照組大鼠骨組織骨小梁結構正常,模型組大鼠骨組織的骨小梁變細、數量減少且連續性較差,同時骨小梁間距增寬,表明骨質疏松性骨折大鼠骨折愈合較差,BMD和成骨細胞活性降低,破骨細胞活性和炎癥反應升高。

虎杖苷具有抗休克、保護神經、保護肝臟、免疫調節等方面的作用[18]。Zhan等[19]研究表明,虎杖苷能夠調節涉及破骨細胞和成骨細胞分化和活性的基因,減輕氧化應激和基質金屬蛋白酶活性,以及恢復Wnt/β-連環蛋白信號通路,保護患有慢性脊髓損傷小鼠的骨量流失。Yuan等[20]研究表明,虎杖苷通過促進成骨細胞分化對切除卵巢的小鼠表現出顯著的抗骨質疏松作用。本研究發現使用虎杖苷處理的骨質疏松性骨折大鼠骨組織病理學變化程度減輕,骨小梁明顯增多且有序排列,有大量成骨細胞,同時骨折愈合程度評分、骨折處BMD、血清中OC水平升高,CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平降低,且呈現劑量依賴性,表明虎杖苷具有減輕骨質疏松性骨折大鼠炎癥反應和促進骨折愈合的效果。

SIRT1/FoxO1信號通路是和細胞凋亡、炎癥反應都相關的通路。Chen等[21]研究表明,積雪草酸可能通過激活SIRT1/FoxO1信號通路來減輕高脂肪飲食誘導的小鼠骨質疏松癥,從而抑制氧化應激并促進成骨分化。Jiang等[22]研究表明,白藜蘆醇能通過激活SIRT1/FoxO1信號通路,增強對氧化損傷的抵抗力,從而促進成骨細胞活性。本研究發現,模型組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白水平顯著降低,虎杖苷處理的骨質疏松性骨折大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白水平顯著升高,結合Chen和Jiang等[21-22]的研究,本研究猜測虎杖苷可能通過激活SIRT1/FoxO1信號通路來促進骨質疏松性骨折大鼠的骨折愈合。

綜上所述,虎杖苷可減輕骨質疏松性骨折大鼠炎癥反應,具有促進骨折愈合的效果,其機制可能與激活SIRT1/FoxO1信號通路有關。但是,本研究僅從SIRT1/FoxO1信號通路的角度探究了虎杖苷對骨質疏松性骨折大鼠骨折愈合的效果,其能否通過其他信號通路對骨質疏松性骨折大鼠的骨折愈合產生影響,有待后續研究。