kisspeptin抗骨質疏松癥機制的研究進展

何佩真 李茂婷 于瀾 林靜 周廣舉

川北醫學院附屬醫院內分泌科,四川 南充 637000

最近的一項薈萃分析顯示,根據世界衛生組織的標準,全球骨質疏松和骨量減少患病率分別為19.7%(95%CI：18.0%～21.4%)和40.4%(95%CI：36.9%～43.8%),骨質疏松癥在發展中國家的患病率(22.1%,95%CI：20.1%～24.1%)高于發達國家(14.5%,95%CI：11.5%～17.5%)[1]。隨著全球人口老齡化的增加,這種疾病帶來的全球經濟和健康負擔也日益加重。在過去30年中,對骨質疏松癥發病機制的了解和治療該病藥物的開發都取得了顯著進展。作為骨質疏松癥的治療手段,補充鈣和維生素D是必須的,同時目前可選用的藥物主要包括:雌激素、選擇性雌激素受體調節劑(如雷洛昔芬)、降鈣素、4種雙膦酸鹽(阿侖膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸和唑來膦酸)、針對核因子-κB (nuclear factor,NF-κB)配體的受體激活的人單克隆抗體(地舒單抗)和甲狀旁腺素類似物(特立帕肽)等[2]。但上述藥物的不良反應不容忽視。研究表明雌激素有明顯的不良反應,包括心腦血管事件、血栓栓塞事件和患乳腺癌風險的增加[3]。同樣,對于選擇性雌激素受體調節劑來說,盡管雷洛昔芬被批準用于骨質疏松癥的同時可預防和治療乳腺癌,但它增加了潮熱和靜脈血栓栓塞的發生率[4]。考慮到長期使用降鈣素可能會增加患癌風險,且鑒于其作用機制,降鈣素常導致低鈣血癥,低鈣血癥會引發手足抽搐、心臟停搏等不良事件,所以降鈣素現在很少用于治療骨質疏松癥[5]。雙膦酸鹽是目前治療骨質疏松癥使用最廣泛的藥物,但限制其使用的主要問題是罕見的不良反應,如非典型股骨骨折和下頜骨壞死[6]。特立帕肽可能有患骨肉瘤的潛在風險[7]。雖然地舒單抗對不同年齡、不同腎功能情況,或有脆性骨折史的患者是安全的,但地舒單抗仍有可能誘發肌肉骨骼疼痛、低鈣血癥、下頜骨壞死等不良反應[8]。因此,考慮到除雌激素和雄激素以外的生殖激素對骨生理學的新興作用,以及迫切需要開發新型、安全和有效的治療藥物來預防老齡人群的骨折。最新一些研究表明,kisspeptin可刺激成骨細胞分化以及抑制破骨細胞,因此其可能具有抗骨質疏松臨床治療潛力。本文就其發揮作用的可能分子機制綜述如下。

1 kisspeptin與骨質疏松癥

骨骼穩態受到骨重建過程的嚴密調控,保持最佳的骨量和強度,在骨重建過程中,破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成之間的平衡維持著骨量,骨質疏松癥是由骨吸收和骨形成之間的平衡紊亂造成的,這種平衡紊亂常見的原因之一是性激素的缺乏(主要是雌激素)[9]。因此,改善這種骨形成與骨吸收平衡紊亂是開發預防和治療骨質疏松癥的新型治療藥物的基石[10]。kisspeptin 是指位于染色體1(1q321q34)長臂上的cDNA上的KISS1基因編碼的一類內源性肽,由145-氨基酸前體蛋白水解而來,在人體循環中已經鑒定出4個循環片段:kisspeptin-54,-14,-13和-10,這些片段共享 kisspeptin-54分子的 C 末端區域[11-12]。KISS1受體(KISS1 Receptor,KISS1R)是一種 G 蛋白偶聯受體,kisspeptin-10與G蛋白偶聯受體54(G-protein-coupled receptor 54,GPR54)結合[12],GPR54通過活化的 T 細胞c2(Nuclear factor of activated T-cells,NFATc2)和特異性蛋白1(specific protein,sp1)的核因子調節骨形態發生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)的表達,并在胚胎腎臟分支形態發生和腎小球發育中起重要作用[13]。kisspeptin 位于下丘腦-垂體-性腺軸的頂端,由下丘腦KISS1神經元分泌,其與KISS1R結合后激活促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)的釋放,以脈沖方式將GnRH分泌到局部垂體-門靜脈循環中。隨后,GnRH負責刺激促性腺激素[黃體生成素(luteinizing hormone,LH)和卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)]的生物合成和分泌,這些促性腺激素從腦垂體前葉系統循環到達性腺,以促進性類固醇[雌二醇(estradiol,E2)、睪酮(testosterone,T)和孕酮(progesterone,P)]的釋放。研究已證實影響KISS1R (或 kisspeptin本身)的失活突變可導致人類和嚙齒動物的中樞性性腺機能減退而導致生殖系統障礙[14-16]。KISS1基因對骨代謝的影響常通過已知的下丘腦-垂體-性腺軸發揮作用,如功能性下丘腦閉經的缺陷之一是 kisspeptin分泌減弱導致下游促卵泡激素和黃體生成激素分泌不足,無法維持正常的月經周期,最終導致雌激素缺乏和對骨骼動態平衡的不利影響[17]。但最近在小鼠中的數據表明,kisspeptin通過在小鼠成骨細胞上表達的 KISS1R可直接促進體外成骨細胞分化,這表明kisspeptin可能對骨骼穩態有直接的有益作用,且該作用獨立于它對下丘腦-垂體-性腺軸刺激下游性類固醇水平升高而間接影響骨平衡的作用[18]。

2 kisspeptin抗骨質疏松的機制

2.1 刺激成骨細胞分化相關基因表達

成骨細胞主要由間充質干細胞分化而來,形成蛋白質性骨基質,并協調這種細胞外基質的礦化[19],分化受一系列激素和細胞因子的控制,成骨細胞表達各種表型標志物,如BMP、遠端同源異構體5 (distal-less homeobox 5,Dlx5)、runt相關轉錄因子2 (runt-related transcription factor 2,Runx2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨鈣素(osteocalcin,OC)[20-21]。最近的一項實驗通過在BMP-2刺激下,整合素和鈣粘蛋白協同工作使C2C12成肌細胞的成骨細胞譜系向骨細胞分化證實了BMP-2對成骨細胞組織分化至關重要[22],BMP2通過激活Smad蛋白1/5/9 (drosophila mothers against decapentaplegic protein1/5/9,Smad1/5/9)調節成骨細胞分化的早期階段,如 Dlx5和 Runx2[23-24],這些因子也刺激下一階段成骨過程中標志物的表達,包括ALP和OC[25]。

同時,先前的研究表明,在T細胞中被發現的NFAT轉錄復合體,包括5種亞型,分別為NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4和 NAFTc5[26],鈣調磷酸酶/NFAT信號通路參與調節成骨細胞增殖、破骨細胞分化以及骨形成和骨吸收的協調[27]。

一項體外研究通過檢測KISS1在3種骨肉瘤細胞系(MG-63、Saos-2和 U-2 OS)和正常成骨細胞系(hF-OB 1.19)中的表達水平觀察到KISS1信使 RNA和蛋白質在正常成骨細胞系中的表達均高于3種骨肉瘤細胞系[28],表明KISS1可能通過加速細胞凋亡和自噬的過程,在體外抑制骨肉瘤的增殖[29]。在此前研究的基礎上,另一項體外研究[18]證明了在小鼠間充質干細胞中,kisspeptin-10劑量依賴性地通過 GPR54/NFATc4信號級聯調節BMP2表達和活化,隨后通過BMP2誘導的Smad1/5/9磷酸化增加早期成骨標志物基因的表達,如Dlx5和 Runx2。相反,在KISS1R缺失細胞中,成骨細胞分化被抑制。除了BMP2外,kisspeptin信號傳導還通過轉錄因子NFATc2和Sp1來調節BMP7的表達[13]。

最新的一項在26名健康男性[年齡(26.8±5.8)歲,體質量指數(23.8±2.3) kg/m2]中進行的隨機、雙盲、安慰劑對照的雙向交叉研究中[30],每人參加2次研究訪問,1次靜脈內給予 kisspeptin[1 nmol/(kg·h)],1次靜脈內給予安慰劑,從安靜休息30～90 min,每30 min采集一次血樣,結果證實了與安慰劑相比,kisspeptin在這個短期給藥實驗時間過程中引起總OC水平最大增加20.3%,且其中在骨重塑中占主導地位的羧化OC水平最大增加24.3%,研究者指出kisspeptin的這種給藥方案引起循環kisspeptin水平顯著增加,但下游FSH或T水平沒有顯著變化,證實了這種劑量下的 kisspeptin在體內的生物活性,且排除了這些下游性類固醇作為可能的混雜因素的變化。而此前的研究已經確定kisspeptin通過激活成骨細胞上的kisspeptin受體來誘導小鼠的成骨細胞分化,從而觸發NFATc4介導的 BMP2表達和激活,也刺激下一階段成骨過程中標志物如ALP的表達。這項最新的隨機雙盲對照研究同樣也觀察到kisspeptin可使人骨髓間充質干細胞的ALP水平提高41.1%。綜上所述,這些數據證實了kisspeptin可直接在體外刺激增強成骨細胞的分化,并且在短期內增加健康男性骨合成代謝骨標志物OC、ALP,表明了其對人類的成骨作用。

2.2 抑制破骨細胞的骨吸收

破骨細胞是參與骨吸收的主要功能細胞。它們是單核巨噬細胞系統中的粒細胞-巨噬細胞集落,由單核細胞前體在骨髓基質細胞分泌的各種因子的作用下融合形成多核體,然后進一步分化成具有活性的破骨細胞[31]。最近的研究表明,破骨細胞可以在體內進行分裂,產生較小的細胞,稱為“骨形態”,可以“再循環”與其他細胞融合,形成新的破骨細胞[32]。破骨細胞的分化主要受到核因子NF-kB配體(nuclear factor KB receptor activator ligand,RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MSCF)的受體激活劑的刺激[33]。研究表明,破骨細胞具有間歇性(形成圓形凹陷)或連續性(形成細長的溝槽)的骨吸收模式[34]。

在破骨細胞從CD14+單核細胞到成熟的破骨細胞的分化過程中,KISS1R信使RNA均可檢測到,這表明KISS1信號不僅在成骨細胞上表達,在破骨細胞中同樣起著作用[35],此前的研究通過每個骨表面侵蝕表面的百分比來評估破骨細胞活性[34]。在此基礎上盲法計數受侵蝕的牛骨切片評估kisspeptin表現出對破骨細胞活性的抑制作用與在人類男性供體的破骨細胞中觀察到的抑制作用是一致的,研究表明在最高劑量下(10 nmol kisspeptin)破骨細胞抑制率從29.6%(0.01 nmol kisspeptin)到48.1% (10 nmol kisspeptin)可于破骨細胞單核共培養物的顯微鏡下清楚地觀察到抑制效果,與此相一致的是,該項研究同時考慮到破骨細胞/成骨細胞共培養物更能密切地代表體內骨重塑環境,從26.2% (0.1 nmol kisspeptin)到53.4% (10 nmol kisspeptin),這更加表明了kisspeptin的劑量依賴性抑制破骨細胞的作用[30],將其與使用標準的5 mg唑來膦酸治療后預期的破骨細胞活性相比,兩者對破骨細胞抑制水平相似[35]。但KISS1及其受體抑制破骨細胞活性與經典的RANKL及MSCF刺激破骨細胞分化通路的聯系尚不清楚,還需進一步研究。

2.3 抑制雌激素受體α

破骨細胞及成骨細胞上均有雌激素受體α(estrogen receptor-α,ERα)表達,雌激素通過與ERα結合抑制破骨細胞的骨重吸收,促進成骨細胞的骨形成[36]。但另一方面,在內側基底下丘腦(medial basal hypothalamus,MBH)內,ERα同樣高度富集于兩個解剖學和功能上不同的神經元簇,即弓狀核(arcuate nucleus,ARC)和腹內側下丘腦(ventroMedial hypothalamus,VMHv1)的腹側區域,研究人員使用腦特異性的Nestin-Cre的小鼠模型去除ERα信號后小梁骨量的適度增加表明了中樞雌激素信號傳導似乎對女性骨代謝產生負面影響[37-39]。

最近一項關鍵研究結合了不同的、針對中樞ERα的小鼠模型和立體定向手術,表明在小鼠下丘腦ARC中刪除ERα信號可以導致骨量顯著增加,且效果是性別特異性的(僅在雌性小鼠中發生),在Esr1Nkx2-1cre小鼠模型中,ERα 在包括ARC和VMHv1在內的男性和女性大腦的整個MBH中被有效地去除,年長雌性與對照同窩動物相比,小梁骨量和微架構顯著增加,表現出股骨遠端骨量增加約500%,骨量體積/組織體積從11%上升到52%。并且值得注意的是,在老年雌激素缺乏的女性ARC中選擇性地去除ERα的骨表型可導致骨密度顯著增加約50%,這表明循環雌激素或垂體激素水平升高不是這種性別依賴性骨表型的主要驅動因素,這同時提示絕經后骨量丟失的可能治療途徑[39]。研究人員將去除 KISS1細胞中的 ERα與上述骨表型對比,骨密度顯著升高超過了所有年齡的雌性骨表型觀察到的骨量,得出結論,特異性表達KISS1的下丘腦細胞中ERα的缺失觸發強大的雌性高骨量表型是由于激活了ERα-腦-骨通路,通過抑制下丘腦kisspeptin神經元中的雌激素信號,促進小鼠的骨骼致密,這同時證實了kisspeptin對骨的作用獨立于循環雌激素水平[40]。

3 總結與展望

kisspeptin獨立于下丘腦-垂體-性腺軸在體外促進成骨細胞生成并有效抑制破骨細胞活性的能力使其有作為治療骨質疏松癥和相關骨疾病的新療法的治療潛力。越來越多的動物實驗及臨床研究表明,kisspeptin對骨骼產生的總體效應是有益的。但目前臨床研究的一個局限性是參與者是健康的年輕男性,而骨質疏松癥患者往往比目前臨床研究中的患者年齡更大,因此可能成骨細胞活性及分化能力下降,另一局限性是給藥時長較短,因此,還需要更進一步的臨床研究來確定 kisspeptin 對不同年齡和骨質疏松癥患者骨代謝的影響,以及研究更長時間的慢性給藥對成骨細胞的影響且如何避免對下游性腺激素的影響,因為下丘腦-垂體-性腺軸激素本身之間復雜的相互關系使得在實驗上很難分離它們。盡管明確的機制和途徑數據仍有待完全確定和復制,但總的來說,kisspeptin抗骨質疏松癥的臨床應用前景還是令人期待的。