成骨細胞介導的相關信號通路在老年骨質疏松癥中的研究進展

周坤 林劍 莫亞峰 湯樣華*

1.浙江中醫藥大學附屬江南醫院/杭州市蕭山區中醫院,浙江 杭州 311201

2.浙江康復醫療中心,浙江 杭州 310052

老年骨質疏松癥(senile osteoporosis,SOP)是一種主要表現為骨量減少、骨小梁結構退化,導致骨的脆性增加,出現骨痛及腰背痛、駝背、易發骨折等癥狀的代謝性骨病[1]。并且隨著人口老齡化程度的加劇,骨質疏松癥的發生率也明顯上升。據統計[2],2050年我國骨質疏松癥患者將從2019年的6 000萬增加到1.2億以上。因此,SOP病理機制的研究對SOP的有效防治具有重要的社會價值和意義。目前研究已證實,骨形成和骨吸收失衡導致的骨量減少是SOP的主要病理機制,其中骨形成過程中又與成骨細胞增殖、外基質成熟、骨基質礦化障礙密切相關,而且可能涉及成骨細胞與不同相關信號通路之間的相互關聯,但具體作用機制尚不明確。本文就成骨細胞及其介導的相關信號通路在SOP中的作用機制進行總結,以期為SOP的病理機制研究和治療提供新的思路。

1 成骨細胞介導的骨形成與SOP的相關性

成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收是維持骨量動態平衡的關鍵因素。研究表明骨形成小于骨吸收,致使骨代謝處于負平衡狀態、導致骨量減少是OP主要的發病機制,其中骨形成障礙是老年骨質疏松癥的重要原因[3]。骨形成包括成骨細胞增殖、外基質成熟、骨基質礦化3個過程。在整個成骨細胞骨形成過程中,Wnt/β-catenin、Hedgehog、BMP-2/Smad、PI3K/AKT等是骨形成過程中主要調控信號通路,骨形成蛋白(BMP)、骨特異性堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、I型膠原蛋白(COL-1)、骨橋蛋白(OPN)等相關因子是骨形成過程中的重要參與因子。在成骨細胞增殖過程中,各種原始細胞分化為成骨細胞,體內BMP-2/smad信號通路是此過程的關鍵通路,BMP-2不僅能夠有效增加成骨細胞數量,還能與Wnt/β-catenin、Hedgehog通路產生協同作用以提高ALP的活性,而ALP活性的高低與下階段成骨細胞分化程度呈正相關[4]。另外Wnt/β-catenin通路抑制間充質干細胞分化為脂肪細胞,從而增加成骨細胞數量。在外基質形成與成熟過程則以Runx2為關鍵因子,Wnt/β-catenin、hedgehogBMP-2/Smad等通路通過下游因子Runx2調控成骨細胞增殖并分泌COL-1,大量累積的COL-1與其他細胞、因子共同作用,促進骨基質的合成與骨雛形的形成,同時ALP和COL-1共同促使成骨細胞外基質成熟,為其他基質組分如羥基磷灰石的沉積提供有機支架[5]。在骨基質礦化過程中,Runx2相關信號通路如Wnt/β-catenin、BMP-2/Smad、PI3K/AKT等參與成骨細胞分化成熟且促進分泌骨礦化調節劑OCN,當有機支架富含OCN時,大量ALP通過分解磷酸酯中的無機磷,同時BMP-2/Smad等信號通路調節OPN等因子促使成熟外基質中的羥基磷灰石沉積,促進基質發生礦化,礦物質沉積促使骨質形成[6-7]。臨床及相關實驗研究證實骨形成過程中的任何階段受阻,都有可能引起骨形成障礙從而導致骨質疏松的發生。Xue等[8]通過抑制骨質疏松模型大鼠成骨細胞增殖過程,發現其ALP活性降低,成骨細胞分化減弱,大鼠骨質疏松程度加重。Paschalis 等[9]在臨床研究中發現藥物治療可誘導骨質疏松癥患者外基質成熟與骨基質礦化,提高骨強度,改善骨質疏松。對于老年人群,細胞衰老、營養狀況等因素會導致成骨細胞、骨髓細胞和骨祖細胞等活性減少,影響外基質成熟與骨基質礦化等骨形成過程,從而導致SOP的發生[10]。

2 成骨細胞介導的相關信號通路與SOP的發生、發展

2.1 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt/β-catenin通路在骨穩態和骨修復中起著重要作用。Wnt蛋白由19個分泌糖蛋白組成,具有調控細胞生長、分化和凋亡的功能[11]。Wnt蛋白、卷曲受體(Frizzled)和低密度脂蛋白受體相關蛋白5或6(LRP5/6)發生結合,形成Wnt-FZF-LRP5/6復合體,復合物形成后,LRP5/6的羧基端與Axin結合,從蛋白復合體中釋放β-catenin,使GSK-3β無法磷酸化β-catenin,GSK-3β的失活誘導β-catenin的細胞質積累,然后易位到細胞核并激活T細胞因子/淋巴增強因子(TCF / LEF)家族,激活β-catenin的轉錄[12]。激活后的Wnt/β-catenin發出信號,通過包括干細胞更新、誘導成骨細胞生成以及抑制成骨細胞凋亡等多種機制促進成骨[13]。

已有研究證實,Wnt/β-catenin信號通路在調控成骨過程中,Wnt3a、Wnt6、Wnt10a、Wnt10b、Wnt5A和β-catenin是必需的關鍵成分,缺失可導致骨質減少[14-15]。Wnt信號傳導通過抑制脂肪生成轉錄因子、增強子結合蛋白α和過氧化物酶體增殖物激活的受體γ(PPARγ)來維持前脂肪細胞處于未分化狀態[16]。在早期研究中,Wnt10b因子已被證明是骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)的命運調節劑,Wnt10b的異位表達可以抑制脂肪生成轉錄因子從而抑制BMSC分化為脂肪細胞,使更多的BMSC向成骨細胞分化[17]。后續研究中發現,Wnt信號通路中Wnt6、Wnt10a也有相似的作用[18]。近期發現,Wnt6、Wnt10a在刺激BMSC分化為成骨細胞時,實驗底物中ALP、OCN、成骨細胞特異性轉錄因子(Osx)表達明顯提高,這些因子都是骨形成過程中的關鍵因子,間接證明了wnt/β-catenin信號通路可以促進成骨細胞分化、增殖和礦化活動[19]。隨著研究深入,實驗底物中ALP、OCN的表達含量上升或許歸功于BMP,相關研究證明BMP-2通過誘導Wnt1、Wnt3a、Lrp5表達和抑制β-TrCP的表達來促進規范Wnt信號傳導[20]。與之相對應的是Wnt3a激活Wnt信號傳導或β-catenin/TCF4的過表達又可以刺激了BMP-2的轉錄,這代表著BMP和Wnt/ β-catenin在成骨細胞分化和成熟期間存在相互合作的關系。盡管Wnt /β-catenin信號通路與BMP協調可以表現出更強的調節成骨分化的能力[21],但是BMP-2的轉錄調控是復雜的,涉及多種途徑如hedgehog、PTH / CREB信號通路,這些途徑與Wnt信號通路在控制成骨細胞分化和骨穩態方面發生干擾。故Wnt/β-catenin信號通路與BMP之間的調控關系仍需進一步研究。此外,Wnt/β-catenin通路激活過程中TCF-1與Runx2調節區域結合,可通過Runx2來促進骨形成。Yang等[22]在近期實驗中發現Wnt7a過表達增加了Runx2啟動子活性,提高OCN分泌,促進骨基質礦化。

綜上表明,Wnt/β-catenin信號通路對SOP骨形成過程的作用主要為以下3個方面:(1)直接抑制BMSC分化為脂肪細胞,促進BMSC分化為成骨細胞;(2)與BMP協同作用增強ALP等成骨關鍵因子活性,促進成骨細胞分化、增殖和礦化活動;(3)通過調節關鍵的成骨調節因子Runx2調節成骨分化。

2.2 Hedghog信號通路

Hedgehog是一種高度保守的分泌性糖蛋白,負責調節胚胎發育、細胞增殖分化以及維持組織穩態。Hedgehog同源蛋白分為Shh、Ihh、Dhh三類,其中shh、ihh對成骨分化具有重要作用。Hedgehog信號通路主要由Hedgehog配體、Ptched受體、Smo受體、Gli轉錄因子等組成。Hedgehog配體在跨膜轉運蛋白的幫助下從細胞中釋放出來,使hedghog與ptched受體結合,解除ptched對Smo的抑制,促進Smo釋放Gli轉錄因子,進而激活Hedgehog信號通路[23]。研究表明,Shh通過提升Gli2轉錄刺激BMP-2表達以增強成骨細胞分化[24]。Wu等[25]通過特定方式將Shh移植到BMP-2的培養基上,觀察到相較于沒有BMP-2的培養基大鼠成骨細胞分化的能力更突出。Jiang等[26]的實驗發現激活Shh信號通路后,大鼠體內BMP表達水平明顯升高,同時ALP活性與基質礦化結節的數量增加。Ihh可以抑制PTHrP生成,并與其形成負反饋調節,控制Ihh的過度表達,抑制骨和軟骨內的過度發育,確保成骨處于動態平衡狀態,從而達到促進骨基質礦化,增強骨形成的能力[27]。

另外,目前主流觀點認為Hedgehog信號通路還通過干預Runx2表達對骨形成起促進作用。如AlMuraikhi[28]發現用Smo拮抗劑抑制Hedgehog信號通路后,小鼠體內Runx2和 Osx的表達同時減低,小鼠成骨細胞分化、礦化等功能受到抑制。Moon等[29]研究也發現,Hedgehog拮抗劑Cyclo有效地抑制了成骨細胞的分化,而促進劑則增加了Runx2及骨骼生成標志物ALP的表達,并增強了小鼠外基質礦化能力。Wang等[30]通過激活hedgehog受體調節Gli1表達,強化了Runx2表達,同樣使ALP數量及鈣結節形成增加。此外,成骨細胞抑制劑PTH相關肽(PTHrP)可以抑制早期Hedgehog與BMP誘導的成骨作用,并在間接反應中阻止Runx2表達的上調,導致OCN分泌減少,基質礦化受阻。

綜上表明,激活的Hedgehog信號通路對SOP骨形成作用主要分為以下3個方面:(1)與BMP協同作用影響間充質干細胞分化成骨細胞;(2)通過提高Runx2和Osx的表達,調節COL-1與ALP含量,促進成骨細胞外基質形成與骨基質礦化;(3)與PTHrP形成負反饋調節,抑制骨與軟骨過度發育,促進骨形成。進而表明Hedgehog信號通路對骨形成三個階段都有相關調節作用,是防治SOP的可能目標通路。

2.3 BMP-2/Smad信號通路

BMP屬于轉化生長因子-β(TGF-β)家族的最大成員,BMP通過與I型和II型的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體相互作用來發揮其生物學功能。來自I型受體的信號,當被II型受體磷酸化時,被各種分子傳遞到下游底物,通過Smad信號傳導激活靶基因。在BMP和TGF-β信號由細胞膜傳遞至細胞核的過程中,Smad蛋白起到了關鍵性的作用。活化的I型受體進一步磷酸化Smad蛋白,促使Smad分子從細胞膜受體上脫離下來,并在胞質內結合Smad4分子然后將復合物易位到細胞核中,與其他核輔助因子如ALP一起調節靶基因的轉錄,同時觸發Runx2轉錄[31-32]。

現有研究證實BMP是成骨細胞分化的關鍵蛋白,其中BMP-2又是最有效的細胞因子之一,并能誘導骨形成[33]。若BMP-2因子缺失將導致超過90 %的突變間充質祖細胞保持未分化。BMP-2還能顯著增加骨橋蛋白基因表達,誘導基質成熟,調節細胞外基質中的羥基磷灰石沉積。宋敏等[34]利用特定中藥相關物質激活BMP-2/Smad信號通路,發現激活組與對照組相比大鼠OPN基因顯著表達,成骨標志蛋白BMP、COL-1顯著增加。在促進成骨過程中,BMP-2通過激活Smad信號傳導觸發Runx2的轉錄來調控骨形成不同階段。已有大量實驗證實了BMP-2/Smad信號通路的相關作用機制,如柴姍等[35]通過動物實驗發現,抑制BMP-2/Smads信號通路時,大鼠體內凋亡骨細胞數量增加;而上調大鼠BMP-2、Smad1和Smad5的表達時,大鼠體內Osx和Runx2的表達明顯升高,表明BMP-2/Smad可能通過Runx2進一步調控其下游產物如ALP、COL-1和OCN,從而達到調節骨形成的作用。Feng等[33]的實驗也發現,刺激BMP-2/Smad信號通路,OP小鼠模型血清中骨形成關鍵因子Runx2和Osx的mRNA水平升高。Runx2及其下游因子Osx的表達對成骨細胞分化至關重要,Osx是一種含鋅指的轉錄因子,在成骨細胞和軟骨細胞中表達,是成骨細胞分化的早期和晚期標志物,若Osx表達缺失將導致成骨細胞分化受阻,骨形成障礙。肖銳等[36]發現抑制BMP-2/Smad信號通路能夠降低OCN和ALP水平,同時下調相應蛋白質濃度,減弱ALP的染色效果,并持續抑制外基質礦化及鈣化結節生成。

綜上表明,BMP-2/Smad信號通路對SOP骨形成作用主要通過以下3個方面:(1)促進BMSC分化成骨細胞;(2)增加OPN表達促進外基質成熟與礦化;(3)調節Runx2與Osx促進骨形成全過程。

2.4 PI3K/AKT信號通路

PI3K/AKT信號通路由一系列膜受體和生長因子激活,并在細胞能量代謝、細胞質運動和細胞周期進展中發揮關鍵作用,是許多系統中調節骨再生過程的關鍵信號通路。在信號通路中PI3K將膜磷脂肌醇-4與5-二磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸鹽,PI3K被磷酸化后通過招募PDK1激活下游分子AKT,PI3K/AKT激活后通過抑制信號底物GSK-3β穩定β-catenin并使其易位到細胞核中進行基因轉錄并生成兩種轉錄因子Runx2和osterix,其加速成骨細胞分化[37-38]。另外活性FoxO可以與β-catenin競爭TCF從而使Wnt信號通路激活減弱,而AKT激活后能磷酸化FoxO的Thr-24,Ser-25和Ser-319位點,促使磷酸化后的FoxO與銜接蛋白14-3-3結合,促進FoxO向細胞質聚集及降解,從而使得FoxO喪失活性,促進Wnt的骨形成作用[39]。

PI3K/AKT信號通路可促進成骨細胞分化。LI等[40]的實驗證明利用arctigenin激活PI3K/AKT信號通路后,其通過調控PPARγ表達,成骨細胞分化能力得到加強,并且實驗底物中Ca和P丟失減少,實驗小鼠骨密度增強。PI3K/AKT信號通路還能通過β-catenin調控Runx2和osterix達到調節骨形成的作用。最新研究發現,巨噬細胞MSR1在脛骨單皮質缺陷模型小鼠中通過介導的PI3K/AKT信號通路,增加了模型小鼠體內ALP與Runx2的活性,使成骨標記基因COL-1與OCN的mRNA表達水平大幅升高,促進成骨分化的能力[41]。此外PI3K/AKT在BMP-2/smad信號通路促進骨形成過程中起重要作用。DONG等[42]做的最新體外實驗證明PI3K選擇性抑制劑LY294002阻斷PI3K信號通路后,BMP2誘導的成骨細胞生成被阻斷,外基質成熟與礦化受阻,同時發現另一相關因子PTEN阻斷BMP-2信號通路后PI3K/AKT信號通路被激活,骨形成得到促進 。在機體氧化應激時PI3K/AKT可以抑制FoxO達到促骨形成。AKT磷酸化FoxO的關鍵位點,使FoxO降解失活,抑制其對Wnt信號通路的競爭作用;并且AKT還能夠磷酸化FoxO3a,阻止其向細胞核聚集,使得反式激活其下游靶基因成骨細胞中的前凋亡分子遭到破壞,進而抑制了成骨凋亡[43]。

綜上表明,PI3K/AKT信號通路對SOP骨形成作用主要通過以下4個方面:(1)調控PPARγ的表達,促進骨前體細胞向成骨細胞分化;(2)通過直接通過Runx2促進成骨細胞分化、增殖與礦化:(3)協同BMP維持BMP-2/smad信號通路活性以促骨形成;(4)抑制FoxO因子使Wnt/β-cantenin信號通路促骨形成功能正常。

3 結語與展望

促進骨形成是防治SOP的重要途徑之一,明確骨形成過程中成骨細胞與SOP的相關性及其相關信號通路的調控作用機制,具有重要研究意義。目前調控成骨細胞的相關信號通路主要有Wnt/β-catenin、Hedgehog、BMP-2/smad、PI3K/AKT,本文闡述了成骨細胞介導這些信號通路在老年骨質疏松中調控成骨的作用機制,證實了成骨細胞及其介導的信號通路在骨質疏松癥發病進程中的作用,對SOP的防治具有重要的臨床價值,或將為SOP的臨床治療提供新的靶點。但是各條信號通路對成骨細胞的協同調控作用機制仍未被完全揭示,是否可通過多條信號通路共同調控成骨細胞促進成骨防治SOP,是否因其對關鍵轉錄因子(如Runx2)的不同調節作用而產生治療效果的差異,尚待進一步研究。