外泌體非編碼RNAs在骨質疏松癥中的研究進展

婁純彪 蔡武勝 呂浩 魏傳付 李志超 曹慧*

1.山東中醫藥大學,山東 濟南 250000

2.菏澤市第三人民醫院,山東 菏澤 274000

3.山東中醫藥大學附屬醫院,山東 濟南 250000

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種慢性全身性骨骼疾病,由正常情況下嚴格調節的骨穩態失衡所引起,其特征是源自骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨細胞(osteoblasts,OB)骨形成減少與源自造血干細胞的破骨細胞(osteoclasts,OC)骨吸收增加,導致骨密度降低以及骨折風險增加[1]。目前,診斷OP的首選技術是雙能X射線吸收測定法(dualenergy X-ray absorptiometry,DXA)掃描[2],雖然DXA很有價值,但由于特異性和敏感性有限,只能揭示已經確定的骨骼結構變化,而無法區分導致相同骨病理狀況的不同潛在原因[3]。同時,目前可用的抗再吸收和合成代謝藥物僅導致骨礦物質密度適度增加和非椎體骨折率適度降低,未滿足患者對更有效抗OP方法的需求[4]。因此,盡管OP的管理策略在過去幾年中取得了一些進展,但導致OP的復雜分子機制以及潛在生物標志物和治療靶點的缺乏阻礙了其預防和治療的改進[5]。

外泌體是直徑為40～100 nm的圓盤狀囊泡,作為細胞間天然高效的運輸載體,通過配體-受體相互作用、內吞作用、直接膜融合或信號通路傳導將其包含的多種生物活性分子遞送至靶細胞[6-7]。值得注意的是,非編碼RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)也存在于外泌體中,其主要由微小RNAs(micro RNAs,miRNAs)、長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)和環狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)組成,作為骨穩態調節因子在OP中發揮了至關重要的作用[8]。鑒于外泌體ncRNAs在眾多疾病中發揮出的治療潛力,外泌體ncRNAs可能成為探索OP發病機制和治療方法的新型生物標志物和潛在治療靶點。因此,本文總結了外泌體ncRNAs在OP中調控BMSCs成骨分化、OB骨基質礦化、OC骨吸收、骨相關細胞活性和凋亡以及血管生成方面所發揮的作用,以確定與OP相關的外泌體ncRNAs的最新研究成果、潛在應用和挑戰。見圖1。

圖1 外泌體ncRNAs在OP中的調控機制

1 外泌體ncRNAs調控成骨分化

作為OB和脂肪細胞的共同祖細胞,BMSCs在骨穩態、組織再生和整體能量穩態中發揮著關鍵作用[9]。在衰老過程中,BMSCs會降低分化為OB的能力,但會增加分化為脂肪細胞的能力,這會造成骨質流失從而導致OP[10]。因此,促進BMSCs成骨分化,恢復骨內穩態平衡是OP防治研究的方向之一。Li等[11]發現源自正常BMSCs的外泌體在體內改善了卵巢切除術(OVX)大鼠OP癥狀,在體外則促進了OVX大鼠BMSCs的增殖和成骨分化,其機制與miR-186在外泌體中高表達并靶向抑制單極紡錘體結合蛋白1(mps one binder kinase activator protein 1,Mob1)表達有關。與之相反,Jiang等[12]發現從OP患者中提取的間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源的外泌體中miR-21表達明顯高于健康成人,用來自OP患者的外泌體處理的MSCs中成骨分化標志物Runt相關轉錄因子2(Runx2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)表達顯著降低。同時,Smad同源物7(SMAD7)被證實為miR-21直接靶點,在OP患者中下調,而SMAD7的過表達抑制ALP、OCN和Runx2表達,證明了從OP患者中提取的MSCs衍生的外泌體miR-21通過靶向SMAD7從而抑制BMSCs成骨分化。

此外,Feng等[13]觀察到絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)患者血清中分離的外泌體中circ_0006859表達較健康患者明顯上調,進一步研究發現circ_0006859過表達可以抑制OCN和ALP水平,促進脂肪形成標志物轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBPα)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的水平,其作用機制是通過作為miR-431-5p的內源競爭RNA(ceRNA),促進miR-431-5p靶基因Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)表達實現的,表明外泌體circ_0006859是PMOP的潛在生物標志物,并通過海綿化miR-431-5p調節BMSCs中成骨和脂肪形成之間的平衡。

2 外泌體ncRNAs調控OB骨基質礦化

OB是來自BMSCs的長方體細胞,負責產生并維持骨骼結構,為骨基質產生膠原蛋白(主要是Ⅰ型膠原),并調節隨后的基質礦化,在體內合成與礦化基質相關的非膠原蛋白(包括唾液酸蛋白、OPN、OCN),而且通過分泌細胞因子或通過直接細胞接觸對OC的分化和活性造成影響[14-16]。OB譜系的發育和功能受到多種因素影響,ncRNAs作為主要因素之一,被認為在OB增殖、分化、骨基質礦化、活性和凋亡方面發揮重要作用[8]。最新的幾項研究探討了不同細胞衍生的外泌體和其攜帶的ncRNAs在調節OB骨基質礦化中的作用。Zhang等[17]報道了攜帶miR-935的BMSCs衍生的外泌體與OVX大鼠的相關性,其通過將miR-935遞送到人成骨細胞系hFOB1.19中從而靶向并抑制信號轉導和轉錄激活因子1(STAT1)水平,促進hFOB1.19細胞增殖、ALP活性和礦化結節形成。此外,OVX大鼠體內實驗表明,抑制miR-935顯著降低骨密度(bone mineral density,BMD)、骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)并增加骨小梁間隙(Tb.Sp),證明了BMSCs衍生的外泌體miR-935通過靶向STAT1促進hFOB1.19細胞的增殖、分化和礦化。同樣,Yang等[18]證明了攜帶lncRNA MALAT1的BMSCs衍生的外泌體促進了hFOB1.19細胞增殖、ALP活性和礦化結節形成,其機制是作為miR-34c的ceRNA以促進特異AT序列結合蛋白2(SATB2)表達,OVX小鼠體內實驗表明miR-34c逆轉了MALAT1的作用,SATB2逆轉了miR-34c的作用,證明了BMSCs衍生的外泌體lncRNA MALAT1通過介導miR-34c/SATB2軸促進hFOB1.19細胞增殖、分化和礦化并有效減輕OP癥狀。

慢性炎癥是OP的直接誘因[19]。巨噬細胞是一類免疫反應的主要調節因子,分為M1促炎表型和M2抗炎表型。據報道,巨噬細胞向M1表型的極化會導致小鼠骨溶解[20],以及在炎癥反應的調節過程中分泌外泌體[21]。Yu等[22]在OVX小鼠中觀察到BMD降低和Tb.N減少,在用M1巨噬細胞衍生的外泌體處理后則進一步加重了骨質流失,進一步的體外試驗發現M1巨噬細胞衍生的外泌體處理的MC3T3-E1細胞中miR-98水平顯著上調,通過靶向雙特異性磷酸酶-1(DUSP1)激活其介導的JNK信號通路,降低MC3T3-E1細胞中成骨細胞特異性轉錄因子(OSX)、Runx2、ALP表達和減少礦化結節形成,從而推動骨質流失和OP的發展。

3 外泌體ncRNAs調控OC介導的骨吸收

骨骼的重塑是一個緊密耦合的過程,OC作為人體唯一的骨吸收細胞,對骨重塑至關重要。OC是由破骨前體細胞融合產生的多核細胞,具有溶解骨基質的能力,通過在吸收區分泌H+、Cl-、組織蛋白酶K和基質金屬蛋白酶以響應巨噬細胞集落來刺激因子和NF-κB配體的受體激活劑[23]。OC性骨吸收增強是PMOP、糖皮質激素性OP和炎癥相關OP等疾病快速骨質丟失的主要原因[24]。因此,通過外泌體ncRNAs調節OC生成和功能從而抑制骨吸收可能是減少快速骨丟失和防治OP的有效手段。

促炎細胞因子,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等,可以增加OC生成,促進骨吸收,從而導致OP[25]。Zhang等[26]通過建立細胞和糖尿病骨質疏松大鼠模型,評估攜帶miR-146a的脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)衍生的外泌體的抗炎作用,發現外泌體miR-146a給藥可有效抑制高糖誘導的OC中促炎細胞因子的產生以及骨吸收,并恢復鏈脲佐菌素誘導的糖尿病性OP大鼠的骨丟失,其機制是外泌體miR-146a通過抑制TNF-α、IL-18和IL-1β的表達,誘導NLRP3炎性體失活,最終降低OC骨吸收能力并恢復骨丟失。

骨髓微環境中年齡相關分子的改變是OP的驅動力之一,這些分子通過調節OB和OC的活性來抑制骨形成并促進骨吸收,從而導致與年齡相關的骨質流失[27]。Xu等[28]觀察到來自老年大鼠的BMSCs中衰老相關分泌表型和成脂分化的增加以及成骨分化和干性的減少,進一步研究發現miR-31a-5p隨著BMSCs的衰老而顯著增加,并通過外泌體分泌到細胞外微環境中,然后使用外泌體作為載體的miR-31a-5p不僅通過靶向SATB2和E2F轉錄因子2(E2F2)分別調節BMSCs在成骨和細胞衰老中的功能,而且通過靶向RAS同源基因家族成員A(RhoA)正向調節OC分化,證明了外泌體miR-31a-5p可作為OB和OC生成的重要調節因子,在調節衰老骨髓微環境中的骨形成和骨吸收方面發揮重要作用。此外,他們還發現在骨髓中應用antagomiR-31a-5p可減少與年齡相關的骨質流失,為年齡相關性骨丟失提供了一項潛在的生物治療策略。

4 外泌體ncRNAs調控骨相關細胞活性和凋亡

OB數量的維持有利于骨重塑過程中骨的形成,而OB的數量不僅取決于成熟細胞的生產,還與OB的存活率密切相關。因此,在OP防治中不僅需要促進OB增殖、分化和基質礦化功能的發揮,還需要保持OB活性并抑制其凋亡,以維持其正常數量。Qiu等[29]在OVX大鼠血清中發現miR-150-3p、Runx2、OSX明顯減少,通過注射BMSCs衍生的外泌體可有效改善大鼠OP癥狀,其治療效果受到外泌體中miR-150-3p水平的正向調控,同時在體外觀察到外泌體可有效促進OVX大鼠中OBs的增殖、分化,增加OB活力并抑制其凋亡,并同樣受到外泌體中miR-150-3p水平的正向調控,證明了BMSCs衍生的外泌體攜帶的miR-150-3p在OP中的積極治療效果。Peng等[30]發現從BMSCs中提取的外泌體顯著促進了HFOB1.19向成骨細胞的分化,進一步分析發現BMSCs衍生的外泌體中富含miR-196a,并可將miR-196a傳遞到HFOB1.19細胞,靶向并抑制Wnt通路抑制因子(Dickkopf-1)從而激活Wnt/β-catenin通路以促進成骨分化,流式細胞儀檢測細胞凋亡率明顯降低,同時凋亡相關蛋白caspase-3和caspase-6表達明顯下降,而抑制miR-196a時外泌體將無法發揮作用,證明了BMSCs衍生的外泌體傳遞的miR-196a通過靶向Dickkopf-1激活Wnt/β-catenin通路,在促進OB分化,抑制OB凋亡中發揮重要作用。

在OP的發病機制中,TNF-α作為一種促炎細胞因子,已被證實可通過誘導細胞毒性和凋亡抑制OB分化和骨形成[31-32]。Wang等[33]將TNF-α誘導的OB與ADSCs衍生的外泌體或經lncRNA KCNQ1OT1修飾的ADSCs衍生的外泌體共培養,發現TNF-α劑量依賴性地增加miR-141-5p表達,抑制OB活力并促進其凋亡,ADSCs衍生的外泌體可以減弱TNF-α誘導的OB的細胞毒性和凋亡,與之相比,lncRNA KCNQ1OT1修飾的ADSCs衍生的外泌體通過海綿化miR-141-5p發揮更顯著的抑制作用。類似的,Cao等[34]發現用TNF-α處理MC3T3-E1細胞可降低細胞活力并以劑量依賴性方式增加凋亡相關蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)、切割型caspase-3(c-caspase-3)和Bcl-2相關X蛋白(Bax)表達,促進細胞凋亡并增加miR-146a表達,而與源自circ-Rtn4修飾的BMSCs的外泌體共培養則通過海綿化miR-146a,抑制了TNF-α誘導的MC3T3-E1細胞caspase-3、c-caspase-3和Bax表達,減弱了細胞毒性和凋亡。

廢用性骨質疏松癥(disuse osteoporosis,DOP)是由于缺乏機械應力刺激而導致的,與PMOP和老年性骨質疏松癥(senile osteoporosis,SOP)具有共同的特征,包括低骨量和骨組織的微結構退化,同時使人的骨折易感性增加[35]。Yang等[36]研究了源自MSCs的外泌體在DOP中的功能,發現來自DOP大鼠模型的BMSCs中Bax和c-caspase-3表達水平顯著升高,而人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)衍生的外泌體處理后表達水平明顯受到抑制,高通量miRNA測序發現miR-1263的水平在差異表達的miRNAs中最為豐富,同時外泌體miR-1263可以直接靶向并抑制Mob1從而抑制Hippo信號通路的激活,逆轉了體外DOP中BMSCs的凋亡。同時,他們還在體內實驗中觀察到大鼠DOP的改善和骨量的增加,證明了源自HUCMSCs的外泌體miR-1263可有效抑制BMSCs凋亡和預防DOP的發生發展。

5 外泌體ncRNAs調控血管生成

考慮到成骨和血管生成之間的聯系,越來越多的研究開始研究OP的發生發展與血管生成之間的關系[37]。這兩者之間被廣泛接受的關系是血管生成減少引起OP,促進局部血管生成則會減輕OP[38]。Lu等[39]探索了衰老OB衍生的外泌體中miRNAs如何影響衰老過程中的人血管內皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs),發現miR-139-5p在衰老的OB及其外泌體中高表達,將HUVECs和衰老OB共培養后,miR-139-5p在HUVECs中也上調,進一步研究發現miR-139-5p可以通過靶向T盒轉錄因子1(TBX1)促進HUVECs的凋亡和衰老,抑制其增殖和遷移,證明了衰老OB衍生的外泌體介導的miR-139-5p通過外泌體途徑靶向TBX1調控HUVECs功能。同樣,Liu等[40]報道了BMSCs衍生的外泌體可以被HUVECs攝取并促進HUVECs的增殖、遷移和管狀結構形成,進一步分析發現BMSCs衍生的外泌體中miR-29a水平較高,并通過轉運到HUVECs中以靶向血管生成抑制因子1(VASH1)的方式調節血管生成。此外,載有miR-29a的外泌體在小鼠體內表現出很強的促進血管生成和成骨的能力,表現為顯著增加的BMD、BV/TV、Tb.N和較低的Tb.Sp,最終證明了BMSCs衍生的外泌體攜帶的miR-29a通過靶向VASH1調節血管生成和成骨,可作為OP的潛在治療靶點。詳見表1。

表1 外泌體ncRNAs在OP中的調控機制

6 總結和展望

本綜述重點關注了外泌體的ncRNAs在OP中調控BMSCs成骨分化、OB骨基質礦化、OC骨吸收、骨相關細胞活性和凋亡以及血管生成方面所發揮的作用,這些ncRNAs都具有特定的特性,控制著其靶基因的表達和mRNA的穩定,影響著一個或多個骨代謝過程中的關鍵基因表達。更重要的是,它們經常被發現富集在外泌體中,而且幾乎所有的細胞類型都可以分泌外泌體。因此,這些包裹著豐富ncRNAs的外泌體滿載貨物穿梭在BMSCs、OBs、OCs之間,在骨重塑過程中發揮著關鍵作用。近年來,不同來源的外泌體攜帶的ncRNAs被不斷鑒別和研究,并被認可為OP的新型生物標志物和潛在治療靶點。當然,由于這一研究領域的涉足時間較短,也不可避免地存在一些不足。首先,目前的研究僅限于體外細胞和動物模型展開,而未有作為治療手段進入臨床應用的報道出現。其次,lncRNAs和circRNAs都可以通過海綿化miRNAs來影響OP進程,而有關lncRNAs和circRNAs的研究相對較新較少,例如外泌體circRNAs在OC中的調節作用至今未有報道,但作為重要的調節因子,其治療潛力是毋庸置疑的。同時,ncRNAs在不同疾病中也同時發揮著不同的調控作用,因此,有必要探索它們與OP及其他疾病之間的聯系機制,例如尋找骨相關疾病之間的共性,這可能有助于使用外泌體ncRNAs進行治療。最后,實驗模型的標準、外泌體分離純化方法的標準、樣本量的標準等一系列標準問題也等待明確?？傊?外泌體ncRNAs的研究仍然存在挑戰,但具有一定的潛力,外泌體ncRNAs的深入研究在幫助開發新的OP診斷和治療策略中具有重要意義。