壯筋養血湯介導MAPK/P38-ERK通路調控成骨成脂分化的作用機制

溫蕊嘉 董鑫 莊皓文 王俊巖 張錦芳

1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院,廣東 廣州 510405

2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院,廣東 廣州 510405

3.廣州中醫藥大學中藥學院,廣東 廣州 510006

4.廣州中醫藥大學深圳醫院(福田),廣東 深圳 518000

骨骼是人類及脊椎動物運動系統中的重要組成部分,與個體的生長發育、行動與生存能力密切相關。隨著個體年齡的增長,骨形成能力逐漸減弱,而骨吸收能力逐漸增強,從而引起骨代謝紊亂,最終導致骨質疏松癥等骨疾病[1]。大多數骨質疏松癥患者骨髓中脂肪細胞增多,導致骨質流失[2]。骨髓脂肪細胞和骨細胞由共同的祖細胞-骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)發育而來。BMSCs是一類起源于中胚層的成體干細胞,具有自我更新及多向分化潛能,在一定微環境下分化為成骨細胞或脂肪細胞[3]。在自然狀態下,成骨細胞與脂肪細胞維持動態平衡,并可在特定條件下進行轉化,一旦這種動態平衡被打破,則會導致一系列骨代謝疾病[4-5]。因此,維持成骨與成脂的平衡可能是預防或治療骨代謝疾病的一種候選治療方法[6-7]。

骨橋蛋白(osteopontin,OPN)與Runt相關轉錄因子2(RUNX2)為成骨分化早期標志物,對骨組織的形成和重建起著重要作用。現代研究表明,在BMSCs向成骨細胞分化的過程中,RUNX2激活骨基質蛋白如ALP、OPN、骨涎蛋白等的表達,同時可以調控骨形成的進程[8]。過氧化物酶體增殖物激活受體 (peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs) 的亞型PPARγ與CCAAT增強子結合蛋白α(C/EBPα) 是BMSCs成脂分化通路的晚期分子標志物,對BMSCs成脂分化起關鍵性調控作用。BMSCs的活性降低及成骨與成脂分化平衡失調可導致骨再生減少,是大多骨代謝疾病的重要病理基礎之一。研究發現MAPK/ERK通路是骨機械和激素信號的重要中介,通過RUNX2和PPARγ的磷酸化刺激成骨細胞的生成并抑制脂肪的生成[9]。LncRNA與成骨分化有直接關系,可以調節BMSCs的成骨和成脂分化[10]。LncRNA ANRIL最初是由Pasmant等人在研究黑色素瘤時發現,現有研究表明LncRNA ANRIL通過調控MiR-125a-3p/MAPK信號通路抑制卵巢癌細胞增殖[11],ANRIL通過miR-125a-3p/FGFR1/MAPK信號通路促進頭頸部鱗狀細胞癌的進展[12]。然而LncRNA ANRIL在BMSCs成骨成脂中的調控機制尚不清晰。中醫學治療骨科疾病的歷史悠久,壯筋養血湯(Zhuangjin Yangxue Decoction,ZJYXD)是《傷科補要》中活血壯筋的經典方劑,具有養血活絡、強筋壯腰的功效。本研究擬通過體外及體內實驗探討壯筋養血湯通過LncRNA ANRIL對成骨成脂分化的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:用于制備含藥血清的實驗動物:SPF級7～8周雄性SD大鼠,共8只,體質量180～200 g;用于提取骨髓間充質細胞和造模的實驗動物:SPF級6～8周齡C57BL/6雄性小鼠32只,體質量20～25 g。倫理申請號:20210119002,申請單位:廣州中醫藥大學。購買及飼養均在廣州中醫藥大學實驗動物中心,許可證號:[SYXK(粵)2018-0001]。

1.1.2藥品與試劑:壯筋養血湯(白芍9 g、當歸9 g、川芎6 g、川斷12 g、紅花5 g、生地12 g、牛膝9 g、牡丹皮9 g、杜仲6 g,廣州中醫藥大學附屬第一醫院);β-甘油磷酸鹽(貨號G9422),地塞米松(貨號D4902),L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽(貨號49752),吲哚美辛(貨號I8280),胰島素(貨號 I5523),3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(貨號I5879),美國默克公司;α-MEM培養基(貨號12571063),PBS(貨號8121447),FBS(貨號2173969RP),Lipofectamine 3000 Reagent(貨號:L3000001),美國賽默飛公司;電泳液(貨號P0561),BCA試劑盒(貨號P0012S),凝膠制備試劑盒(貨號P0690),堿性磷酸酶檢測試劑盒(貨號P0321S),BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(貨號C3206),茜素紅S染色液(貨號C0140),改良油紅O染色試劑盒(貨號C0158S),中國上海碧云天生物科技有限公司;CCK-8試劑盒(貨號CA1210),全蛋白提取試劑盒(貨號BC3710),北京索萊寶科技有限公司;顯影液(貨號KGP1121),中國南京凱基生物科技發展有限公司;β-actin抗體(貨號20536-1-AP),PPARγ抗體(貨號16643-1-AP),C/EBPα抗體(貨號18311-1-AP),OPN抗體(貨號25715-1-AP),RUNX2抗體(貨號20700-1-AP),P-ERK抗體(貨號28733-1-AP),ERK1/2抗體(貨號51068-1-AP),P38抗體(貨號14064-1-AP),武漢三鷹生物技術有限公司。

1.1.3主要儀器:酶標儀(型號Multiskan FC,美國賽默飛公司);倒置熒光顯微鏡(型號IX73),日本奧林巴斯公司;實時熒光定量PCR儀(型號CFX96),全自動凝膠成像系統(型號Gel Doc EZ),高壓電泳儀(型號Power Pac TMB asic),美國伯樂公司;離心機(型號Allegra X-30R),美國貝克曼公司;多模式小動物活體成像系統(型號FX Pro),美國Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠含藥血清的制備:壯筋養血湯制備水煎液,加熱濃縮至含藥濃度1 g/mL。參照大鼠與人等劑量換算公式,ZJYXD劑量為8.085 g/kg進行灌胃,2次/d,連續灌胃1周。末次灌胃2 h后,深度麻醉大鼠,通過腹主動脈進行采血,制備血清,56 ℃水浴滅活1 h,過濾后凍存用于后續試驗。

1.2.2BMSCs原代細胞的提取:取6～8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠8只,麻醉處死后,取雙下肢股骨,按文獻[13]中具體操作提取細胞。待細胞密度至80 %左右時,消化后進行傳代培養。

1.2.3小鼠股骨橫斷骨折模型:選用小鼠股骨橫斷骨折模型為實驗研究對象,具體方法參照文獻[14],選取髓內針作為固定方法,縫合收緊,標記骨折部位。

1.2.4CCK-8實驗檢測BMSCs細胞增殖活力:使用CCK-8試劑盒測定不同濃度的ZJYXD含藥血清對BMSCs細胞增殖的影響。細胞分別按0 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %含藥血清分組進行相應的處理,隨后按CCK-8試劑盒說明書進行操作。

1.2.5慢病毒感染BMSCs并進行分組給藥:取對數生長期的BMSCs細胞接種于6孔板中,分別將空載(NC)和LncRNA過表達(ANRIL)慢病毒按照Lipofectamine3000 Reagent試劑盒說明書轉染至BMSCs。將細胞分為NC組(陰性對照組),NC +ZJYXD組(對照組+6 % ZJYXD含藥血清組),ANRIL組(LncRNA ANRIL過表達組),ANRIL+ZJYXD組(LncRNA ANRIL過表達組+6 % ZJYXD含藥血清組)。隨后使用熒光顯微鏡觀察感染效率,qRT-PCR檢測各組細胞中ANRIL mRNA的表達。

1.2.6成骨、成脂誘導各組BMSCs:細胞以每孔5×105個接種于12孔板中,貼壁后進行成骨、成脂誘導。成骨及成脂誘導分別按照文獻[15]說明進行誘導。每3天更換一次培養基。

1.2.7堿性磷酸酶、茜素紅染色及定量分析檢測各組細胞成骨能力:成骨誘導后第7天進行堿性磷酸酶染色與定量分析。對于堿性磷酸酶染色,根據BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒中的方案進行配制操作,于掃描儀上進行觀察。對于堿性磷酸酶的定量檢測,根據堿性磷酸酶檢測試劑盒說明書進行操作,置于酶標儀檢測吸光值。成骨誘導后第14天進行茜素紅染色及定量分析。對于茜素紅染色,細胞進行固定后,加入茜素紅S染液,隨后清洗3～5次,置于掃描儀觀察拍照。對于茜素紅鈣鹽定量分析,取染色后孔板加入10 %氯化十六烷基吡啶,收集液體于560 nm檢測吸光值。

1.2.8油紅O染色檢測各組細胞成脂能力:成脂誘導7 d后進行油紅O染色,吸出培養基,4 %多聚甲醛進行固定,根據改良油紅O染色試劑盒說明進行溶液配制,染色30 min,隨后ddH2O清洗置于顯微鏡下拍照。

1.2.9qRT-PCR檢測成骨、成脂相關mRNA基因的表達:將細胞均勻鋪于六孔板上,根據分組進行不同處理,待細胞貼壁后,進行成骨成脂誘導,誘導7 d后將細胞消化,離心提取RNA,根據反轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄,根據定量PCR試劑盒提供的方案進行加板上樣。使用實時熒光定量PCR法進行擴增,隨后進行定量分析,檢測相關基因的表達。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.10Western Blot法檢測成骨成脂及相關通路蛋白的表達:對細胞進行蛋白提取,運用BCA蛋白濃度定量法對蛋白濃度進行定量;采用SDS-PAGE凝膠經80～120 V電泳分離目標蛋白,隨后轉膜;5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過夜;加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,隨后加入顯影液避光進行顯影,其中內參為β-actin,使用軟件ImageJ進行結果分析。

1.2.11X-ray與Micro-CT檢測ZJYXD促進骨愈合的能力:造模小鼠術后3 d將慢病毒感染后的BMSCs細胞收集制成1×106個/mL細胞懸液,將小鼠按照1.2.4分組于皮膚標記骨折處注射細胞,術后5 d開始進行灌胃。小鼠分為四組:NC組(陰性對照組),NC+ZJYXD組(對照組+6 % ZJYXD含藥血清組),ANRIL組(LncRNA ANRIL過表達組),ANRIL+ZJYXD組(LncRNA ANRIL過表達組+6 % ZJYXD含藥血清組),每組6只,其中NC+ZJYXD組與ANRIL+ZJYXD組參照小鼠與人等劑量換算公式,ZJYXD劑量為11.68 g/kg灌胃,其余兩組給予等量生理鹽水灌胃,2周后麻醉進行脫臼處死,取股骨進行X-ray與Micro-CT檢測。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度的ZJYXD對BMSCs細胞活力的影響

CCK-8結果見圖1,ZJYXD含藥血清能明顯促進BMSCs的增殖活性,與0 %含藥血清濃度相比,6 % ZJYXD含藥血清對BMSCs細胞增殖能力最強,故選用6 % ZJYXD含藥血清濃度進行后續實驗。

圖1 不同濃度ZJYXD含藥血清對BMSCs細胞增殖活性

2.2 BMSCs細胞轉染LncRNA ANRIL慢病毒及ZJYXD對ANRIL的影響

熒光顯微鏡下觀察熒光明顯,細胞存活較多。與NC組比較,NC+ZJYXD組ANRIL mRNA表達降低(P<0.01),ANRIL組ANRIL mRNA表達顯著提高(P<0.01);與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組ANRIL mRNA表達升高(P<0.01);ANRIL+ZJYXD組與ANRIL組相比不具有差異性(P>0.05)。見圖2。

圖2 慢病毒轉染效率熒光對比及mRNA表達量(×200)

2.3 ZJYXD通過ANRIL調節BMSCs細胞成骨分化

染色結果見圖3。與NC組對比,NC+ZJYXD組染色更深,成骨分泌標志物更多,細胞外礦化結節的形成與沉積較多(P<0.01);與NC組對比,ANRIL組染色淺,成骨分泌標志物較少,礦化結節形成較少,堿性磷酸酶活性與鈣質沉積量減少(P<0.01);與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組染色弱,堿性磷酸酶活性與鈣鹽沉積被抑制(P<0.01),表明ANRIL的表達抑制了ZJYXD促進骨形成作用。ANRIL+ZJYXD組與ANRIL組對比染色及定量分析無統計差異,表明ZJYXD促進成骨分泌及骨礦化結節的形成能力被ANRIL的過表達抑制(P>0.05)。

圖3 堿性磷酸酶染色、茜素紅染色及定量分析

2.4 ZJYXD通過ANRIL調節BMSCs細胞成脂分化

與NC組對比,NC+ZJYXD組脂肪顆粒較少,ANRIL組紅色脂肪細胞較多,成脂能力較強;與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組脂肪顆粒較多,成脂能力增強;ANRIL+ZJYXD組與ANRIL組對比脂肪顆粒變化不明顯。見圖4。

圖4 顯微鏡下觀察油紅O染色脂滴形成情況(×100)

2.5 ZJYXD通過ANRIL調節BMSCs細胞成骨成脂相關基因及蛋白的表達

與NC組對比,NC+ZJYXD組OPN、RUNX2的mRNA及蛋白表達顯著升高,C/EBPα、PPARγ的mRNA及蛋白表達顯著降低(P<0.01);ANRIL組OPN、RUNX2的mRNA及蛋白表達降低,C/EBPα、PPARγ的mRNA及蛋白表達升高(P<0.01);與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組OPN、RUNX2的mRNA及蛋白表達明顯降低,C/EBPα、PPARγ的mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.01);與ANRIL組對比,ANRIL+ZJYXD組成骨成脂相關基因及蛋白表達不具有差異性(P>0.05)。見圖5。

圖5 成骨成脂相關基因及蛋白的表達

2.6 ZJYXD通過ANRIL介導的MAPK/P38-ERK信號通路促進BMSCs成骨分化

與NC組對比,NC+ZJYXD組P-ERK、P38蛋白的表達增加(P<0.01),ANRIL組P-ERK、P38蛋白表達降低(P<0.01);與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組P-ERK、P38蛋白表達明顯降低(P<0.01);ANRIL+ZJYXD組與ANRIL組對比P-ERK、P38蛋白表達無差異性(P>0.05)。見圖6。

圖6 P38、ERK、P-ERK蛋白的表達

2.7 ZJYXD通過ANRIL促進骨折愈合,增加骨量

X-ray可見,與NC組對比,NC+ZJYXD組骨折后愈合能力增強,骨痂較厚,ANRIL組愈合能力較弱;與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組愈合能力減弱,骨痂形成量較少,表明ANRIL的表達抑制了ZJYXD的促進骨形成作用。Micro-CT也顯示出同樣的結果,進一步數據測算則準確的反應了骨折斷端的骨痂體積(TV)與骨量體積(BV)。這些數據表明ZJYXD促進骨折后愈合的能力被ANRIL的過表達抑制。見圖7。

圖7 X-ray、Micro-CT觀察骨折愈合程度并分析BV與TV

3 討論

隨著現代社會的高速發展以及人口老齡化程度的不斷加重,骨代謝疾病的發病率逐年增加[16]。中醫學治療骨科疾病具有獨特的理論及方法,壯筋養血湯源自清·錢秀昌《傷科補要》,主要功效為養血活絡,強筋壯腰,其藥物組成為當歸、白芍、川續斷、杜仲、生地黃、川芎、紅花、牡丹皮、牛膝。實驗研究表明壯筋養血湯可降低NO、IL-1及iNOS的含量,從而減輕關節軟骨損傷[17]。此外,臨床研究顯示壯筋養血湯對腰椎間盤突出癥、骨關節炎、腰背痛、跟骨關節骨折亦有較好的療效[17-19]。本研究通過實驗證實6 %壯筋養血湯含藥血清可以顯著促進BMSCs細胞的增殖。

LncRNA相關中藥作用機制是當下中醫藥研究的熱點之一,多種中藥可通過LncRNA發揮疾病治療作用[20]。LncRNA ANRIL是眾多LncRNA中的一員,位于激酶4抑制因子(INK4)位點,作為一種反義非編碼RNA[21],它與眾多疾病均有一定的相關性。已有研究證明LncRNA ANRIL沉默可促進牙周韌帶成骨細胞的分化,促進人BMSCs細胞的增殖,抑制其凋亡[22-23]。本研究發現壯筋養血湯可以顯著促進鈣鹽沉積與成骨分泌物的形成,同時促進成骨相關因子基因及蛋白的表達,進一步研究發現壯筋養血湯可以降低ANRIL mRNA表達,過表達ANRIL則導致壯筋養血湯成骨及礦化結節形成能力減弱,抑制成骨相關轉錄因子基因及蛋白的表達,這些研究結果表明壯筋養血湯可能通過LncRNA ANRIL發揮成骨作用。

骨代謝疾病的發生不僅與成骨細胞減少相關,還與骨髓中脂肪細胞增加有關[24]。因此增加成骨細胞形成,抑制脂肪細胞生成,對于防治骨質疏松癥等一系列骨代謝性疾病具有重要的意義[25]。本研究發現壯筋養血湯可抑制成脂細胞中的脂滴形成,并且降低成脂相關因子基因及蛋白的表達量,過表達ANRIL后壯筋養血湯抑制成脂細胞能力減弱,這些結果表明壯筋養血湯通過抑制ANRIL能夠促進成骨細胞形成,同時抑制成脂細胞的增殖。體內實驗也驗證了以上結論,X-ray與Micro-CT均顯示壯筋養血湯可提高骨折后愈合程度,過表達ANRIL則會導致愈合緩慢。由此可見壯筋養血湯對BMSCs成骨和成脂具有雙向影響,促進BMSCs成骨分化的同時又在抑制成脂分化,且這種影響是通過調控ANRIL實現。

MAPK信號通路在骨代謝疾病進程中具有促進成骨細胞增殖分化的作用[26]。MAPK信號通路主要由p38 MAPK、ERK1/2、ERK5等組成[27]。研究表明LncRNA ANRIL通過MAPK信號通路調節腫瘤的發生發展[11-12], ANRIL通過調節RAS/RAF/ERK信號通路促進動脈粥樣硬化進展,同時有研究證實激活MAPK通路會誘導成骨的生成,加入抑制劑后會增加脂肪細胞的生成[28-29]。據此,筆者推測壯筋養血湯可能通過LncRNA ANRIL介導的MAPK/ ERK信號通路發揮作用。通過本研究發現,壯筋養血湯可以顯著增強P38、P-ERK的表達,過表達ANRIL則抑制其表達。以上實驗結果證實壯筋養血湯通過LncRNA ANRIL介導的MAPK/P38-ERK通路調控BMSCs成骨成脂分化。

綜上所述,本研究通過體外、體內實驗證實了壯筋養血湯具有促進成骨的生成、抑制成脂分化的作用,而這種作用是通過LncRNA ANRIL調控MAPK/P38-ERK信號通路實現的。本次研究為壯筋養血湯治療骨代謝疾病提供了重要的實驗依據,拓寬了臨床治療骨代謝疾病的思路。