冷激復合柚皮提取物處理對鮮切馬鈴薯褐變調(diào)控的影響

李明，王艷瑜，焦玉珍，劉雨涵，喬麗萍，2*，劉霞

（1.天津科技大學 食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津捷盛東輝保鮮科技有限公司，天津 300300）

鮮切果蔬，又稱最小加工果蔬，具有新鮮、營養(yǎng)、方便等特點，市場發(fā)展前景廣闊[1]。然而，加工過程中的削皮及切割機械損傷，使鮮切產(chǎn)品更易受微生物侵染，發(fā)生失水、軟化、異味等問題，影響產(chǎn)品貨架期[2]。此外，酶促褐變也是鮮切果蔬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展瓶頸[3]，其本質(zhì)是酚類物質(zhì)在多酚氧化酶和過氧化物酶的催化作用下生成醌類物質(zhì)，進而導致類黑素在其表面發(fā)生積累[4]。

目前，鮮切果蔬制品的保鮮方法主要為物理、化學和生物方法。其中，常見物理方法包括氣調(diào)、低溫、熱處理和非熱技術等；化學方法通常為化學保鮮劑和可食性涂膜的應用；常見的生物方法為使用拮抗菌[5]。然而，這些常用方法在安全性、經(jīng)濟成本方面均存在一定局限性。因此，探尋一種可操作性強、安全性高、成本低、有效的褐變防控保鮮方法具有重要意義。

冷激處理是一種將果蔬進行短時低溫處理，通過冷脅迫作用誘導果蔬提高自身的生理抗性，從而延長貯藏期和提高貯藏品質(zhì)的物理方法，其中，常用方法為冰水混合物冷激和冷空氣冷激[6]。冷激處理操作簡便、安全性高、能耗低，具有廣闊的應用前景[7]。張婷婷等[8]采用0 ℃冰水混合物冷激處理茄子，維持了茄子果實的活性氧和抗氧化代謝平衡，減少了膜脂氧化損傷，進而減輕冷害癥狀，延緩了果肉的褐變。研究表明，冷激處理可以通過減少活性氧的積累，提高抗氧化能力來降低香蕉[9]、楊桃[10]冷害指數(shù)，保持果實的良好貯藏品質(zhì)。目前，冷激處理在果蔬保鮮領域中已有相關應用，然而其在鮮切馬鈴薯褐變防控方面的應用及相關作用機制鮮有報道。

植物提取物具有天然環(huán)保、安全高效的特點，近年來在果蔬保鮮和貯藏品質(zhì)控制方面具有很高的應用價值[11]。柚子是深受人們喜愛的水果之一，盛產(chǎn)于湖南、福建、廣東等地。柚皮營養(yǎng)成分豐富，含有精油、檸檬苦素、黃酮類等多種生理活性物質(zhì)，具有抗菌、抗氧化功能和藥用價值[12]。目前，柚皮提取物在鮮切果蔬的保鮮應用方面鮮見報道，充分開發(fā)利用柚皮這一加工廢棄物中的活性物質(zhì)，對減少資源浪費、提升經(jīng)濟效益具有重要意義。

本文以馬鈴薯為試驗材料，探究冷激處理、柚皮提取物處理、冷激復合柚皮提取物處理對鮮切馬鈴薯貯藏期間的色澤品質(zhì)、褐變反應關鍵酶活、膜脂過氧化物質(zhì)的積累和抗氧化能力等方面的調(diào)控規(guī)律，系統(tǒng)評價上述3 種不同處理方式對鮮切馬鈴薯的護色效果，以期為鮮切果蔬的褐變控制開發(fā)一種簡單、安全、有效的保鮮方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮馬鈴薯（荷蘭15 號）：市售；柚皮提取物（水提物，濃縮比20∶1）：陜西綠晟源生物制品制造有限公司；聚乙二醇、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、乙二胺四乙酸、L-苯丙氨酸、福林酚試劑、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、無水乙醇（均為分析純）：天津市百奧泰科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

WG-0218 型精密色差儀：東莞七彩儀器設備有限公司；EPOCH 型酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；TGL-16M 型冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；HB-458350 型電熱恒溫水浴鍋：歐萊德科學儀器（北京）有限公司。

1.3 處理方法

洗凈的新鮮馬鈴薯隨機分為兩批，其中一批作冷激預處理：將馬鈴薯整果置于（2±1）℃冰水混合物中冷激25 min；另一批不做任何處理。

對照組（CK）：將未處理的馬鈴薯去皮、切片（5 mm）置于清水中備用。冷激處理組（CS）：做冷激預處理后的馬鈴薯整果去皮、切片（5 mm）置于清水中。柚皮提取物處理組（PP）：將未處理的馬鈴薯去皮、切片（5 mm）后置于0.05%柚皮提取物溶液（0.5 g/L）浸泡5 min。冷激復合柚皮提取物處理組（CS+PP）：做冷激預處理后的馬鈴薯整果去皮、切片（5 mm）后置于0.05%柚子皮提取物溶液中浸泡5 min。

使用無菌紗布蘸干鮮切馬鈴薯樣品的表面水分后，將其分裝于PE 自封袋中密封并作好標記，置于4 ℃冷藏8 d，每隔2 d 測定相應的試驗指標。

1.4 試驗指標測定

1.4.1 樣品色澤的測定

鮮切馬鈴薯的色澤使用精密色差儀進行測定[1]，測定數(shù)據(jù)分別表示為L*值（亮度值）、a*值（紅綠值）、b*值（黃藍值），L*值越大亮度越大。將樣品的褐變程度表示為ΔE 值（總色差值），ΔE 值越大，褐變程度越大。ΔE 計算公式如下。

1.4.2 關鍵酶活性的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）的活性測定參照曹建康等[13]的方法。

2 g 馬鈴薯樣品在5.0 mL PAL 提取緩沖液中研磨，漿液于4 ℃下離心30 min（10 000 r/min），收集上清液用于PAL 活性測定。PAL 活性測定反應試管中加入3 mL 50 mmol/L 的硼酸緩沖溶液和0.5 mL 20 mmol/L的L-苯丙氨酸溶液后，37 ℃水浴10 min。水浴完畢，上述反應管中加入0.5 mL 粗酶提取液，混勻后迅速測定反應混合液在290 nm 處的初始吸光值。隨后再次將反應管置于37 ℃水浴中保溫60 min，并測定反應混合物的最終吸光值。將每克馬鈴薯樣品（鮮重）每小時吸光值增加0.01 表示為1 個PAL 活力單位（U/g）。

2 g 馬鈴薯樣品在5.0 mL 提取緩沖液中研磨成漿，隨后在4 ℃條件下離心30 min（10 000 r/min），收集上清液為粗酶提取液，用于PPO、POD 活力的測定。

PPO 活性測定反應體系由4.0 mL 乙酸緩沖溶液（50 mmol/L、pH5.5）、1 mL 鄰苯二酚溶液（50 mmol/L）、0.1 mL 粗提液組成。反應液混勻后，迅速測定其在420 nm 處的初始吸光值，隨后間隔1 min 記錄1 次，連續(xù)記錄時長6 min。以每克馬鈴薯樣品（鮮重）每分鐘吸光值變化增加1 為1 個PPO 活力單位（U/g）。

POD 的活性測定反應體系由3.0 mL 愈創(chuàng)木酚溶液（25 mmol/L）、0.5 mL 粗酶液以及0.2 mL 過氧化氫溶液（0.5 mol/L）構成，其中，過氧化氫溶液為反應啟動液，最后加至測定反應管中。反應啟動后，迅速記錄反應混合液于波長470 nm 處的初始吸光值，隨后每間隔30 s 記錄一次，記錄時長3 min。以每克馬鈴薯樣品（鮮重）每分鐘吸光值變化增加1 為1 個PPO 活力單位（U/g）。

1.4.3 總酚含量的測定

總酚含量的測定采用福林酚法[14]。稱取馬鈴薯樣片2 g，加入5 mL 60%乙醇溶液于冰浴中研磨勻漿，4 ℃下離心10 min（10 000 r/min）并收集上清液。反應管中依次加入0.25 mL 酶提取液（上清液）、2 mL 蒸餾水、0.8 mL 20% Na2CO3溶液和0.25 mL 福林酚試劑并混合均勻，置于暗處反應25 min 后測定反應混合物于760 nm 處的吸光值。以每克新鮮馬鈴薯所含沒食子酸當量計算總酚含量，單位為mg/g。

1.4.4 丙二醛含量的測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定參考Hassan 等[15]的方法。1 g 馬鈴薯樣品在5.0 mL 三氯乙酸溶液（100 g/L）中研磨，4 ℃下離心20 min（10 000 r/min），收集上清液。反應試管中加入2.0 mL 上清液和2.0 mL硫代巴比妥酸溶液（0.67%）并充分混勻，煮沸20 min，待冷卻至室溫后，4 ℃下離心20 min（10 000 r/min）。測定反應混合物450、532、600 nm 處的吸光值，MDA 含量測定結果表示為μmol/kg。MDA 含量計算公式如下。

式中：c 為丙二醛濃度，μmol/L；V 為提取液總體積，mL；Vs為測定時所加的樣液體積，mL；m 為馬鈴薯樣品質(zhì)量，g；X 為丙二醛含量，μmol/kg；A 為OD532；B為OD600；D 為OD450。

1.4.5 H2O2含量的測定

H2O2含量的測定參考Patterson 等[16]的方法。2 g 馬鈴薯樣品在5.0 mL 預冷的丙酮中研磨，4 ℃下離心20 min（10 000 r/min），收集上清液。反應試管中加入1.0 mL 上清液、0.2 mL 10%四氯化鈦-鹽酸溶液和0.2 mL 濃氨水，混勻、反應5 min 后，離心15 min（10 000 r/min），收集沉淀。使用3.0 mL 2 mmol/L 硫酸將經(jīng)預冷丙酮洗去色素后的沉淀充分溶解，測定混合液在412 nm 處的吸光值，H2O2含量測定結果表示為μmol/g。H2O2含量計算公式如下。

式中：X 為過氧化氫含量，μmol/g；n 為標準曲線對應的過氧化氫物質(zhì)的量，μmol；V 為提取液總體積，mL；Vs為測定時樣液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.4.6 DPPH 自由基清除率的測定

DPPH 自由基清除率的測定參考Zheng 等[17]的方法。馬鈴薯樣品充分研磨后取適量汁液于4 ℃離心10 min（10 000 r/min），取上清液。0.2 mL 2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）溶液（257.7 mg/L）和0.5 mL 95%乙醇、2 mL 95%乙醇和0.5 mL 上清液、2 mL DPPH 溶液和0.5 mL 上清液分別反應30 min 后，在517 nm 測定混合溶液的吸光值，并依次記錄為A0、Ar、As。DPPH 自由基清除率（X，%）計算公式如下。

1.4.7 谷胱甘肽含量的測定

谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的測定參考Su等[18]的方法。在預冷的50 g/L 三氯乙酸溶液（含50 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉）中研磨馬鈴薯樣品，收集上清液。兩根反應管中加入1.0 mL 上清液和1.0 mL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH7.7）后，其中一根管中加入0.5 mL 二硫代硝基苯甲酸（dithionitrobenzoic acid，DTNB）溶液（4 mmol/L），另一根管中加入0.5 mL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH6.8），混合均勻后置于25 ℃反應10 min。反應結束后，測定混合溶液于412 nm 處的吸光值，分別記作OD0、ODS，GSH 含量測定結果表示為μmol/g。GSH 含量計算公式如下。

式中：X 為谷胱甘肽含量，μmol/g；n 為標準曲線對應的谷胱甘肽物質(zhì)的量，μmol；V 為提取液總體積，mL；Vs為測定時樣液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均重復測定3 次，結果表示為平均值±標準差。采用SPSS Statistics 26 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA 檢驗，P＜0.05 為差異顯著。采用Origin 2022 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理方式對鮮切馬鈴薯色澤品質(zhì)的影響

色澤是最能反映鮮切果蔬褐變程度的直觀指標。單一柚皮提取物處理、冷激處理和冷激復合柚皮提取物處理對鮮切馬鈴薯色澤品質(zhì)的影響如圖1 所示。

由圖1 可以看出，隨著貯藏時間的延長，鮮切馬鈴薯的表觀色澤逐漸加深，L*值呈下降趨勢。貯藏8 d 后，樣品未出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，對照組的樣品表觀褐變嚴重，各試驗處理組樣品表面褐變程度輕微且維持較高的L*值，其中，冷激復合柚皮提取物處理組的亮度值最大，褐變現(xiàn)象明顯輕于單一處理組。貯藏期間，樣品的a*值逐漸增大。其中，相比于對照組，處理組維持了較低的a*值，說明各試驗處理組可能減少了樣品表面紅褐色物質(zhì)的積累，減輕了褐變癥狀。與對照組相比，各處理組的樣品ΔE 值在整個貯藏期間趨于緩慢變化，在貯藏后期6 d 和8 d 時，冷激復合柚皮處理組樣品維持了最低的ΔE 值。綜合分析可知，柚皮處理、冷激復合柚皮處理均能對鮮切馬鈴薯起到不同程度的護色作用，效果由強到弱依次為冷激復合柚皮處理＞柚皮處理＞冷激處理＞對照組。

2.2 不同處理方式對鮮切馬鈴薯PPO、POD、PAL 活性及總酚含量的影響

不同處理方式對鮮切馬鈴薯PPO、POD、PAL 活性及總酚含量的影響見圖2。

圖2 不同處理方式對鮮切馬鈴薯貯藏期間PPO、POD、PAL 活性和總酚含量的影響Fig.2 Effects of different treatment methods on PPO，POD，PAL activity and total phenolic content of fresh-cut potato during storage

PPO 和POD 是鮮切果蔬酶促褐變反應中的關鍵酶，能將果蔬中的酚類底物氧化生成醌類，進而形成褐色物質(zhì)[19]。由圖2 可知，鮮切馬鈴薯的PPO 活性在貯藏期間呈上升趨勢，且各試驗處理組的PPO 活性始終低于對照組水平（P＜0.05），其中，柚皮提取物處理組和冷激復合柚皮處理PPO 酶活始終顯著低于冷激處理組（P＜0.05）。在貯藏8 d 時，冷激復合柚皮提取物處理組的PPO 活性水平最低，比對照組6 d 時的PPO 活性低18.5%。

鮮切馬鈴薯的POD 活性呈增長趨勢，與對照組相比，各處理組均維持了較低的POD 活性水平。柚皮提取物處理組和冷激復合柚皮提取物處理較冷激處理組更能抑制POD 酶活，且兩組的POD 酶活表現(xiàn)為始終低于冷激處理組，除了6 d 時冷激復合柚皮處理組的POD 酶活低于柚皮處理組外，兩處理組間POD 酶活無顯著差異。

PAL 是酚代謝的限速酶，能夠催化L-苯丙氨酸生成酚類物質(zhì)，在植物細胞受到環(huán)境中的不良脅迫時，PAL 活性隨之升高，進而增加褐變底物酚類物質(zhì)的濃度[20]。由圖2 可知，鮮切馬鈴薯樣品的PAL 活性總體呈先上升后下降的趨勢。這可能是因為機體受到機械損傷的脅迫，進而導致PAL 活性迅速上升，在貯藏2 d時，各組的PAL 活性均達到峰值，且各試驗處理組的峰值均顯著低于對照組（P＜0.05）。冷激復合柚皮提取物處理組始終維持鮮切馬鈴薯貯藏期間PAL 活性的最低水平，其PAL 活性抑制效果較單一處理好。8 d時，冷激復合柚皮提取物處理組的PAL 活性約為對照組的60%。

酚類化合物是酶促褐變的主要底物，酚類底物的積累會加速鮮切果蔬的酶促褐變進程。總酚含量整體呈上升的趨勢，柚皮提取物處理和冷激復合柚皮提取物處理組的總酚含量在貯藏期間始終顯著低于對照組（P＜0.05），冷激處理組在4 d 和6 d 時顯著低于對照組的總酚水平（P＜0.05）。貯藏8 d 后，冷激復合柚皮提取物處理組的總酚含量最低。

上述結果表明，柚皮處理、冷激處理、冷激復合柚皮處理均能不同程度抑制PPO、POD、PAL 活性，減少總酚含量的積累，綜合分析可知，冷激復合柚皮提取物處理效果最好。

2.3 不同處理方式對鮮切馬鈴薯MDA 和H2O2 含量的影響

不同處理方式對鮮切馬鈴薯MDA 和H2O2含量的影響見圖3。

圖3 不同處理方式對鮮切馬鈴薯貯藏期間MDA 和H2O2 含量的影響Fig.3 Effects of different treatment methods on MDA and H2O2 content of fresh-cut potato during storage

MDA 是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，是衡量細胞膜完整性的重要指標，MDA 含量越高，細胞膜的損傷程度越大[21]。由圖3 可知，MDA 含量隨著貯藏時間的延長呈增加趨勢，各試驗處理組樣品的MDA 含量水平始終低于對照組（P＜0.05）。說明柚皮提取物處理、冷激處理、冷激復合柚皮提取物處理能有效減小鮮切馬鈴薯的細胞膜損傷程度。在貯藏8 d 后，冷激復合柚皮提取物處理組的MDA 水平最低，比對照組MDA 含量低17%，說明復合處理比其他處理更能有效維持樣品細胞膜的完整性。

果蔬在受到機械損傷后能引起活性氧的迅速積累，并作為一種信號分子參與逆境響應，但過量的活性氧能促進氧化損傷，加速酶促褐變進程[22-23]。H2O2是具代表性的活性氧種類之一，貯藏期間樣品的H2O2含量呈先上升后下降的趨勢，相較對照組，各試驗處理組能在不同程度減少H2O2的積累。貯藏8 d 時，各試驗處理組H2O2含量均顯著低于對照組（P＜0.05），其中冷激復合柚皮提取物處理組的H2O2水平最低，柚皮提取物處理和冷激處理組間H2O2含量無顯著差異。表明冷激復合柚皮提取物處理能有效減少活性氧的積累，有助于減輕鮮切馬鈴薯褐變程度。

2.4 不同處理方式對鮮切馬鈴薯DPPH 自由基清除率和GSH 含量的影響

不同處理方式對鮮切馬鈴薯DPPH 自由基清除率和GSH 含量的影響見圖4。

圖4 不同處理方式對鮮切馬鈴薯貯藏期間DPPH 自由基清除率和GSH 含量的影響Fig.4 Effects of different treatment methods on DPPH radicals scavenging capacity and GSH content of fresh-cut potato during storage

通常情況下，果蔬的抗氧化能力可以使用DPPH自由基清除率來評價[24]。如圖4 所示，鮮切馬鈴薯的DPPH 自由基清除率呈先上升后下降的趨勢，柚皮提取物處理組、冷激處理組、冷激復合柚皮提取物處理組不同程度提高了DPPH 自由基清除率。其中，各試驗處理組中，復合處理組的DPPH 自由基清除率在貯藏期間始終顯著高于對照組（P＜0.05）。表明冷激復合柚皮提取物處理能有效提高鮮切馬鈴薯的抗氧化能力，進而減少氧化損傷。

GSH 是果蔬的抗氧化體系抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中一種重要的抗氧化物質(zhì)，能將脫氫抗壞血酸（dehydroascorbic acid，DHA）還原成抗壞血酸，在維持活性氧平衡、提高抗氧化能力、減輕酶促褐變等方面發(fā)揮重要作用[25-26]。由圖4 可知，單一處理和復合處理顯著提高了鮮切馬鈴薯的GSH 含量，除6 d 外，冷激復合柚皮提取物處理均維持了GSH 含量的最高水平。4 d時，各組的GSH 含量達到峰值，復合處理組的峰值比對照組高32%，貯藏8 d 時，復合處理組GSH 含量較對照組高14%。表明冷激復合柚皮提取物處理能維持樣品中較高的GSH 水平，有助于維持氧化還原平衡，減輕鮮切馬鈴薯的褐變癥狀。

3 結論

本研究探究柚皮提取物處理、冷激處理、冷激復合柚皮提取物處理對鮮切馬鈴薯的護色效果以及褐變反應關鍵酶活力、總酚含量、活性氧積累、抗氧化能力的變化規(guī)律。結果表明，與對照組相比，柚皮提取物處理、冷激處理、冷激復合柚皮提取物均在不同程度上有效提高了鮮切馬鈴薯的抗氧化能力，減輕了鮮切馬鈴薯的褐變癥狀，其中，冷激復合柚皮提取物處理的護色效果最佳。冷激復合柚皮提取物更好地維持了鮮切馬鈴薯的原有色澤，延緩了鮮切馬鈴薯的L*值的下降、a*值和總色差ΔE 值的增大，降低了PPO、POD、PAL 的活性和總酚含量，減少了MDA 和H2O2的積累，提高了DPPH 自由清除率和GSH 水平，在維持氧化還原平衡、減少膜脂氧化損傷和延緩鮮切馬鈴薯貯藏期間的褐變進程方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。因此，本研究為鮮切果蔬的褐變防控提供了一種簡單、安全、有效的保鮮方法和相應的理論參考依據(jù)，對合理利用柚皮的活性物質(zhì)、減少資源浪費、提升經(jīng)濟效益具有現(xiàn)實意義。