水錦樹蜜品質(zhì)特性及抗氧化活性分析

趙珊，酒元達(dá)，吳嬌，韓文素，鐘義海，高景林*，王釋婕*

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 海口 571101；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測試中心，海南 海口 571101）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，混合自身分泌物后釀造而成[1]，含有K、Ca、Na、Mg、Zn、Fe、Cu、Al、Cr、Mn 等多種元素[2]，可維持人體細(xì)胞功能和新陳代謝過程[3]。蜂蜜因蜜源植物及產(chǎn)地的不同，其礦物質(zhì)元素種類和含量存在較大差異[4]。蜂蜜除含有糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)外，還富含具有抗氧化、抗自由基、抗炎等作用的多種生物活性物質(zhì)[5]，其中蜂蜜中的總酚含量可以確定蜂蜜的植物源和地理來源，是用于評價(jià)蜂蜜真?zhèn)蔚闹匾笜?biāo)[6]。

蜂蜜的品質(zhì)與多種因素有關(guān)，如蜜源植物種類、地理來源以及采收時(shí)間等[7]。蜂蜜按蜜源植物分類可分為兩種，一是以蜜蜂采集的主要植物名稱來命名的單花蜜，二是蜜蜂從不同植物上采集花蜜釀造成的百花蜜[8]。由于我國蜂業(yè)資源布局不平衡，存在缺乏合理利用、蜜粉資源富余等情況，多年來市場銷售蜂蜜品種仍以洋槐蜂蜜、荊條蜜、棗花蜜、椴樹蜜、荔枝蜜、紫云英蜜、龍眼蜜和柑橘蜜等為主[9]。海南省擁有十分豐富的蜜源植物，加上其獨(dú)特的地理、氣候和土壤條件，形成了許多海南本地特色蜜源。結(jié)合海南蜂蜜市場供貨情況發(fā)現(xiàn)，百花蜜為主要蜂蜜品種之一[10]。水錦樹（Wendlandia uvariifolia Hance）既可以作為蜜源植物，又可藥用、觀賞。在云南，水錦樹是重要野生蜜源，流蜜量大，流蜜期為3 月～4 月[11]，經(jīng)感官指標(biāo)和幾種化學(xué)成分測定，證實(shí)云南紅皮水錦樹蜜具有較高的商業(yè)價(jià)值[12]。但目前水錦樹蜜還沒有作為商品蜜銷售，而且對水錦樹蜜的研究報(bào)道較少。因此，本研究通過對海南水錦樹蜜的理化指標(biāo)、元素成分及抗氧化活性測定，探討水錦樹蜜的品質(zhì)特性，旨在為具有區(qū)域特色的優(yōu)質(zhì)蜂蜜開發(fā)利用及市場推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用水錦樹蜜和百花蜜均于2020 年3 月初和3 月底由意大利蜜蜂采自儋州松濤水庫，蜂蜜收集后于室溫（25 ℃左右）保存待測。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（>98%）、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（>98%）：上海源葉生物科技有限公司；福林-西奧卡特（Folin-Ciocalteu）試劑：美國Sigma-Aldrich 公司；甲醇（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；碳酸鈉：西隴科學(xué)股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鋁：上海麥克林生化科技有限公司。HNO3（68%，UP 級）、H2O2（30%，UP 級）：蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。Rh 和Re 元素的單元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL）：國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.2 儀器與設(shè)備

色度測定儀（H196785）：漢鈉儀器（上海）有限公司；手持折光儀（model ATC-005）：溫州科爾特計(jì)量檢測儀器有限公司；高效液相色譜儀（ALLIANCE e2695）：沃特世科技（上海）有限公司；pH 計(jì)（雷磁PHSJ-4A）、電導(dǎo)率儀（雷磁DDS-307A）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；酶標(biāo)儀（200 PRO）：瑞士帝肯公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS NeXION 300）：珀金埃爾默股份有限公司；微波消解系統(tǒng)（MARS）：美國CEM 公司；電熱板（EH35-B）：北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜理化指標(biāo)測定

參考Wu 等[13]方法測定蜂蜜pH 值、水分含量、色度、葡萄糖含量、電導(dǎo)率等指標(biāo)。

1.3.2 元素含量測定

1.3.2.1 溶液配制

參照林宏等[14]方法配制內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液與多元素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.5 g 蜂蜜于微波消解罐中，加入1 mL H2O2和5 mL HNO3，置于電熱板（110 ℃）上40 min，然后進(jìn)行微波消解，冷卻至室溫，超純水定容至50 mL 后待測[14]。

1.3.2.3 ICP-MS 測定條件

選擇103Rh 作為K、Na、Ca、Mg 和Fe 內(nèi)標(biāo)，187Re 作為Cu、Mn 和Sr 內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)模式：VIS，采用在線加入法。其中K、Na、Ca、Mg、Fe 的測定采用KED 模式下的RPQ智能電子稀釋功能，Cu、Mn、Sr 的測定采用KED 模式。其他參數(shù)設(shè)置同林宏等[14]方法。

1.3.3 總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu 比色法[15]，準(zhǔn)確吸取0.1 g/mL蜂蜜溶液1.00 mL 至10.0 mL 容量瓶中，加入Folin-Ciocalteu 顯色劑1.00 mL，混勻后加入1 mol/L 碳酸鈉溶液5.0 mL，用蒸餾水定容，避光放置1 h，于760 nm波長處測定吸光度[16]。按照上述方法繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中總酚含量。

1.3.4 總黃酮含量測定

參照裴詠萍等[17]方法，將3 mL 蜂蜜溶液（0.1 g/mL）與1.0 mL AlCl3乙醇溶液（1%）混合，用95%乙醇定容，混勻并靜置10 min 后，于405 nm 波長處測定吸光度。按照上述方法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中總黃酮含量。

1.3.5 DPPH 自由基清除能力測定

參照Cheng 等[18]方法，分別吸取1 mL 蜂蜜溶液（40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL），加入4 mL DPPH 甲醇溶液（0.025 mg/mL）。混勻后在暗處靜置1 h，于517 nm波長處測定吸光度。空白對照（超純水）吸光度按上述方法測定。DPPH 自由基清除率按下式計(jì)算，計(jì)算出清除50% DPPH 自由基時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度（IC50）。

式中：R 為DPPH 自由基清除率，%；A0為空白對照的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有樣品均測定3 次，采用SPSS 24 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t 檢驗(yàn)，采用GraphPad Prism 7 軟件計(jì)算IC50，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜理化指標(biāo)

蜂蜜pH 值一般呈酸性，是影響蜂蜜貨架期的重要因素，采收和貯存蜂蜜過程會(huì)造成pH 值的變化[19]。兩種蜂蜜的理化特征見表1。

表1 水錦樹蜜和百花蜜的理化特征Table 1 The physicochemical parameters of W.uvariifolia honey and multifloral honey

由表1 可知，水錦樹蜜pH 值極顯著低于百花蜜（P<0.01），可能酸類物質(zhì)含量較高。蜂蜜中水分含量過高會(huì)引起蜂蜜發(fā)酵，生成醇和酸，造成蜂蜜變質(zhì)[20]。因此，水分含量作為蜂蜜成熟度的判別指標(biāo)[21]。同一地區(qū)的水錦樹蜜與百花蜜水分含量之間差異不顯著，均低于20%，符合GH/T 18796—2012《蜂蜜》的要求。紅皮水錦樹蜜水分含量（21.1%）[12]，高于本研究中水錦樹蜜水分含量（18.10%）。

水錦樹蜜中葡萄糖和果糖含量均顯著高于百花蜜（P<0.05），符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T 18796—2012 規(guī)定范圍（總含量超過60%）。水錦樹蜜中未檢測到蔗糖含量，符合GB 14963—2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)蜂蜜》要求（≤5%），而百花蜜的蔗糖含量為（6.50±0.14）g/100 g，雖高于GB 14963—2011 要求，但低于國際食品法典委員會(huì)規(guī)定（≤8%）。這兩種蜂蜜中蔗糖含量的差異可能是由于水錦樹蜜中的蔗糖全部轉(zhuǎn)化成果糖及葡萄糖。此外，紅皮水錦樹蜜中的蔗糖含量2.15%、葡萄糖含量38.64%[12]，均高于本研究中水錦樹蜜的蔗糖和葡萄糖含量。

蜂蜜色澤一般由種類決定，也會(huì)受一些外源因素的影響，如礦物元素的含量、花粉含量、熱處理程度、貯存時(shí)間長短等[22]。從表1 中可知，水錦樹蜜的顏色比百花蜜顏色深。

蜂蜜灰分含量與蜂蜜種類、季節(jié)、氣候、養(yǎng)蜂技術(shù)、地理因素有關(guān)，可用于分辨植物源[23]。水錦樹蜜的灰分含量為（0.20±0.02）g/100 g，極顯著低于百花蜜的灰分含量[（0.36±0.01）g/100 g]，均符合國際食品法典委員會(huì)和歐盟的標(biāo)準(zhǔn)（≤0.6%）。而且水錦樹蜜的灰分比紅皮水錦樹蜜灰分（0.075 2%）高[18]。

蜂蜜電導(dǎo)率與植物源、礦物元素含量、蛋白質(zhì)濃度及有機(jī)酸含量相關(guān)[24]。水錦樹蜜的電導(dǎo)率為（342.33±2.89）μS/cm，極顯著低于百花蜜電導(dǎo)率[（456.67±1.53）μS/cm]，且均符合國際食品法典委員會(huì)和歐盟規(guī)定蜂蜜的電導(dǎo)率范圍（≤0.8 mS/cm）。

2.2 蜂蜜元素分析

蜂蜜中礦物質(zhì)主要來自于植物源，因而不同種類蜂蜜中礦物元素組成及其含量有所差異[25]。

由圖1 可知，K、Ca、Na 及P 元素含量在兩種蜂蜜中存在差異，百花蜜中K 元素含量為（1 052.00±19.97）mg/kg，極顯著高于水錦樹蜜K 元素含量[（583.33±3.06）mg/kg]（P<0.01）。水錦樹蜜中Ca 與Na 的含量極顯著高于百花蜜（P<0.01），但兩種蜂蜜中Mg 元素的含量差異不顯著。

圖1 水錦樹蜜和百花蜜中常量元素的含量Fig.1 The content of macro-elements in W.uvariifolia honey and multifloral honey

除了常量元素外，Co、Cr、Cu、Fe、Mn 與Zn 是人類必不可少的營養(yǎng)元素。水錦樹蜜和百花蜜中微量元素的含量見表2。

表2 水錦樹蜜和百花蜜中微量元素的含量Table 2 The content of micro-elements in W.uvariifolia honey and multifloral honey mg/kg

由表2 可知，兩種蜂蜜中主要微量元素是B、Mn 與Fe，且在兩種蜂蜜中的含量均呈極顯著差異（P<0.01）。在所檢測的微量元素中，水錦樹蜜中B 元素的含量最高，為（5.02±0.07）mg/kg，百花蜜中Mn 元素的含量最高，為（4.86±0.14）mg/kg。蜂蜜中一些元素含量也是環(huán)境污染的重要指示物[26]，如Cd、Hg、Pb 等。兩種蜂蜜中均未檢測到Cd 與Hg 元素，另外Zn 和Pb 元素含量符合GB 14963—2011 規(guī)定的限量要求。

2.3 蜂蜜的抗氧化物質(zhì)含量及抗氧化能力分析

2.3.1 總黃酮含量和總酚含量

酚類和黃酮類化合物與蜜源植物和蜜蜂種類有關(guān)[27]。水錦樹蜜和百花蜜總黃酮和總酚含量見圖2。

圖2 水錦樹蜜和百花蜜總黃酮和總酚含量Fig.2 Total flavonoid content and total phenolic content of W.uvariifolia honey and multifloral honey

由圖2 可知，水錦樹蜜的總黃酮含量為（10.38±0.41）mg/100 g，極顯著高于百花蜜總黃酮含量[（7.92±0.38）mg/100 g]（P<0.01）；在總酚含量上，水錦樹蜜為（33.10±0.57）mg/100 g，顯著高于百花蜜[（32.06±0.24）mg/100 g]（P<0.05）。此外，水錦樹蜜顏色比百花蜜深，這與深色蜜的酚酸含量更高相吻合[28]。

2.3.2 DPPH 自由基清除能力

DPPH 自由基非常穩(wěn)定，在甲醇溶液中呈現(xiàn)深紫色，加入蜂蜜后，顏色越淺說明自由基被清除得越徹底。水錦樹蜜和百花蜜DPPH 自由基清除能力見圖3。

由圖3 可知，兩種蜂蜜均具有清除DPPH 自由基的能力，水錦樹蜜IC50為（2.97±0.36）mg/mL，百花蜜IC50為（3.48±0.09）mg/mL，兩者無顯著差異。IC50越低，清除效果越好，可見水錦樹蜜具有更強(qiáng)的抗氧化性。

各種蜂蜜之間的化學(xué)成分種類和含量不同，其抗氧化能力也存在明顯差異[24]。張敏等[29]研究發(fā)現(xiàn)椴樹、油菜、棗花、洋槐、荊條、蕎麥、龍眼、荔枝、黃芪、樹參10 種蜂蜜的DPPH 自由基清除能力具有差異性，IC50為16.25～674.22 mg/mL，其中洋槐蜜IC50值最高，其清除DPPH 自由基能力顯著低于其他蜂蜜（P＜0.05）。水錦樹蜜IC50遠(yuǎn)低于上述10 種蜂蜜IC50，可見其DPPH自由基清除能力更強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過對水錦樹蜜的理化指標(biāo)、元素和抗氧化活性（總酚、總黃酮、DPPH 自由基清除能力）進(jìn)行測定，結(jié)果表明，影響蜂蜜理化性質(zhì)的因素很多，同一地區(qū)的蜜源植物對蜂蜜理化性質(zhì)有較大影響。蜂蜜中元素含量差別較大，主要依賴于蜜源植物的種類，可用于蜂蜜品種鑒別以及品質(zhì)評價(jià)。水錦樹蜜的總黃酮和總酚含量較高，使得其具有較強(qiáng)的抗氧化能力。通過對蜂蜜植物來源鑒別和蜂蜜差異化優(yōu)勢比較，對挖掘和利用我國特色蜂蜜以及拓展我國蜂蜜的銷售市場具有十分重要的意義。