植物乳桿菌發酵豆薯的營養及揮發性成分變化

俞曼玲，黃晶晶，韓金志，汪少蕓，施曉丹，2*

（1.福州大學 生物科學與工程學院，福建 福州 350108；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

果蔬汁富含維生素、膳食纖維等營養物質，其清爽的口感深受人們喜愛。許多果汁在維持一氧化氮水平、抑制血小板聚集[1]以及預防心血管疾病等方面至關重要。益生菌是指活的微生物，當攝取足夠數量時，對宿主健康有益[2]。近年來，利用乳酸菌發酵新鮮果蔬汁成為食品行業的研究熱點之一。果蔬汁可為乳酸菌發酵提供適宜的生長環境。乳酸菌發酵能夠使果蔬及其衍生食品的貯藏和食用特性得到更好地維持和改善，對活性物質的降低以及抗氧化活性的維持也有輔助作用[3]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）來源于果蔬和自然發酵果蔬食品，能夠利用葡萄糖、麥芽糖、果糖和木糖等碳源產酸而不產氣，應用在發酵乳制品和植物源食品中，能夠促進腸道菌群平衡和人體胃腸道健康[4-7]。王紅梅等[8]的研究發現，在兩種水果汁基質中，植物乳桿菌的生長代謝有所不同。崔樹茂等[9]的研究表明植物乳桿菌CCFM8661 發酵蘋果汁具有排鉛功能。胡蘿卜汁、大蒜汁、生姜汁等經植物乳桿菌581發酵，其營養價值、感官品質、食用和貯藏性能均得到改善[10]。發酵果汁能夠改善人體益生菌的生長，對病原體微生物存在抑制作用[11]。

豆薯[Pachyrhizus erosus（Linn.）Urb.]又名涼薯、地瓜、土瓜等，屬于豆薯屬草質纏繞藤本植物[12]。原產亞熱帶，在我國長江以南普遍栽培，是我國華南和西南地區主要根菜之一。豆薯塊根肥大呈圓形，外皮淺黃，肉白脆甜，水分多，富含糖分、蛋白質和維生素C，可以生食，在我國南方地區常作為蔬菜食用[12]。豆薯具有生津止渴、抗氧化[13]和抗癌等功效[14]。與木薯等其他類似的根莖作物相比，豆薯蛋白質含量高出數倍[15]。目前對豆薯深加工產品的研究較少，已有的產品包括豆薯酸奶、果酒和罐頭等。康紅艷等[16]以涼薯為原料研制涼薯酸奶，豐富了涼薯的用途和酸奶產品的種類。豆薯塊根雪白清甜多汁，張華玲等[17]認為它是一種果酒發酵的好原料。譚沙等[18]利用酶法制備的豆薯飲料呈淡黃色，口感清爽酸甜，保留了涼薯的獨特風味。本研究以豆薯為原料，利用植物乳桿菌FZU122 發酵新鮮豆薯汁，測定不同發酵階段豆薯汁的基本理化指標、游離單糖、游離氨基酸、有機酸，以及揮發性成分以闡明植物乳桿菌發酵過程中豆薯汁的營養成分變化規律。本研究旨在為開發益生菌發酵豆薯汁產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豆薯：市售。植物乳桿菌FZU122：福州大學生物科學與工程學院。MRS 培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；單糖標品（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和果糖）：上海麥克林生化科技有限公司；2-辛醇：德國Dr.Ehrensorfer 公司；42 種游離氨基酸混合標準品：德國曼默博爾公司；8 種有機酸混合標準物質（酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丁二酸、丙酸）：北京北方偉業計量技術研究院。所有化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LDZF-50L-III 立式高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；ST3100 pH 計：奧豪斯儀器（常州）有限公司；A300氨基酸自動分析儀：德國曼默博爾公司；5977A 氣相色譜-質譜聯用儀：美國安捷倫科技有限公司；PDMS 固相微萃取頭、57330-U SPME 手動進樣柄：美國Supelco 公司；反相C18 柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）：美國Phenomenex 公司；Dionex-6000 離子交換色譜儀：美國戴安公司；LC-20A 高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵豆薯汁的制備操作要點

將新鮮豆薯用自來水洗凈、瀝干水分后切成大小均勻的小塊，放入榨汁機中榨汁。用200 目濾袋將濾漿過濾得到新鮮豆薯汁后，將豆薯汁倒入發酵罐中進行滅菌處理。冷卻至室溫，按照1×108CFU/mL 接種量接入植物乳桿菌FZU122 生理鹽水菌懸液（OD600nm為0.4～0.5），在37 ℃條件下恒溫靜置發酵。每隔24 h 取樣1次，測定pH 值，同時保存于-20 ℃冰箱中用于后續分析。

1.3.2 指標測定

采用pH 計測定pH 值；以牛血清蛋白為標準品，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[19]；采用3，5-二硝基水楊酸法測定總還原糖含量。

1.3.3 游離單糖組成測定

采用Dionex-6000 離子交換色譜儀進行單糖組成測定[20-21]。樣品經15 000 r/min 離心10 min 后，收集上清液，過0.22 μm 濾膜；取適量上清液經超純水稀釋1 000 倍后，采用離子交換色譜系統，并使用脈沖安培檢測器進行分析。柱溫：30 ℃。進樣體積設為25 μL；儀器部件溫度：25 ℃。流動相：A 相（20 mmol/L NaOH 溶液）；B 相（H2O）。采用A 相進行等濃度洗脫，流動相流速為0.5 mL/min。

1.3.4 游離氨基酸含量的測定

先將樣品在10 000 r/min 離心10 min，取上清液與10%磺基水楊酸以4∶1（體積比）混合均勻，過0.45 μm濾膜，于2～8 ℃冷藏24 h；取出，15 000 r/min 離心15 min，取上層清液再以15 000 r/min 轉速離心5 min。取上清液與樣品稀釋液按1∶9（體積比）混合，過0.22 μm濾膜后，收集于2 mL 自動進樣瓶。

1.3.5 揮發性組分的測定

采用頂空固相微萃取法結合氣相色譜-質譜聯用技術對植物乳桿菌發酵豆薯汁的香氣組分進行分析。色譜條件[22-23]：柱型采用DB-Wax 色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度為250 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃保留8 min，以4 ℃/min 的速率升至150 ℃，再以20 ℃/min 的速率升至250 ℃，保持5 min；載氣（He）流速1 mL/min，手動不分流進樣。質譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m/z 30～500。

樣品處理：取5 mL 發酵豆薯汁樣品于20 mL 樣品瓶中，分別加入1 g 氯化鈉和10 μL 2-辛醇內標溶液，濃度為10 mg/L。加入轉子，樣品瓶先在水浴磁力攪拌器40 ℃、600 r/min 條件下溫育20 min 后插入固相微萃取針，壓出萃取纖維，使其固定在距離液面0.5～1.0 cm處，吸附萃取30 min 后收回萃取纖維，拔出萃取針并插入氣相色譜-質譜聯用儀中進樣分析。將氣相色譜-質譜聯用儀中美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）11 和NIST 17 質譜數據庫、匹配度和保留時間與標準譜圖對照，再對各物質進行檢索。選擇相似度指數大于80 的物質作為有效的香氣成分。每次檢測時加入相同量的內標物2-辛醇進行定量分析，選擇匹配度等于或者大于80，同時對其進行定性分析，根據面積歸一化法對香氣成分對應峰進行定量。根據下列公式計算揮發性物質含量。

M=V1×C/V2

式中：M 為揮發性成分含量，mg/L；V1為揮發性物質峰面積；C 為內標物濃度，mg/L；V2為內標物峰面積。

1.3.6 有機酸濃度的測定

參考Tu 等[24]的方法測定樣品有機酸濃度，將樣品15 000 r/min 離心5 min，過0.22 μm 濾膜，將樣品經超純水稀釋10 倍后，使用LC-20A 高效液相色譜儀進行檢測。色譜條件：流動相為磷酸二氫鈉溶液（0.01 mol/L，pH2.7）過0.22 μm 濾膜，超聲處理20 min 后備用；色譜柱為反相C18 柱（250 mm×4.60 mm，5 μm），柱溫25 ℃；使用紫外檢測器，檢測波長為210 nm；進樣量為20 μL，流動相流速為0.8 mL/min。

1.4 數據處理

數據采用GraghPad prism 9、OriginPro 2018 作圖。采用Excel 2010，SPSS Statistics 對數據進行分析，不同字母表示差異顯著（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 發酵豆薯汁理化指標測定結果

采用植物乳桿菌對豆薯汁進行發酵，觀察其pH值、總還原糖和游離蛋白質含量變化，其結果見表1。

表1 不同發酵時間豆薯汁pH 值、總還原糖含量和總游離蛋白質含量變化Table 1 Changes in pH，reducing sugar，and free protein of jicama juice fermented for different time periods

由表1 可以得出，隨著發酵時間的延長，相較于未發酵的豆薯汁，發酵豆薯汁的pH 值在發酵24 h 后下降明顯，24～72 h 時，pH 值逐漸下降，表明植物乳桿菌能夠在豆薯汁中代謝產酸。豆薯汁中的總還原糖含量顯著變化（P<0.05）。這可能是因為在發酵過程中，植物乳桿菌能夠利用豆薯汁中與能量代謝相關的碳源物質來促進細胞生長、合成碳骨架以及能量補給，因此總還原糖含量明顯下降。發酵72 h 的豆薯汁總還原糖含量明顯上升，可能是植物乳桿菌在代謝過程中產生了少量還原糖。發酵后，豆薯汁中的總游離蛋白質含量先減少后增加并趨于平緩。總游離蛋白質含量先下降可能是由于部分游離蛋白質降解為小分子肽形式，而后略微增加可能是菌體蛋白所導致。因此，植物乳桿菌FZU122 對發酵豆薯汁的蛋白質含量整體無明顯影響。

2.2 發酵豆薯汁游離單糖組成變化

采用離子交換色譜儀測定發酵豆薯汁中游離單糖組成，結果如圖1 所示。

圖1 不同發酵時間豆薯汁中游離單糖組成Fig.1 Changes in content of free monosaccharides in jicama juice fermented for different time periods

發酵豆薯汁中主要有葡萄糖和果糖兩種游離單糖。由圖1 可知，隨著發酵時間的延長，在0～48 h 內，總游離單糖含量呈現先增加后減少的趨勢，出現這種現象的原因在于發酵初期，植物乳桿菌將更多的多糖轉化為還原糖[25]。在24～48 h 時，總游離單糖含量下降。產生這種現象可能是由于豆薯汁能為發酵體系中的微生物提供充足的能量，使植物乳桿菌利用碳源的速度加快，導致發酵體系中總體游離單糖含量呈現下降趨勢。在整個發酵過程中，葡萄糖與果糖的比例整體呈現下降趨勢，依次為1.78±0.16、1.48±0.07、1.45±0.04和1.44±0.03。這可能是因為在碳源充足的情況下，植物乳桿菌優先利用葡萄糖，使得葡萄糖含量在發酵48 h 時呈現下降趨勢。而葡萄糖與果糖的比例下降表明植物乳桿菌會利用果糖等碳源物質。而植物乳桿菌在發酵后期不再大量利用碳源物質，發酵后期pH 值較低，也會抑制發酵中其他菌落生長[26]，因此兩種還原糖含量趨于平緩。

2.3 發酵豆薯汁游離氨基酸組成變化

為了確定不同發酵時間游離氨基酸組成差別，對發酵豆薯汁的游離氨基酸進行聚類分析，結果見圖2。

圖2 不同發酵時間豆薯汁中游離氨基酸含量聚類熱圖Fig.2 Heat map of free amino acid content in jicama juice fermented for different time periods

由圖2 可知，在4 組豆薯汁中共檢測出20 種氨基酸。游離氨基酸組成被分為3 組，其中0 h 為第1 組，24 h 和48 h 為第2 組，72 h 為第3 組。結果表明，在整個發酵過程中，豆薯汁中的總游離氨基酸含量依次為1.84、1.19、1.48 mg/mL 和1.25 mg/mL。與總游離蛋白質含量變化趨勢不同，豆薯汁中的游離氨基酸組成經植物乳桿菌發酵會發生明顯的變化。發酵72 h 前，圖2中大部分游離氨基酸的含量呈下降趨勢[27]。根據所測定數據，在20 種氨基酸中天冬酰胺含量最高，并由圖2 可知，其含量呈現先明顯下降后逐漸上升然后趨于穩定的變化趨勢。在發酵24 h 后存在于原豆薯汁中的絲氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸均未被檢測出，孫承鋒等[28]的研究表明，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸具有苦味。隨著發酵時間的延長，天冬氨酸、牛磺酸、甘氨酸、丙氨酸含量顯著增加。而其中天冬氨酸是具有鮮味的氨基酸，甘氨酸、丙氨酸具有甜味[28]。這些變化對于豆薯汁的風味有明顯改善，可促進甜味氨基酸的釋放以及減少苦味氨基酸。

2.4 發酵豆薯汁揮發性成分分析

不同發酵時間豆薯汁揮發性成分含量變化見表2。

表2 不同發酵時間豆薯汁揮發性成分含量變化Table 2 Changes in content of volatile components of jicama juice fermented for different time periods

由表2 可知，共檢測出17 種匹配度大于80 的香氣組分，其中包括醛類2 種、醇類7 種、酸類1 種以及其他類7 種。醛類物質主要存在于未發酵的豆薯汁，其中己醛和反式-2-己烯醛含量在未發酵豆薯汁中含量較高，而經過發酵后其不再被檢出。己醛具有草腥味，被認為是產生豆腥味的主要原因[29]。醇類揮發性物質為發酵豆薯汁的主要香氣組分，其中包括1-辛烯-3-醇、1-辛醇、芳樟醇、1-壬醇、順-2-壬烯-1-醇、α-松油醇和反式-2-己烯-1-醇。在醇類物質中，1-辛烯-3-醇和芳樟醇在未發酵及不同發酵進程豆薯汁中均被檢出。在未發酵豆薯汁中1-辛烯-3-醇的含量比發酵后含量高。陳紅麗等[29]的研究表明，1-辛烯-3-醇具有蘑菇的味道，也是產生豆腥味的物質之一。而其中的芳樟醇既有紫丁香、鈴蘭香和玫瑰花香，又有木香、果香。發酵后，己醛、1-辛烯-3-醇等含量有所降低。而1-壬醇、順-2-壬烯-1-醇、α-松油醇和反式-2-己烯-1-醇4 種揮發性成分均在發酵48 h 后被檢出。這些新產生的物質中，1-壬醇具有強烈的玫瑰味和橙花香氣[30]，α-松油醇具有丁香味，反式-2-己烯-1-醇具有未成熟果實氣味，這也有利于改善發酵豆薯汁的風味。正己酸在未發酵豆薯汁中未檢測到，而在隨后的發酵進程中均存在。正己酸天然存在于椰子油、草莓，具有椰子油脂氣味。作為食用香料，常應用于水果香精和奶油等，表明植物乳桿菌發酵進一步豐富了豆薯汁的風味。

2.5 有機酸濃度變化分析

以8 種有機酸為標品，采用高效液相色譜法測定植物乳桿菌發酵豆薯汁中有機酸濃度變化，結果見圖3。

圖3 不同發酵時間豆薯汁有機酸濃度Fig.3 Concentrations of organic acids in jicama juice fermented for different time periods

由圖3 可以看出，在整個發酵過程所檢測的7 種有機酸中，未發酵豆薯汁中的有機酸僅有4 種，為酒石酸、乙酸、丁二酸和丙酸，其中酒石酸的濃度最高。但在發酵48 h 后，蘋果酸、乳酸、檸檬酸濃度較未發酵豆薯汁中的酸濃度均有明顯增加，而酒石酸濃度隨著發酵進程出現顯著下降（P<0.05）。分析原因可能是酒石酸能夠被乳酸菌降解生成乳酸或乙酸，使揮發酸含量降低[31]。

發酵前，酒石酸是豆薯中的主要代謝產物。而發酵24 h 后，蘋果酸和乳酸為主要的有機酸成分。蘋果酸的濃度隨著發酵進程呈現上升趨勢，在所有有機酸中濃度最高，發酵72 h 后可達到5.458 mg/mL。在發酵24 h 后，蘋果酸含量明顯增加，蘋果酸廣泛存在于植物果實中，酸度較強。根據理化指標結果中測定的豆薯汁在發酵24 h 后pH 值明顯下降，與有機酸分析結果一致。發酵期間，蘋果酸可能會在蘋果酸-乳酸酶的催化下發生脫羧反應生成乳酸[32-33]，其含量隨參與的生化反應進行動態變化。乳酸具有抑制腸道雜菌生長繁殖、調節正常菌群的功能。檸檬酸可以被乳酸菌利用生成乳酸、乙酸和雙乙酰等產物。在發酵48 h 后，檸檬酸濃度在原料中降低，使發酵后的產品口感更加柔和，刺激性小。

3 結論

本研究以豆薯汁為發酵基質，以植物乳桿菌在液體培養基的生長為參考，研究發酵時間（0、24、48、72 h）對豆薯汁基本理化指標、游離單糖、游離氨基酸、有機酸和揮發性成分的影響。研究發現，經過植物乳桿菌發酵后，豆薯汁的pH 值顯著下降。植物乳桿菌會利用豆薯汁中的還原糖作為碳源物質，使得發酵48 h 時，總還原糖含量顯著下降，兩種主要單糖葡萄糖和果糖的比例逐漸降低，游離單糖比例降低。發酵豆薯汁中具有苦味的氨基酸，如纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸等含量下降，而具有鮮味和甜味的氨基酸如天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸等氨基酸含量呈上升趨勢。天冬酰胺在發酵過程中含量較高。揮發性成分分析發現，醇類物質為發酵豆薯汁的主要香氣組分，醛類物質發酵后未被檢出。主要產生豆腥味的己醛和1-辛烯-3-醇兩種揮發性組分含量降低，而芳樟醇、1-壬醇、α-松油醇、正己酸等有益物質含量增加。發酵72 h后，蘋果酸濃度顯著增加，在所有有機酸中濃度最高。綜上，植物乳桿菌發酵在一定程度上賦予了豆薯汁更加豐富的品質，并且產生了更多的營養物質。游離氨基酸含量、香氣組分以及有機酸濃度顯著增加，減少了豆薯本身具有的一些不良氣味，保留了豆薯的獨特風味。本研究結果可為開發益生菌發酵豆薯汁產品提供參考。