川芎蛋白-葡聚糖共聚物的制備工藝優(yōu)化及其抗氧化性

王海燕，李佳璇，韋利芬，阮婧華，唐東昕，辛加敏，查鑫

（1.貴州中醫(yī)藥大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001）

川芎蛋白（Ligusticum chuanxiong protein，LCP）為傘形科植物川芎的干燥根莖的分離蛋白。前期研究表明，LCP 提取率較高，且具有較好的抗氧化能力，但其溶解度較差，限制了其作為天然抗氧化劑在食品行業(yè)的應用[1]，所以有必要對LCP 進行有效地改性處理。相比物理法（高壓加工、高壓均質化和高強度超聲）和酶法（谷氨酰胺轉胺酶、氧化酶和酶修飾）的改性方式，糖基化改性被稱為“綠色工藝”，是自發(fā)進行的反應，無需添加化學物質，具有綠色、安全的優(yōu)勢。反應實質是蛋白質氨基與還原糖羰基的共價結合[2]，使得糖基化共聚物同時具有蛋白質的大分子特性和多糖的親水特性，從而改善蛋白質溶解度，提高蛋白質的抗氧化性。

葡聚糖（dextran，Dex）是一種中性多糖，具有還原性，是糖基化反應的必要條件之一，并且中性電荷可抑制蛋白質與多糖之間靜電絡合的形成[3]。其葡萄糖殘基由α-1，6 鍵連接成線性鏈，具有很高的靈活性，可與蛋白質緊密纏繞，為糖基化下的分子間聚集提供強大的空間位阻[4]，是制備蛋白質-多糖共聚物的理想材料。本研究以接枝度（degree of grafting，DG）為評價指標，通過Box-Behnken 響應面法優(yōu)化川芎蛋白-葡聚糖共聚物（glycosylated Ligusticum chuanxiong protein，GLCP）制備條件，并對在最優(yōu)條件下所得的GLCP 進行抗氧化性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川芎：四川千方中藥股份有限公司；葡聚糖、考馬斯亮藍R250、四硼酸鈉、鄰苯二甲醛、溴酚藍：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉：北京酷來搏科技有限公司；羥自由基清除能力試劑盒、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]自由基清除能力試劑盒：蘇州格銳思生物科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MINIB-100I 金屬浴：杭州米歐儀器有限公司；Mini PROTEAN Tetra Cell 電泳儀：美國BIO-RAD 公司；UV-6000PC 紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；Quanta 450 FEG 掃描電鏡：美國FEI 公司；Nicolet Is50 傅里葉變換紅外光譜：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LCP 的提取

采用飽和酚法[5]提取LCP。稱取脫脂后川芎藥材粉末0.5 g，加入預冷丙酮3 mL，置于-20 ℃冰箱浸提30 min。3 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，分別加入80%丙酮、0.1 mol/L 乙酸銨的80%甲醇液洗滌。沉淀中加入細胞裂解液2.5 mL 重懸，再加入Tris-飽和酚溶液2.5 mL，充分搖勻，靜置1 h。3 000 r/min 離心5 min，收集上清液，加入3 倍量0.1 mol/L 乙酸銨的80%甲醇液，置于-20 ℃冰箱，放置過夜。3 000 r/min 離心5 min，收集沉淀，分別用甲醇、80%丙酮洗滌沉淀，-80 ℃冷凍干燥即得LCP。

1.3.2 DG 測定

采用鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）法[6]，稱取OPA 80 mg 溶解于2 mL 的甲醇中，依次加入20%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液5 mL、0.1 mol/L 硼砂溶液50 mL，β-巰基乙醇200 μL，定容至100 mL。取配制的OPA 試劑4 mL 加入GLCP 溶液200 μL，混勻，于35 ℃水浴鍋中反應2 min，340 nm 測其吸光值A1，相同條件下加入200 μL LCP 溶液為空白，測定吸光值A0，二者之差為自由氨基的凈吸光值，通過以下公式計算接枝度（D，%）。

1.3.3 GLCP 的單因素考察

采用濕熱法[7]，將提取的LCP 與Dex 配制成一定比例的溶液，磁力攪拌1 h，調pH 值，置于水浴中反應，反應后迅速冷卻，得到GLCP。

1.3.3.1 不同底物質量比對DG 的影響

按照3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 的底物質量比準確稱取Dex 與LCP，加入去離子水4 mL 溶解，磁力攪拌1 h，用0.1 mol/L 的氫氧化鈉調節(jié)溶液的pH 值至9.0。將調好pH 值的溶液放入水浴加熱反應，設定反應溫度為70 ℃、反應時間為150 min，反應結束后立即用冷水停止其反應，得糖基化產物，對其接枝度進行測定。單因素試驗均重復3 次。

1.3.3.2 不同pH 值對DG 的影響

參照1.3.3.1 方法，分別選取反應pH 值為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，其他條件固定為底物質量比2∶1，反應溫度70 ℃、反應時間150 min。

1.3.3.3 不同反應時間對DG 的影響

參照1.3.3.1 方法，分別選取反應時間為90、120、150、180、210 min，其他條件固定為底物質量比2∶1、pH9.0、反應溫度70 ℃。

1.3.3.4 不同反應溫度對DG 的影響

參照1.3.3.1 方法，分別選取反應溫度為30、50、70、90、110 ℃，其他條件固定為底物質量比2∶1、pH9.0、反應時間150 min。

1.3.4 糖基化川芎蛋白響應面優(yōu)化試驗建立

根據(jù)單因素試驗結果分析，以A 底物質量比、B pH 值、C 反應時間、D 反應溫度為自變量，DG 為響應值，采用Design Export 8.0.6 軟件分析，通過四因素三水平優(yōu)化制備過程。每組平行試驗3 次，響應面優(yōu)化試驗因素和水平見表1。

表1 響應面優(yōu)化試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface optimization

1.3.5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSpolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的測定

配制12%分離膠，5%濃縮膠，進行垂直電泳。樣品和3 倍量溴酚藍緩沖液渦旋混合，置于100 ℃金屬浴加熱反應10 min，待冷卻后，取樣品10 μL，標準蛋白（Maker）5 μL 上樣。初始電壓為80 V，待指示劑進入分離膠后電壓調為120 V，距離電泳板底部0.5 cm 時，停止電泳。電泳完畢，取出膠片，置于考馬斯亮藍R-250中染色，凝膠背景透明為止，于脫色液（冰醋酸∶甲醇∶水=1∶4∶10，體積比）中進行脫色處理，直至條帶清晰，觀察分子量。

1.3.6 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察

取少量LCP 和GLCP 樣品固定于雙面導電膠上，進行噴金處理，厚度約為10 nm 的電鍍層，在20 kV 電壓下進行電子掃描，拍攝具有代表性樣品圖。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）的測定

分別取適量LCP、GLCP 干燥凍干粉末，按照1∶100（質量比）加入溴化鉀進行壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀做全波段掃描（4 000～400 cm-1），掃描次數(shù)32 次。

1.3.8 抗氧化性的測定

1.3.8.1 羥自由基清除能力的測定

取濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的樣品溶液各125 μL，分別加入試劑盒中試劑一、試劑二、試劑三各125 μL 和蒸餾水500 μL 作為測定組。樣品溶液125 μL，試劑一、試劑二各125 μL 和蒸餾水625 μL 作為對照組。試劑一、試劑二、試劑三各125 μL 和蒸餾水625 μL 作為空白組。以VC為陽性對照。混勻后，37 ℃水浴反應20 min，510 nm 下測吸光值。

式中：X 為羥自由基清除率，%；A0為空白組吸光值；A1為測定組吸光值；A2為對照組吸光值。

1.3.8.2 ABTS+自由基清除能力的測定

取濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的樣品溶液各50 μL，加入試劑盒中工作液950 μL 作為測定組。樣品溶液50 μL，無水乙醇950 μL 作為對照組。無水乙醇50 μL 和工作液950 μL 作為空白組。以VC為陽性對照。混勻后，25 ℃避光反應6 min，734 nm 下測吸光值。

式中：Y 為ABTS+自由基清除率，%；A0為空白組吸光值；A1為測定組吸光值；A2為對照組吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，使用Excel 2019 進行處理；Design Expert 8.0.6 進行響應面優(yōu)化；Origin 2018 繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

糖基化反應是蛋白質游離氨基和還原糖羰基之間的共價結合，接枝度表示反應前后的游離氨基酸含量的變化，以此判斷糖基化反應程度，接枝度越大，說明反應越完全[8]。單因素試驗結果見圖1。

圖1 各單因素對接枝度的影響Fig.1 Effects of single factors on the degree of grafting

由圖1A 可知，隨LCP 添加量的增大，接枝度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在底物質量比為2∶1 時，接枝度達到最大值為（35.40±0.56）%。可能是體系中糖比例較高時，活性位點接觸機率較大，有利于糖基化進程。當?shù)鞍踪|比例較大時，由于蛋白質的空間位阻影響，活性位點接觸機率降低，糖基化反應受到影響，從而接枝度降低[9]。綜合考慮選擇底物質量比為3∶1、2∶1、1∶1進行響應面優(yōu)化試驗。

由圖1B 可知，隨著pH 值的增大，接枝度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當pH 值為9.0 時，接枝度達到最大值（34.94±0.32）%。可能是隨著pH 值的增大，偏離等電點，溶解度增大，從而使游離氨基增加，羰氨結合，利于糖基化反應。但強堿條件下，LCP 易發(fā)生變性，蛋白質分子內部疏水基團暴露于分子表面[10]，而親水基團相對較少，不與水相相溶，集聚成團，溶解度降低[11]，從而接枝度下降。綜合考慮選擇pH 值為8.0、9.0、10.0進行響應面優(yōu)化試驗。

由圖1C 可知，隨著反應時間的增長，接枝度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在反應時間為150 min 時，接枝度達到最大值（34.78±0.39）%。可能是隨著反應進行，LCP 中游離氨基逐漸暴露，與Dex 中羰基結合，進行糖基化反應，接枝度隨著反應時間延長而增大。反應150 min 后，達到美拉德反應后期，生成類黑素、還原酮，與蛋白質發(fā)生交聯(lián)作用，從而阻礙糖基化改性[12]。綜合考慮選擇反應時間120、150、180 min 進行響應面優(yōu)化試驗。

由圖1D 可知，隨著反應溫度的升高，接枝度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在反應溫度為70 ℃時，接枝度達到最大值（35.07±0.63）%。可能是由于葡聚糖分子含有多個羥基，引入親水羥基與蛋白質分子結合，一定程度上保護了蛋白質，使其不易聚集，增大了溶解度，從而體系中自由氨基增加，接枝度隨之增大。隨著溫度的升高，蛋白質在高溫條件下，容易發(fā)生變性，空間結構遭受破壞，鏈與鏈之間分子間氫鍵易團聚[13]，導致溶解度降低，自由氨基的減少，從而使接枝度降低。綜合考慮選擇加熱溫度50、70、90 ℃進行響應面優(yōu)化試驗。

2.2 響應面優(yōu)化糖基化川芎蛋白制備工藝

2.2.1 響應面優(yōu)化試驗設計及結果

每組樣品平行測定3 次，取平均值，進行統(tǒng)計分析。Design Expert 8.0.6 軟件進行響應面設計及結果分析，如表2 所示。

表2 響應面試驗方案與結果Table 2 Scheme and results of response surface test

由表2 得擬合方程為Y=35.10-0.60A+0.52B+0.67C+1.21D-2.50AB-0.047AC-0.51AD+0.36BC+0.092BD+0.61CD-2.40A2-3.04B2-4.60C2-3.84D2。

2.2.2 方差分析結果

響應面試驗方差分析見表3。

表3 響應面試驗方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface test

如表3 所示，由模型F 檢驗值可知，F(xiàn)=58.34，P<0.01，表明此回歸模型極顯著。方程失擬項F=0.83，P=0.635 1>0.05，失擬項不顯著，表明回歸模型與試驗實測值擬合度較好，誤差較小，可以使用該回歸方程預測糖基化川芎蛋白的接枝度。根據(jù)各因素F 值的比較可知，各因素對響應值影響大小為反應溫度>反應時間>底物質量比>pH 值。通過對回歸方程系數(shù)的顯著性分析，可知一次項A、B、C、D 的P 值均小于0.01，表明反應溫度、反應時間、底物質量比、pH 值對接枝度的影響極顯著；二次項A2、B2、C2、D2影響極顯著（P<0.01）；交互項AB 影響極顯著（P<0.01），AC、AD、BC、BD、CD影響不顯著（P>0.05）。R2=0.983 1，R2Adj=0.966 3，表示所建立的模型置信度較高，能夠很好地反映自變量與響應值之間的關系。

2.2.3 因素交互作用

利用Design Expert 8.0.6，分析底物質量比、pH 值、反應時間、反應溫度交互作用對接枝度的影響，結果見圖2～圖7。

圖2 底物質量比與pH 值相互作用的等高線圖與響應面圖Fig.2 Contour diagram and response surface diagram of interaction between substrate ratio and pH

圖3 底物質量比與反應時間相互作用的等高線圖與響應面圖Fig.3 Contour diagram and response surface diagram of interaction between substrate ratio and time

圖4 底物質量比與反應溫度相互作用的等高線圖與響應面圖Fig.4 Contour diagram and response surface diagram of interaction between substrate ratio and temperature

圖5 pH 值與反應時間相互作用的等高線圖與響應面圖Fig.5 Contour diagram and response surface diagram of interaction between pH and time

圖6 pH 值與反應溫度相互作用的等高線圖與響應面圖Fig.6 Contour diagram and response surface diagram of interaction between pH and temperature

圖7 反應時間與反應溫度相互作用的等高線圖與響應面圖Fig.7 Contour diagram and response surface diagram of interaction between time and temperature

由圖2～圖7 可知，底物質量比、pH 值、反應時間、反應溫度4 個因素在所選范圍內存在極值，即等高線中最小橢圓的中心點。結果表明，AB 交互作用顯著，與F 值結果一致。

2.2.4 驗證試驗

經Design Expert 8.0.6 分析，該模型得到糖基化川芎蛋白制備最優(yōu)條件為底物質量比1.75∶1、pH9.19、反應時間152.83 min、反應溫度73.67 ℃，預測接枝度為35.37%。因考慮實際操作可行性，將驗證條件修改為底物配質量比1.8∶1、pH9、反應時間153 min、反應溫度74 ℃，平行試驗3 次。經過驗證試驗，平均接枝度為（35.21±0.12）%，接近理論值，表明該模型可用于優(yōu)化糖基化川芎蛋白的制備過程。

2.3 SDS-PAGE 結果

SDS-PAGE 是對蛋白質的亞基及分子質量分析的重要手段，并且可用于對蛋白質糖基化后是否生成共聚物作定性鑒別[14]。圖8 是對LCP 及其糖基化產物進行考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE 圖譜。

圖8 Maker、LCP、GLCP SDS-PAGE 電泳圖Fig.8 SDS-PAGE of Maker，LCP and GLCP

由圖8 可知，泳道3、4 亞基譜帶顏色與泳道1、2相比，顏色變淺，可能是LCP 與Dex 經過濕熱法糖基化后，生成了共聚物，LCP 中活性基團減少，從而蛋白質分子與考馬斯亮藍結合減少，出現(xiàn)亞基譜帶顏色變淺[15]。另一方面，小分子的蛋白質與糖共價結合后，生成大分子的共聚物向上集聚，因此出現(xiàn)亞基譜帶顏色變淺。濃縮膠頂端P1 以及濃縮膠與分離膠接縫處P2均出現(xiàn)新的條帶，分析可能是LCP 與Dex 糖基化反應后，生成的共聚物分子量較大[16]，電泳時，這些共聚物無法通過凝膠，只能聚集在P1 和P2 處。通過亞基譜帶顏色變淺，以及出現(xiàn)新的條帶，可以說明LCP 與Dex糖基化后生成了共聚物。

2.4 SEM 觀察

SEM 結果見圖9。

圖9 樣品掃描電鏡圖Fig.9 Scanning electron microscopy of samples

由圖9 所示，LCP 糖基化前后，結構明顯不同。圖9A 表明，糖基化前LCP 呈顆粒狀，近圓球形，大小不一。圖9B 為LCP 與Dex 簡單物理混合后的掃描電鏡圖，兩者的混合物具有LCP 相似的結構，表面可以看出LCP 所具備的近圓球形形態(tài)，可以推測兩者之間并沒有化學鍵締合，而是物理混合。圖9C 為糖基化后的LCP，原本的近圓球形態(tài)消失，表面結構變得疏松多孔，呈現(xiàn)蜂窩狀，可能是LCP 與Dex 共價結合，糖基化過程引入糖鏈，LCP 肽鏈逐漸延展開，形成的這種結構特點[17]，可以更好地提高蛋白質的溶解性，從而提高其功能特性。Qu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，糖基化的菜籽分離蛋白結構變得疏松多孔，呈現(xiàn)蜂窩狀，與此結果一致。

2.5 FTIR 結果分析

FTIR 結果見圖10。

圖10 LCP、GLCP 傅里葉變換紅外光譜圖Fig.10 Fourier transform infrared spectra of LCP and GLCP

FTIR 是分析蛋白質與多糖共價結合后，分子水平上相互作用和結構變化的有效手段[19]。由圖10 所示，與LCP 比較，GLCP 在波數(shù)為3 600～3 200 cm-1范圍內出現(xiàn)了明顯增強的吸收峰，可能是由于Dex 的引入，體系中-OH 增多，伸縮振動引起的變化[20]。Zhao 等[21]利用大豆寡糖糖基化改性大豆分離蛋白，紅外光譜也顯示在3 600～3 200cm-1處吸收峰增強，與本文結果相似。在波數(shù)1 630、1 530、1 240 cm-1處，吸收峰表現(xiàn)出了不同程度的變化，這3 個波數(shù)分別在酰胺I 帶（1 700～1 600 cm-1）、酰胺II（1 580～1 480 cm-1）、酰胺III（1 300～1 200cm-1）范圍內，分別是由于C=O 伸縮振動、N—H彎曲振動、C—N 拉伸和N—H 變形振動引起的[22]。波數(shù)為1 020 cm-1時，GLCP 吸收峰強度與形狀變化明顯，可能是糖基化反應中新形成的C—N 共價鍵伸縮振動引起[23]。通過上述吸收峰的變化，可以表明LCP 與Dex 以共價鍵的方式結合，從而引起蛋白質二級結構的變化。

2.6 抗氧化性結果分析

抗氧化性試驗結果見圖11。

圖11 LCP、GLCP 對羥自由基和ABTS+自由基的清除能力Fig.11 Scavenging abilities of LCP and GLCP on hydroxyl radical and ABTS+radical

羥自由基清除率是評價自由基清除能力的重要指標，有效清除自由基是針對自由基誘導的氧化應激引起的各種疾病的保護方法之一[24-25]。由圖11A 所示，隨著樣品濃度的增大，LCP、GLCP 對羥自由基的清除率均呈現(xiàn)上升趨勢，并且GLCP 在濃度為0.8 mg/mL 后，上升速度較快，在濃度為1.0 mg/mL 時，清除率為（65.91±1.93）%。在相同的濃度范圍內，羥自由基清除能力強弱依次為VC＞GLCP＞LCP，其中陽性對照VC的IC50值為0.67 mg/mL，GLCP 的IC50值為0.88 mg/mL，LCP 的IC50值為2.20 mg/mL。由此可以看出GLCP 的清除效果雖不及VC，但強于LCP。楊志偉等[26]研究β-葡聚糖糖基化對裸燕麥蛋白抗氧化活性時，發(fā)現(xiàn)糖基化裸燕麥蛋白羥自由基清除率是原蛋白的2.13 倍，可以證實經過糖基化反應，清除羥自由基能力可以得到提高。

由圖11B 所示，隨著樣品濃度的增大，LCP、GLCP對ABTS+自由基的清除率均呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，其中GLCP 趨勢較陡，有明顯的量效關系。當其濃度達到1.0 mg/mL 時，GLCP 對ABTS+自由基的清除率為（81.80±2.18）%，LCP 為（41.63±2.18）%。VC組IC50值為0.16 mg/mL，GLCP 的IC50值為0.45 mg/mL，LCP 的IC50值為1.5 mg/mL，可以推測出GLCP 具有良好的清除ABTS+自由基能力。有關乳清蛋白研究也表明，糖基化后乳清蛋白清除ABTS+自由基能力有明顯提高[27]。

通過抗氧化試驗結果，可以得出GLCP 對羥自由基、ABTS+自由基的清除能力雖弱于VC，但均強于LCP，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。分析可能是經過糖基化后，其結構性質的改變，使其溶解度的增加，在相同濃度下，GLCP 更易溶于水，可向自由基提供質子[28]。另一方面，美拉德反應會產生一些類黑素物質，而這些物質是自由基清除能力的貢獻者[29]。并且糖基化的蛋白質有較好的供氫能力，更易與自由基反應[30]。

3 結論

利用單因素及響應面法優(yōu)化LCP 糖基化最佳工藝條件為底物質量比（Dex∶LCP）1.8∶1、溶液pH9、反應時間153 min、反應溫度74 ℃。在此條件下糖基化的平均接枝度為（35.21±0.12）%。SDS-PAGE 分析可知，LCP 與Dex 生成共聚物，并且分子量較大，電泳時，滯留在濃縮膠頂端以及濃縮膠與分離膠接縫處；SEM 分析可知，生成的共聚物表面結構呈現(xiàn)疏松多孔，蜂窩狀；通過特征吸收峰不同程度的變化可知，LCP 二級結構有所改變。通過對自由基清除能力的測定，GLCP 相比原蛋白其抗氧化能力均有提升。綜上所述，采用濕熱法糖基化改性LCP，LCP 溶解度得到改善，從而抗氧化性提高，可能是該過程引入了糖分子。本研究結果顯示，GLCP 具有良好的抗氧化能力，并且為天然植物蛋白，具有安全、無刺激、無毒副作用的優(yōu)勢，本研究可為其在抗氧化研究方面提供參考。