益生菌發酵南瓜籽工藝優化及產氨基酸和揮發性香氣成分分析

劉戰霞，李文琦，楊慧，吳宏*，賈文婷*

（1.新疆農墾科學院 農產品加工研究所，新疆 石河子 832000；2.石河子質量與計量檢測所，新疆 石河子 832000）

籽用南瓜是葫蘆科植物的重要組成部分，是遺傳和形態上最為多樣的南瓜品種，可分為無殼南瓜（又稱“裸瓜”）和帶殼南瓜[1]，其籽仁富含蛋白質、脂肪、多種不飽和脂肪酸等營養活性成分[2-3]。近年來，南瓜籽因其具有抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂等營養保健作用而受到人們的廣泛關注[4]。除了煮熟、炒制和作為蔬菜食用，南瓜籽還可以發酵，用作各種食品的調味劑、蛋白質補充物和功能保健品等[5]。

菌種對香氣、品質發揮重要作用，是影響發酵過程及發酵結果的重要因素[6-8]。龐惟俏等[9]探究了大豆醬中主要菌種與香氣成分的關系，對人工接種優勢菌發酵的大豆醬進行揮發性成分的測定，結果表明優勢菌M2 和M3 對寶泉醬香氣成分酯和醇的產生貢獻較大，是大豆醬發酵的有益菌株，有利于大豆醬風味的形成；Giami[10]研究了傳統自然發酵對南瓜籽蛋白質、氨基酸、抗營養物質及營養品質的影響，研究發現發酵顯著提高了種子粗蛋白質和體外蛋白質消化率；Adeyemo 等[11]在研究發酵豆類和谷物用作嬰兒斷奶食品時，發現植物乳桿菌能夠為人體提供營養；周嬋等[12]將南瓜籽打漿后與牛奶復配進行混合發酵，利用模糊數學綜合評價法和響應面法優化發酵工藝，用南瓜籽和牛奶復合發酵的酸奶產品增加了南瓜籽的抗氧化、提高免疫力等優良特性，豐富了酸奶的營養。

目前，南瓜籽的發酵研究大多采用單菌株發酵[13-14]，利用益生菌株發酵南瓜籽的研究相對較少。本研究將具有益生特性的菌種混合發酵，通過單因素和正交試驗對發酵南瓜籽工藝進行優化，并利用氨基酸自動分析儀、氣相色譜-質譜聯用對自然發酵和益生菌發酵南瓜籽的品質、風味特性進行對比分析，以期為開發新型南瓜籽產品提供基礎，為制備具有獨特風味的益生菌發酵南瓜籽產品及其風味評價提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘塞外明珠’品種籽用南瓜：第十師北屯市新疆海川三新食品有限公司有機南瓜基地，挑選成熟度良好、個體大小均勻的南瓜籽作為試驗材料。

益生菌（植物乳桿菌CICC 20265、釀酒酵母菌CICC 1015、紫色紅曲菌CICC 40806）：新疆農墾科學院微生物試驗室。MRS 肉湯培養基、麥芽汁培養基、馬鈴薯葡萄糖水培養基：北京路橋技術有限責任公司；三氯乙酸（99%）、茚三酮（≥98%）、氨基酸混合標準品：美國sigma 試劑公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-SOKBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2D 超凈工作臺：北京九潤天成儀器公司；SPx-150B 生化培養箱、SPX-250C 恒溫恒濕箱：濟南卓隆生物科技有限公司；K9840 自動凱氏定氮儀：海能未來技術集團股份有限公司；S433D 全自動氨基酸分析儀：大昌洋行（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

對益生菌種（植物乳桿菌CICC 20265、釀酒酵母菌CICC 1015、紫色紅曲菌CICC 40806）進行活化，種子液按3%比例接種于相應培養基中。30 ℃蒸餾水浸泡5～8 h，軟化南瓜籽，分別取100 g 浸泡好的南瓜籽和5 mL蒸餾水于250 mL 錐形瓶中，121 ℃滅菌15 min。以5%接種量將培養至二代的菌分別接種于已高溫滅菌并已冷卻好的南瓜籽中，做好標記，37 ℃下每12 h 扣瓶1次，固態發酵5 d。以自然發酵的南瓜籽作為空白試驗，自然發酵南瓜籽不接種益生菌，其他條件方法同上。

1.3.2 指標測定

參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》和GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》測定南瓜籽中脂肪和蛋白質含量；pH 值測定：稱取10.0 g 發酵完成的南瓜籽溶于90.0 mL 去離子水中，均質10 s 后，于4 ℃條件下浸提24 h，用pH 計測定其pH 值。

1.3.3 感官評價

感官評價組由10 名具有較強專業背景的人員組成，分別對發酵南瓜籽進行感官評價。詳細評分規則見表1。

表1 益生菌發酵南瓜籽感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of pumpkin seeds fermented with probiotics

1.3.4 最適發酵南瓜籽單菌種的篩選及菌種復配篩選

分別進行單菌、雙菌和三菌混菌復配篩選，進行南瓜籽模擬發酵試驗，每組均設3 個重復，以蛋白質含量、脂肪含量和感官評分為指標，篩選出發酵南瓜籽的菌株組合。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 菌種接種量

南瓜籽在121 ℃滅菌15 min，然后按1%、3%、5%、7%、9%，植物乳桿菌∶紫色紅曲菌∶釀酒酵母菌1∶1∶1（質量比）接種。接種于南瓜籽后，36 ℃發酵5 d 后，對發酵南瓜籽進行感官評價。

1.3.5.2 菌種比例

南瓜籽在121 ℃滅菌15 min，然后按5%，植物乳桿菌∶紫色紅曲菌∶釀酒酵母菌1∶1∶1、1∶2∶2、1∶2∶1、1∶1∶2、2∶1∶1（質量比）接種。接種于南瓜籽后，36 ℃發酵5 d 后，對發酵南瓜籽進行感官評價。

1.3.5.3 發酵溫度

南瓜籽在121 ℃滅菌15 min，然后按5%，植物乳桿菌∶紫色紅曲菌∶釀酒酵母菌1∶1∶1（質量比）接種。接種于南瓜籽后，32、34、36、38、40 ℃發酵5 d 后，對發酵南瓜籽進行感官評價。

1.3.5.4 發酵時間

南瓜籽在121 ℃滅菌15 min，然后按5%，植物乳桿菌∶紫色紅曲菌∶釀酒酵母菌1∶1∶1（質量比）接種。接種于南瓜籽后，36 ℃發酵3、4、5、6、7 d 后，對發酵南瓜籽進行感官評價。

每種條件下進行3 組平行試驗。

1.3.6 正交試驗優發混菌發酵條件

采用L9（34）正交試驗，以pH 值和感官評分為評價指標，正交試驗因素及水平如表2 所示。

表2 發酵工藝正交試驗因素及水平Table 2 Factors and levels of orthogonal design

1.3.7 益生菌發酵南瓜籽樣品中氨基酸成分分析

參考武俊瑞等[15]對樣品中游離氨基酸的分析方法，取干燥樣品0.1 g 于研缽中，加入體積分數為5%的磺基水楊酸溶液3 mL，充分研磨后靜置1 h，于12 000 r/min 離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，濾液采用全自動氨基酸分析儀進行測定。

1.3.8 香氣成分富集及測定

“蔡先生大鑒，適才與我們民族博物館館長提倫紐斯教授商量過您的事情。他認為，您夫人在漢堡大學注冊一事，當不成問題。我草擬了一份入學申請，隨信寄上。務請您夫人盡快向大學提出申請。您若需要其他幫助，不妨去找漢堡大學漢學研究所的助教，他有意結識您及您夫人……希望不久能在此見到您和您夫人，并致以衷心問候。”[14]207

頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）條件[16]：取5.0 g 發酵南瓜籽樣品置于20 mL 頂空瓶中，將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB 萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于60 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數據。

色譜條件：設定初始溫度為40 ℃，保持溫度恒定3 min，隨后按以下方式升溫：以3.5℃/min 的速度升溫至142 ℃，以2 ℃/min 的速度升溫至150 ℃，以3.5 ℃/min的速度升溫至177 ℃，以6 ℃/min 的速度升溫至200 ℃，以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保持溫度恒定3 min。使用高純度氦氣（99.999 0%）為載氣，以1.2 mL/min 的速度作為載氣的恒定流速，進樣口溫度250 ℃，設置為不分流狀態。

質譜條件[17]：電子轟擊（electron impact，EI）離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度28 ℃，質量掃描范圍m/z 40～250。

1.4 數據分析

采用Origin 8.5 建立數據系統、統計分析和作圖，利用SPSS 18.0 軟件對主要的風味物質進行因子分析。

2 結果與分析

2.1 最適單菌種的篩選及菌種復配篩選

乳酸菌、酵母菌和紅曲菌等益生特性的菌株經常被添加到食品中，產生各種有機酸和香味物質，對人體健康具有很大作用。因此，分別進行了單菌、雙菌和三菌混菌復配篩選，進行南瓜籽模擬發酵試驗，每組均設3 個重復，以蛋白質含量、脂肪含量、氨基酸含量和感官評分為指標，篩選出發酵南瓜籽的菌株組合。單株發酵接種率5%，雙菌和三菌混合發酵時菌種配比為1∶1 和1∶1∶1（5%），于37 ℃發酵5 d，得發酵南瓜籽。表3 列出了3 種不同類型菌種混合發酵南瓜籽的蛋白質、脂肪、氨基酸和感官評分。

表3 發酵南瓜籽感官數據及理化數據Table 3 Sensory score and nutrient content of pumpkin seeds fermented with probiotics

由表3 可知，與空白相比，大部分發酵樣品組的蛋白質含量、脂肪含量、氨基酸含量有明顯增加，其中三菌種（植物乳桿菌∶紫色紅曲霉∶釀酒酵母）混菌發酵南瓜籽的蛋白質含量、脂肪含量最高，分別為（37.47±0.03）、（51.00±0.01）g/100 g；三菌種發酵南瓜籽的氨基酸含量為（27.20±0.02）g/100 g，較空白組南瓜籽（25.80±0.02）g/100 g 有明顯增加。因此，選擇三菌復配進行后續研究。

2.2 單因素試驗結果

三菌復配發酵南瓜籽的pH 值和感官評分單因素試驗試驗結果分別如圖1 所示。

圖1 單因素試驗結果Fig.1 Results of single factor tests

從圖1a 可以看出，隨著接種量的增加，pH 值先升高后降低。如果益生菌的接種量太少，會延長南瓜籽的發酵時間，造成混合菌的污染，不僅影響產品風味，而且會抑制益生菌的生長，導致微生物細胞容易衰老，出現自溶，影響發酵南瓜籽的風味。pH 值反映發酵過程產酸量，當接種量為5%時，產酸量適中；當接種量為3%時，感官評分達到最大值。因此，正交優化試驗分別選擇3%、5%、7%。

由圖1c 可知，隨著植物乳桿菌比例的降低，發酵南瓜籽的pH 值和感官評分先升高后降低。三菌種（植物乳桿菌∶紫色紅曲菌∶釀酒酵母菌）比例為1∶1∶1時，感官評分最高，南瓜籽氣味溫和，質地均勻，酥軟。主要是因為多菌種混合發酵利用菌種之間協調互作關系，擴大了對南瓜籽的適應性和防雜菌能力。酵母類則可利用糖進行生長代謝，促進了酵母的生長，提高了發酵率，紅曲霉可利用、分解纖維素和淀粉，而酵母菌主要利用糖源，可以通過菌種的協同作用提高對底物的利用效率，從而提高產品的蛋白質含量和營養功能。因此，正交試驗選擇1∶2∶1、1∶1∶1 和1∶1∶2的比例。

從圖1d 可以看出，隨著發酵時間的延長，pH 值和感官評分呈現先上升后下降的趨勢。發酵時間少于5 h 時，發酵時間過短，發酵力不足，口感較硬；發酵時間超過5 h 時，發酵時間過長，會產生更多的乳酸，酸味明顯，影響產品風味。在發酵時間為5 d 時，pH 值和感官評分均達到最大值，此時發酵南瓜籽香氣更加明顯，因此，選擇發酵時間為4、5、6 d 進行正交優化試驗。

2.3 益生菌發酵南瓜籽工藝正交優化試驗

根據單因素試驗的分析結果，選取接種量（A）、發酵溫度（B）、菌種比例（C）和發酵時間（D）4 個因素，以pH 值和感官評分為指標，設計正交分析試驗，結果見表4，方差分析結果見表5。

表4 益生菌發酵南瓜籽的正交試驗設計與結果Table 4 Orthogonal design and test results

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表4 可知，影響益生菌發酵南瓜籽pH 值和感官評分的影響因素排序均為菌種比例（C）＞接種量（A）＞發酵時間（D）＞發酵溫度（B）。菌種比例是影響益生菌發酵南瓜籽pH 值和感官評分的重要因素。由表5 方差分析可知，菌種比例對發酵南瓜籽pH 值和感官評分的影響顯著（P<0.05），接種量對發酵南瓜籽感官評分的影響極顯著（P<0.05），發酵溫度和發酵時間的影響結果不顯著（P>0.05），但4 個因素影響程度的大小排序與表4 中極差分析結果一致，均為C＞A＞D＞B。因此，經綜合分析最佳益生菌發酵南瓜籽工藝為發酵溫度36 ℃、發酵時間5 d、接種量5%、菌種比例1∶1∶1，益生菌發酵南瓜籽pH 值為7.1，感官評分達到最高，為20。

2.4 驗證試驗

根據正交試驗結果，對組合A2B2C2D1進行驗證試驗，發酵結束后進行指標測定，發酵南瓜籽的pH 值和感官評分分別為7.0、20。pH 值水平略低于正交試驗組中數據，總體優于正交試驗結果。因而，以發酵溫度36 ℃、發酵時間5 d、接種量5%、菌種比例1∶1∶1，作為南瓜籽發酵的最優條件。

2.5 益生菌發酵南瓜籽氨基酸組成和含量分析

益生菌發酵南瓜籽中不同種類氨基酸含量變化率見圖2。

圖2 益生菌發酵南瓜籽中不同種類氨基酸含量變化率Fig.2 Changes in content of amino acids in pumpkin seeds fermented with probiotics

如圖2 所示，通過檢測益生菌發酵南瓜籽中氨基酸的含量發現，相比于自然發酵，益生菌發酵南瓜籽中的天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、組氨酸和蛋氨酸含量顯著升高（P<0.05），亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和異亮氨酸含量顯著降低（P<0.05），酪氨酸和賴氨酸含量降低不顯著（P>0.05）。其中苦味氨基酸（亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、纈氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸）含量均呈現降低趨勢，而甜味氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、酪氨酸、蛋氨酸）含量均升高，這與益生菌發酵過程中發酵劑植物乳桿菌和釀酒酵母增多，產生較多甜味氨基酸的有很大關系[18]。

2.6 益生菌發酵南瓜籽風味物質及相對含量分析

本試驗通過頂空氣相色譜-質譜對發酵南瓜籽揮發性物質進行測定，結果見表6。圖3 為自然發酵與益生菌發酵風味物質含量分布。

圖3 自然發酵與益生菌發酵風味物質含量分布Fig.3 Relative content of flavor compounds

表6 發酵南瓜籽中風味物質及相對含量Table 6 Relative content of volatile flavor components identified in fermented pumpkin seeds

從表6、圖3 可以看出，在自然發酵的南瓜籽中檢測到24 種風味物質，包括4 種酯類、1 種醇類、3 種酸類、6 種醛類和7 種酮類。南瓜籽自然發酵過程中產生了大量的酸性物質，占69.404%，包括乙酸（39.273%）、正戊酸（30.131%），說明自然發酵過程主要以產酸性物質為主。

從表6、圖3 可以看出，采用復合益生菌發酵南瓜籽共檢測到27 種風味物質，其中酯類化合物6 種，醇類化合物5 種，酸類化合物4 種，醛類化合物3 種。其中乙酸丁酯（8.360%）、乙酸己酯（9.521%）、丁酸丁酯（5.262%）、2-甲基丙酸丙酯（7.201%）、乙醇（5.701%）、2，3-丁二醇（16.421%）、2-甲基吡嗪（15.341%）、2，5-二甲基吡嗪（6.742%）和正丁醚（4.131%）。微生物通過氨基酸代謝產生了一定量的醇類物質，酯類具有水果味的香氣成分。由于它們比其他風味物質具有更低的風味閾值和更高的氣味活性，因此，酯類對南瓜籽發酵風味的貢獻更大。

2.7 益生菌發酵南瓜籽風味物質的因子分析

為確定益生菌中不同優勢菌對發酵南瓜籽風味物質的影響，利用因子分析將主要風味物質歸為少量的因子變量，以便確定益生菌中不同優勢菌發酵的南瓜籽風味的差異[19]，采用統計量檢驗（Kaiser-meyerolkin，KMO）和巴特利特球度檢驗（Bartlett's 檢驗）進行分析，分析結果見表7。各主成分因子的特征值及其方差貢獻率計算結果見表8，旋轉后主成分因子的成份矩陣見表9。

表7 KMO 和Bartlett's 檢驗Table 7 KMO and Bartlett's test

表8 益生菌發酵南瓜籽香氣成分的特征值和方差貢獻率Table 8 Eigenvalues and variance contributions of aroma components of infermented pumpkin seeds with probiotics

表9 旋轉后的載荷矩陣和因子得分系數矩陣Table 9 The load matrix and factor score coefficient matrix after rotation

由表7 可知，KMO 值為0.745，在0.5～1 之間且接近于1，相關性較大，表明可進行因子分析。Bartlett 球形檢驗，P=0.000＜0.005，說明數據滿足正態總體分布。用SPSS 軟件對數據進行因子分析，根據表8 可知，前2 個主成分的累計貢獻率分別為69.387%、30.453%，達到99.840%，其涵蓋了5 種香氣成分的所有信息。前2 個因子不旋轉時因子貢獻率分別為69.387%和84.365%，累計貢獻率＞80%，特征值分別為3.245 和2.440 均大于1，說明這2 個因子包含5 類香氣成分信息，因此，提取2 個公因子較為合適。

單獨使用因子F1或因子F2并不能對益生菌中不同優勢菌對發酵南瓜籽香氣成分作出綜合評價[20]，因此，按各公因子對應的方差貢獻率為權數計算綜合統計量為F=0.431 36F1＋0.238 97F2。最后根據所求F 值對益生菌中不同優勢菌對發酵南瓜籽進行排序，見表10。

表10 因子綜合得分Table 10 Composite scores of factors

由表10 可知，益生菌中不同優勢菌對發酵南瓜籽所產香氣因子分析排序為植物乳桿菌＞釀酒酵母＞紫色紅曲菌。

3 結論

通過單因素和正交試驗對益生菌發酵南瓜籽進行優化，并利用頂空固相微萃取、氣相色譜-質譜聯用對自然發酵和益生菌發酵南瓜籽的產氨基酸、風味特性進行對比分析。結果表明，益生菌發酵制備南瓜籽最優工藝條件為發酵時間5 d、接種量5%、菌種比例1∶1∶1，發酵溫度為36 ℃，在此條件下發酵得到的益生菌發酵南瓜籽南瓜籽pH 值為7.1，感官評分為20；益生菌發酵南瓜籽苦味氨基酸含量均降低，而甜味氨基酸含量均升高；南瓜籽中共檢測出27 種風味物質，與自然發酵相比益生菌發酵風味物質相對含量明顯增加，經因子分析，植物乳桿菌和釀酒酵母對益生菌發酵南瓜籽酯的產生貢獻較大。