基于高效液相色譜法分析梨酒發(fā)酵前后有機酸變化

滕達，司靜濤，趙進，秦玲，康文懷*

（1.河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.新疆羅菲特果業(yè)科技有限公司，新疆 庫爾勒 841000）

果酒是指以新鮮水果為原料，經(jīng)破碎或壓榨取汁，通過全部或部分發(fā)酵釀制而成的低度發(fā)酵酒，酒精含量一般在7% vol～18% vol[1-2]。梨樹是我國栽培面積最廣的果樹之一[3]，梨果肉質脆嫩，酸甜爽口，有清熱消火、潤肺止咳的功效，是釀造果酒的良好原料[4]。

由于品種、發(fā)酵條件、釀造酵母等方面的影響，水果發(fā)酵前后有機酸、氨基酸、風味等均會發(fā)生較大的變化[5]。有機酸組分與含量是果實品質風味的重要影響因素，果酒中有機酸含量不僅對果酒風味、口感和色澤的平衡有重要作用，更對果酒中各類化學物質及pH 值有重要影響[6]。研究表明，發(fā)酵前蘋果、梨、李子主要有機酸為蘋果酸和檸檬酸，葡萄為酒石酸及其鹽類，獼猴桃和藍莓為奎寧酸和檸檬酸，柑橘和菠蘿為檸檬酸[7-11]。發(fā)酵后的蘋果酒中有機酸主要是蘋果酸、乳酸、奎寧酸、檸檬酸和琥珀酸[12]；葡萄酒主要有酒石酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸[10]；獼猴桃酒主要為檸檬酸、乳酸和奎寧酸[13]。可見，不同果實發(fā)酵前后有機酸組成差異明顯。

李彩林等[14]對紅香酥梨有機酸含量的研究顯示，紅香酥梨主要有機酸為蘋果酸和檸檬酸，次要有機酸為琥珀酸和酒石酸。岳英等[15]采用高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）測定了11 種不同梨汁的有機酸，證實梨果主要有機酸為蘋果酸和檸檬酸。Wu 等[16]使用超高效液相色譜（ultra perfor mance liquid chromatography，UPLC）法對193 種梨果實中的有機酸進行研究，認為梨果主要有機酸為蘋果酸、檸檬酸、奎尼酸、草酸和莽草酸，并根據(jù)有機酸含量的高低，將梨分為蘋果酸優(yōu)勢型和檸檬酸優(yōu)勢型。目前，對梨果實中的有機酸研究較多，但是關于不同品種梨酒中有機酸的組分與含量研究較少，不同溫度對發(fā)酵后梨酒有機酸變化的研究也較少。目前關于有機酸檢測方法有酶法[17]、離子色譜法[18-19]、毛細管電泳法[17]、高效液相色譜法[20-21]。與其他方法相比，使用HPLC 法測定有機酸的方法簡便、快捷、高效，已被廣泛應用于水果及其深加工產品的有機酸測定。

因此，本試驗采用HPLC 法，對碭山梨、庫爾勒香梨和庫爾勒香梨芽變梨3 種梨發(fā)酵前后有機酸的變化進行詳細研究，并對不同發(fā)酵溫度梨酒中有機酸組分和含量進行比較，以期為梨酒的發(fā)酵工藝改良提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

碭山梨、庫爾勒香梨、庫爾勒香梨芽變梨：采自新疆庫爾勒地區(qū)，其含糖量為90～97 g/L。

釀酒酵母（QA23）、果膠酶（60 000 U/mL）：法國Lallemand 公司；淀粉酶（1 000 U/g）：邢臺萬達生物工程有限公司；白砂糖：市售；偏重亞硫酸鉀（食用級）、草酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、丙二酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、馬來酸、富馬酸、琥珀酸、丙酸（純度≥98%）、磷酸氫二銨（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

Agilent1260 高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司；AL204-IC 分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CNW-C18 色譜柱：上海安譜實驗科技股份有限公司；WBL2531H 打漿機：美的集團。

1.2 方法

1.2.1 梨酒釀造工藝流程

工藝流程：梨→去皮去核→破碎打漿→酶解→加SO2→過濾取汁→調節(jié)糖度→接種酵母→發(fā)酵→倒罐→灌裝。

操作要點：選取無病害且完熟的梨果削皮去核，用打漿機打漿，在梨漿中加入0.5 g/L 果膠酶、1 g/L 淀粉酶，4 ℃低溫靜置24 h 后，添加60 mg/L SO2；使用濾布取得果汁，并添加白砂糖使糖度達到220 g/L；將QA23 酵母在37 ℃水中活化30 min，將梨果汁平均分裝在2 個發(fā)酵罐中，接種200 mg/L 活化后的酵母后進行發(fā)酵；總糖達到4 g/L 以下時停止發(fā)酵。發(fā)酵溫度設置為15 ℃和25 ℃。

1.2.2 色譜條件建立及優(yōu)化

色譜條件：色譜柱CNW-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為磷酸氫二銨（0.01 mol/L，pH2.45）；流速為1.0 mL/min；紫外檢測波長為210 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL；洗脫條件為等度洗脫。

色譜條件的優(yōu)化：1）流動相的比較：流動相分別選擇磷酸氫二銨（0.01 mol/L）和磷酸二氫鉀（0.02 mol/L），其他色譜條件同上。2）pH 值的選擇：以磷酸氫二銨溶液為流動相，pH 值分別為2.45、2.50、2.60 和2.70，其它色譜條件同上。3）流速的選擇：流速分別為0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min，其他色譜條件同上，考察各有機酸的分離情況。

1.2.3 標準曲線繪制

標準曲線繪制：分別配制5 mg/mL 草酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、丙二酸、乙酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸溶液。用流動相將上述有機酸標準液稀釋為不同濃度（2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL）的標準混合液，并在最優(yōu)色譜條件下進行檢測，繪制各有機酸標準曲線。以信噪比（S/N=3、S/N=10）確定檢出限和定量限。

1.2.4 樣品檢測

取梨果汁、梨酒于離心機上以8 000 r/min 離心10 min，取上清液用0.45 μm 針孔濾膜過濾，進行HPLC檢測。具體色譜條件參考1.2.2 的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019 進行統(tǒng)計，主成分分析采用SPSS 22.0 專業(yè)統(tǒng)計軟件。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

在檢測波長為210 nm、柱溫為30 ℃、進樣量為20 μL 的條件下，比較流動相磷酸氫二鉀和磷酸氫二銨對有機酸分離的影響，發(fā)現(xiàn)流動相為磷酸氫二銨時，各有機酸都能完整分離，其保留時間短、檢測時間短且無明顯拖尾現(xiàn)象；不同流速（0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min）下各有機酸分離度不同，研究發(fā)現(xiàn)流速為1.0 mL/min時分離較好；不同pH 值（2.45、2.50、2.60 和2.70）對有機酸的分離效果結果表明，pH 值為2.45 時有機酸分離較好，保留時間穩(wěn)定、基線平穩(wěn)且無拖尾現(xiàn)象。因此，最優(yōu)的色譜條件：流動相為磷酸氫二銨，其濃度和pH 值分別為0.01 mol/L 和2.45，流速為1.0 mL/min。

本試驗對10 種有機酸標樣進行檢測，但梨汁與梨酒中檢測到7 種有機酸，因此僅對梨果汁、梨酒中7 種有機酸進行檢測分析。采用優(yōu)化后的色譜條件，測得的有機酸標準樣、梨果汁、梨酒的色譜圖見圖1。

圖1 7 種有機酸標準樣、梨果汁和梨酒色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 7 organic acids in pear juice and pear wine

由圖1 可知，其有機酸分離度較好，色譜峰型好，無拖尾現(xiàn)象。

2.2 標準曲線的繪制及加標回收率

2.2.1 標準曲線的繪制

如圖1 所示，梨果汁和梨酒中常見的有機酸為草酸、酒石酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸，因此，以上述7 種有機酸繪制標準曲線，結果見表1。

表1 有機酸組分回歸方程Table 1 Regression equation of organic acid composition

由表1 可知，7 種有機酸的線性回歸方程的相關系數(shù)均在0.999 以上，方法的檢出限為0.01～0.05 mg/mL，定量限為0.05～0.17 mg/mL，7 種有機酸的峰面積均在一定濃度范圍內與濃度存在良好的線性關系。

2.2.2 加標回收率

對草酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸5 種有機酸進行加標回收率試驗，結果見表2。

表2 樣品加標回收率（n=3）Table 2 Standard recovery rate of samples（n=3）

由表2 可知，各有機酸的平均加標回收率為75.33%～102.01%，相對標準偏差均小于5%。

2.3 不同品種梨發(fā)酵前后有機酸含量的變化

2.3.1 有機酸總含量

梨酒發(fā)酵前后有機酸含量見表3。由表3 可知，3 種梨果汁中，有機酸總量為3.3～5.0 mg/mL，其中，庫爾勒香梨果汁的有機酸總量最高（4.951 mg/mL），庫爾勒香梨芽變梨果汁最低（3.390 mg/mL）。發(fā)酵后梨酒中有機酸含量大幅增加，庫爾勒香梨芽變梨酒中的有機酸總含量為10.543 mg/mL，在3 種梨酒中含量最高。經(jīng)過發(fā)酵后，3 種梨酒中酒石酸、檸檬酸、乳酸、莽草酸和琥珀酸含量均提高，而草酸含量降低，蘋果酸在碭山梨酒中含量下降，在其他2 種梨酒中含量升高。

表3 梨酒發(fā)酵前后有機酸含量Table 3 Organic acid content of pear wine before and after fermentation mg/mL

酒石酸的酸味強烈，對酒體穩(wěn)定性、pH 值和口感有顯著影響[22]。3 種梨果汁中酒石酸含量有較大差異，庫爾勒香梨芽變梨汁中含量最低（0.410 mg/mL），庫爾勒香梨汁酒石酸含量約為其2.1 倍，碭山梨果汁中含量最高（1.123 mg/mL）。發(fā)酵后梨酒酒石酸含量明顯升高，約占總有機酸的40%。不同品種梨酒酒石酸含量差異顯著，庫爾勒香梨芽變梨酒含量最高，顯著高于碭山梨酒和庫爾勒香梨酒，碭山梨酒酒石酸含量最低，約為庫爾勒香梨芽變梨酒的67%。

蘋果酸是梨果汁中含量較高的一種有機酸，其酸味爽口，略帶刺激性，有略微的苦澀感，呈味時間較長。3 種梨果汁中，碭山梨果汁中蘋果酸含量最低（1.304 mg/mL），庫爾勒香梨中含量最高（2.061 mg/mL）。在發(fā)酵后，不同品種梨酒蘋果酸含量變化不一，碭山梨酒中含量降低，而庫爾勒香梨和庫爾勒香梨芽變梨酒中含量升高。

乳酸是梨果汁和梨酒中重要的有機酸，與蘋果酸相比，口感溫和，略有生澀感。乳酸提高了發(fā)酵果酒的穩(wěn)定性和營養(yǎng)價值，同時也為果酒增加了復雜性和水果香氣[23]。因此經(jīng)過蘋果酸-乳酸發(fā)酵，使酒體更加穩(wěn)定、溫和[24]。碭山梨汁中乳酸含量最低（0.374 mg/mL），顯著低于庫爾勒香梨汁與庫爾勒香梨芽變梨果汁。發(fā)酵后的梨酒中乳酸含量顯著增加，其中庫爾勒香梨芽變梨酒中含量最高，為1.568 mg/mL；碭山梨酒次之；庫爾勒香梨酒的含量最低，僅為0.861 mg/mL。

檸檬酸在果酒中呈現(xiàn)出一種清新的酸味。庫爾勒香梨芽變梨果汁的檸檬酸含量為0.075 mg/mL，在3 種梨汁里含量最低。庫爾勒香梨果汁中檸檬酸含量為0.119 mg/mL，碭山梨果汁含量最高，為0.141 mg/mL。發(fā)酵后檸檬酸含量顯著增加，庫爾勒香梨酒中含量增加到0.544 mg/mL，且顯著高于其他2 種梨酒。

琥珀酸除酸味外還有類似于咸苦味的特殊味道，其參與果酒中酯類物質的代謝及酒味的合成[25]。琥珀酸在梨果汁中占比較高，占總有機酸含量的16.8%～17.6%。庫爾勒香梨果汁中琥珀酸含量最高（0.856 mg/mL），碭山梨果汁中含量次之，庫爾勒香梨芽變梨果汁最低。發(fā)酵過程中，琥珀酸作為三羧酸循環(huán)的中間產物，可由檸檬酸生成α-酮戊二酸，進而合成琥珀酸。因此，發(fā)酵后的梨酒中琥珀酸含量顯著增加，其含量由高到低依次為碭山梨酒＞庫爾勒香梨酒＞庫爾勒香梨芽變梨酒。

莽草酸作為生物合成代謝的中間產物，存在于大量植物和微生物中，以莽草酸為中間產物可合成分解為其他物質[26]。在梨果汁中莽草酸含量較低，其中碭山梨果汁的含量最高（0.138 mg/mL），顯著高于庫爾勒香梨芽變梨果汁和庫爾勒香梨果汁。發(fā)酵后梨酒莽草酸含量也顯著增加。

3 種梨果汁中，草酸含量在庫爾勒香梨果汁中最高（0.521 mg/mL），庫爾勒香梨芽變梨果汁最低（0.209 mg/mL）。在酒精發(fā)酵過程中，草酸形成了草酸鹽沉淀，因此梨酒中草酸的含量明顯下降[27]。發(fā)酵后梨酒中草酸含量顯著降低，庫爾勒香梨酒降至0.100 mg/mL，庫爾勒香梨芽變梨酒和碭山梨酒分別降至0.086、0.082 mg/mL。

2.3.2 發(fā)酵溫度對梨酒有機酸含量的影響

在15 ℃和25 ℃下發(fā)酵后梨酒有機酸含量見圖2。

圖2 不同溫度發(fā)酵下有機酸的差異Fig.2 Differences in organic acids after fermentation at different temperatures

有機酸含量對果酒的pH 值、風味和化學穩(wěn)定性都有著重要的影響。發(fā)酵溫度的高低影響釀酒酵母生長速度進而影響果酒中的有機酸含量。由圖2 可以看出，發(fā)酵溫度為25 ℃的碭山梨酒和庫爾勒香梨酒中有機酸總量略高于15 ℃。15 ℃的發(fā)酵條件下碭山梨酒中酒石酸含量為3.23 mg/mL，庫爾勒香梨酒中為4.123 mg/mL，均高于發(fā)酵溫度為25 ℃的梨酒，庫爾勒香梨芽變梨酒中則相反。釀造溫度15 ℃的碭山梨酒中檸檬酸含量（0.566 mg/mL）高于25 ℃，而庫爾勒香梨酒和庫爾勒香梨芽變梨酒在25 ℃下較高。15 ℃的庫爾勒香梨酒的蘋果酸（2.468 mg/mL）與庫爾勒香梨芽變梨酒中琥珀酸（2.325 mg/mL）含量高于25 ℃的梨酒。

2.4 主成分分析

對3 種梨酒中有機酸含量進行主成分分析，結果見圖3。

圖3 主成分分析Fig.3 Principal component analysis

由圖3 可知，根據(jù)特征值大于1 提取主成分，可提取到2 個主成分，其方差貢獻率分別為62.3%和19.9%，其累計方差貢獻率為82.2%，表明主成分分析結果可靠，基本可以反映7 種有機酸指標的信息。

第一主成分（PC1）與酒石酸（0.941）、琥珀酸（0.902）、乳酸（0.891）和檸檬酸（0.890）呈正相關，而草酸（-0.842）與該主成分呈負相關。另一方面，在第二主成分顯示出與蘋果酸（0.936）呈正相關，與莽草酸呈負相關（-0.626）。考慮到梨汁和梨酒在二維象限中的分布，可以清晰地觀察到不同樣品分離情況。在此以用于發(fā)酵的不同品種和不同發(fā)酵溫度進行分離。從圖3中可以看出，庫爾勒香梨芽變梨果汁和庫爾勒香梨果汁在PC2 的上半部分，碭山梨果汁在PC2 的下半部分，因此，碭山梨果汁中有較高的莽草酸。發(fā)酵后的3 種梨酒都在PC1 的右側，因此梨酒中的草酸含量降低，在PC2 中，碭山梨酒在下半部分，庫爾勒香梨芽變梨酒和庫爾勒香梨酒在上半部分，所以碭山梨酒擁有較少的蘋果酸和較高的莽草酸。此外，15 ℃下發(fā)酵的庫爾勒香梨酒與25 ℃發(fā)酵分離明顯，15 ℃發(fā)酵的酒中擁有更高的蘋果酸，25 ℃發(fā)酵的酒中擁有更高的莽草酸。

3 結論

以3 種香梨為原料釀造梨酒，利用HPLC 法測定酒精發(fā)酵階段發(fā)酵溫度對有機酸含量的影響。結果顯示，與梨果汁相比，發(fā)酵后梨酒中酒石酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸含量升高，草酸含量降低，碭山梨酒中蘋果酸含量減少，庫爾勒香梨酒和庫爾勒香梨芽變梨酒中含量增加。發(fā)酵條件為15 ℃下碭山梨酒的酒石酸和檸檬酸含量高于25 ℃，15 ℃的庫爾勒香梨酒中蘋果酸和酒石酸高于25 ℃，與釀造條件25 ℃相比，在15 ℃下庫爾勒香梨芽變梨酒中琥珀酸含量較高。