非特異性過氧合酶發(fā)酵優(yōu)化及在H2O2檢測中的應(yīng)用

郭成月，鄧雪武，趙永明，曹翠瑤*

（1.天津職業(yè)大學(xué)，天津 300400；2.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300400；3.天津益倍生物科技集團(tuán)，天津 300450）

過氧化氫（H2O2）是一種綠色且不含氯的殺菌和漂白劑。目前，H2O2已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，如奶制品、啤酒、水果蔬菜、水產(chǎn)保鮮等[1-2]。據(jù)糧農(nóng)組織/世衛(wèi)組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會報道，人體腸道細(xì)胞中的酶會快速分解少量的H2O2，而不產(chǎn)生毒理學(xué)影響。然而，攝入含有過量H2O2的食物可能會引起細(xì)胞內(nèi)H2O2代謝水平異常，甚至導(dǎo)致炎癥、心腦血管疾病和糖尿病等健康問題[3-4]。因此食品中H2O2的殘留檢測受到研究者們廣泛關(guān)注。

目前已經(jīng)開發(fā)出許多方法用于檢測H2O2，如電化學(xué)法[5-6]、熒光法[7-8]和比色法[9-10]。Song 等[11]在氧化銦錫電極上負(fù)載了納米氧化錫，并通過聚硫氨酸改性制備了一種光電化學(xué)傳感器，在0.03～8 mmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.003 mmol/L。Tang 等[12]利用苯丙噻唑與H2O2熒光發(fā)光的特性制備了一種化學(xué)傳感器用于檢測H2O2。在0～60 μmol/L（R2=0.994）表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，檢測限為1.0×10-6mol/L。這些傳統(tǒng)方法雖然可以提供高的靈敏度和廣泛的應(yīng)用范圍，但仍存在一些不足，如檢測儀器比較昂貴、需要專業(yè)的操作技能、樣品預(yù)處理復(fù)雜、材料合成工藝不成熟等。隨著生物學(xué)研究的發(fā)展，生物酶也常被用于H2O2的檢測[13]。酶法檢測H2O2具有能夠定性定量檢測、快速、操作簡單、選擇性高的特點(diǎn)。Tian 等[14]利用H2O2會抑制抗壞血酸氧化酶（ascorbic acid oxidase，AAO）氧化抗壞血酸的特點(diǎn)，開發(fā)出一種利用個人血糖儀定量分析H2O2的方法。該方法可以在2.5～5×103μmol/L 的線性范圍內(nèi)實現(xiàn)對H2O2的檢測，檢測限為2.5 μmol/L。

非特異性過氧合酶（unspecific peroxygenase，UPO）是一種來自于真菌的血紅素氧化酶[15]，其能夠利用H2O2將2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]快速氧化為ABTS+。而ABTS+具有可定量、易于檢測的特點(diǎn)。2004 年來源于茶樹菇（Agrocybe aegerita）的AaeUPO 首次被Ullrich 等[16]發(fā)現(xiàn)并報道。目前，在基因組測序的真菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)千個UPO 序列，但只有少數(shù)野生型酶和少數(shù)重組表達(dá)的UPO 已被表征并用于實驗室規(guī)模的研究[17-18]。而重組發(fā)酵獲得的UPO 存在表達(dá)量低，無法大規(guī)模制備的困境。

針對上述問題，本文對已經(jīng)成功表達(dá)AaeUPO 的畢赤酵母GS115 進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，提高畢赤酵母中AaeUPO 的重組表達(dá)量。通過搖瓶水平單因素試驗和正交試驗確定最佳培養(yǎng)基成分，利用5 L 發(fā)酵罐發(fā)酵優(yōu)化工藝條件并實現(xiàn)初步的放大生產(chǎn)。然后將AaeUPO應(yīng)用于對H2O2的高效檢測，以期為食品中H2O2的檢測提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AaeUPO 菌株：由河北工業(yè)大學(xué)生物催化與轉(zhuǎn)化實驗室構(gòu)建的基因工程菌P.pastoris/pPIC9k/PaDa-I；甲醇、ABTS、甘油：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、生物素、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

BMGY 培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素4×10-4g/L、甘油10 g/L，使用100 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液配制。BMMY 培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素4×10-4g/L、甲醇10 g/L，使用100 mmol/L 磷酸鉀緩沖溶液配制。其中，YNB、生物素和甲醇在培養(yǎng)基滅菌（121 ℃下滅菌鍋滅菌）后使用0.22 μm 水系濾膜除菌后加入。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式高速離心機(jī)（TG18G）：鹽城市凱特實驗儀器有限公司；5 L 玻璃發(fā)酵罐（GS-F2005AG）：上海顧信生物科技有限公司；智能恒溫?fù)u床（HNY-202T）：天津歐諾儀器股份有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（GI54T）：致微（廈門）儀器有限公司；紫外-可見分光光度計（UV-1100）：上海美普達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活測定方法

將AaeUPO 粗酶液200 μL 與檸檬酸緩沖液（100 mmol/L，pH4.4）1 560 μL 混合并加入40 μL H2O2（2 mmol/L）反應(yīng)30 s，于420 nm 處測量混合液吸光度，將結(jié)果與ABTS 溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線對照。每分鐘催化形成1 μmol ABTS+的AaeUPO 的量定義為1 U。粗酶液酶活（A，U/mL）的計算公式如下。

式中：B 為絕對酶活，U；V 為粗酶液體積，mL。

1.3.2 AaeUPO 搖瓶培養(yǎng)方法

將甘油菌（1%接種量）接種至BMGY 培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中在30 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)16～18 h，當(dāng)培養(yǎng)基菌液在600 nm 處的吸光度大于2.0 后對菌液離心（25 ℃，7 000 r/min）。用BMMY 培養(yǎng)基對畢赤酵母重懸，在30 ℃、220 r/min 條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，隨后每隔24 h 添加1 次甲醇，持續(xù)5 d。誘導(dǎo)結(jié)束后離心（25 ℃，8 000 r/min）發(fā)酵液，收集上清液對AaeUPO 活性進(jìn)行檢測。

1.3.3 AaeUPO 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法

在5 L 發(fā)酵罐中配制一定體積的BMGY 培養(yǎng)基并滅菌，將搖瓶培養(yǎng)的種子液按照一定體積分?jǐn)?shù)接入到5 L 發(fā)酵罐中。固定轉(zhuǎn)速為400 r/min，通氣量為6 L/min，罐內(nèi)溫度設(shè)置為30 ℃。培養(yǎng)24 h 待甘油耗盡后饑餓處理1 h，加入甲醇繼續(xù)培養(yǎng)5 d，之后每隔12 h 檢測1 次相關(guān)指標(biāo)，每隔24 h 添加甲醇。

1.3.4 H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

將200 μL AaeUPO 粗酶液溶于1 560 μL pH4.4 的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，加入200 μL ABTS 溶液，再依次加入40 μL 一系列不同濃度的H2O2溶液，混合后反應(yīng)3 min，于420 nm 處測定吸光度。

1.3.5 搖瓶水平單因素試驗

以BMGY 培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，BMMY 培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)。對培養(yǎng)基中的主要成分進(jìn)行優(yōu)化，以AaeUPO 酶活作為評價標(biāo)準(zhǔn)。選取培養(yǎng)基初始pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、甲醇濃度（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%）、酵母粉濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）和蛋白胨濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）4 個因素，進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗。

1.3.6 搖瓶水平正交試驗

選取影響較大的因素設(shè)計四因素三水平正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.3.7 5 L 發(fā)酵罐水平試驗的優(yōu)化

利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基條件，進(jìn)行5 L 發(fā)酵罐放大試驗，依次從接種量（8%、10%、12%）、誘導(dǎo)溫度（28、30、32 ℃）、甲醇添加方式（分批加入、流加）對發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 干擾試驗及加標(biāo)回收試驗

干擾試驗方法：在0.25 mmol/L 的Fe2（SO4）3、K2SO4、（NH4）2SO4和0.5 mmol/L 的ZnSO3、Na2CO3溶液中分別加入H2O2使其終濃度為50 μmol/L，檢測混合后溶液中的H2O2濃度。

加標(biāo)回收試驗方法：在蒸餾水、礦泉水、啤酒中分別加入終濃度0、10、20、30 μmol/L 的H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后對樣品進(jìn)行測定。回收率（P，%）計算公式如下。

式中：M 為加標(biāo)試樣測定值，μmol/L；M0為試樣測定值，μmol/L；Q 為加標(biāo)量，μmol/L。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AaeUPO 的蛋白電泳結(jié)果

聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）結(jié)果如圖1所示。

圖1 AaeUPO 的蛋白電泳圖Fig.1 Electrophoretic diagram of AaeUPO protein

由圖1 可知，在大約46 kDa 處有明顯的目的條帶，這與AaeUPO 的理論大小相符。表明AaeUPO 在畢赤酵母中成功重組表達(dá)，接下來對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 甲醇濃度對AaeUPO 表達(dá)的影響

甲醇濃度對AaeUPO 表達(dá)的影響見圖2。

圖2 甲醇濃度對AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on expression of AaeUPO

由圖2 可知，當(dāng)甲醇濃度為1.00%時，畢赤酵母對AaeUPO 表達(dá)情況最好，粗酶液酶活達(dá)到了13.1 U/mL。誘導(dǎo)表達(dá)階段，畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源。甲醇濃度低，誘導(dǎo)效果差，得不到足夠的碳源，菌株生長緩慢。當(dāng)甲醇濃度過高時，甲醇作為一種有機(jī)小分子又會對畢赤酵母產(chǎn)生毒害作用[19]。此外，甲醇代謝產(chǎn)生的甲醛、甲酸等小分子也會對生物體的正常代謝產(chǎn)生影響。因此，后續(xù)選用1.00%甲醇濃度作為最佳培養(yǎng)條件。

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH 值對AaeUPO 表達(dá)的影響

培養(yǎng)基初始pH 值對AaeUPO 表達(dá)的影響見圖3。

圖3 培養(yǎng)基初始pH 值對AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.3 Effect of pH of medium on AaeUPO expression

由圖3 可知，隨著培養(yǎng)基初始pH 值的增加，粗酶液酶活呈先升高后降低的趨勢。pH5.5 時粗酶液酶活最高，達(dá)到14.3 U/mL。畢赤酵母的生長pH 值范圍為2.0～7.5，最適生長pH 值為4.8～5.2。pH 值過高不利于畢赤酵母的生長。此外，當(dāng)pH 值較高時培養(yǎng)基中蛋白水解酶的活性較高，會導(dǎo)致AaeUPO 的分解[20]。而過低的pH 值對目標(biāo)基因的表達(dá)不利，影響培養(yǎng)基中粗酶液的活性。因此，選取pH5.5 作為最佳培養(yǎng)基初始pH值。

2.2.3 營養(yǎng)物質(zhì)對AaeUPO 表達(dá)的影響

營養(yǎng)物質(zhì)對AaeUPO 表達(dá)的影響見圖4。

圖4 營養(yǎng)物質(zhì)對AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.4 Effect of nutrients on AaeUPO expression

由圖4 可知，隨著酵母粉濃度和蛋白胨濃度的增加，粗酶液中AaeUPO 的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但酵母粉濃度的影響不明顯。當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?.0%時，粗酶液酶活最高。隨后對酵母粉濃度進(jìn)行優(yōu)化，酵母粉濃度為1.5%時，粗酶液酶活達(dá)到最高值，為15.6 U/mL。當(dāng)酵母粉和蛋白胨濃度較低時，畢赤酵母生長緩慢，酶活性較低；濃度較高時，培養(yǎng)基中會存在大量的氨基酸，對目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)生不利的影響。綜上，最佳的蛋白胨濃度為2.0%、最佳的酵母粉濃度為1.5%。

2.2.4 正交優(yōu)化試驗結(jié)果分析

正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal tests

由表2 可知，影響發(fā)酵過程的主次順序為培養(yǎng)基初始pH 值>蛋白胨濃度>甲醇濃度。通過比較k 值可以得到最佳組合為A2B2C1，即甲醇濃度1.00%、培養(yǎng)基初始pH5.5、蛋白胨濃度1.5%。

2.2.5 驗證試驗

對A2B2C1與A2B2C3進(jìn)行驗證，組合A2B2C1粗酶液酶活為18.2 U/mL，高于組合A2B2C3，因此為最優(yōu)組合。

2.3 5 L 發(fā)酵罐發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 接種量對AaeUPO 表達(dá)的影響

接種量對AaeUPO 表達(dá)的影響見圖5。

圖5 接種量對AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on AaeUPO expression

由圖5 可知，接種量會影響菌體的生長曲線。接種量越高，相同時間內(nèi)發(fā)酵罐中的菌體濃度就越大。但通過酶活的測定結(jié)果可以看出，并不是接種量越高，最終發(fā)酵完成的酶活力就越高。接種量會對畢赤酵母的對數(shù)成長階段產(chǎn)生影響。接種量過低，發(fā)酵培養(yǎng)時間過長，發(fā)酵過程中動力的消耗會增加，并且有染雜菌的風(fēng)險。接種量過高會導(dǎo)致發(fā)酵前期菌體生長過于旺盛，代謝產(chǎn)物增多，造成菌體的早衰。此外，接種量過高也會消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，從而影響對目的蛋白的合成。綜上，以10%作為最適接種量。

2.3.2 誘導(dǎo)溫度對AaeUPO 表達(dá)的影響

誘導(dǎo)溫度對AaeUPO 表達(dá)的影響見圖6。

圖6 誘導(dǎo)溫度對AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.6 Effect of induction temperature on AaeUPO expression

由圖6 可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)168 h、誘導(dǎo)溫度為30 ℃時AaeUPO 的表達(dá)量最高。畢赤酵母最適生長溫度為30 ℃，當(dāng)溫度為28 ℃和32 ℃時菌體生長緩慢。發(fā)酵過程中的菌體生長、目的蛋白合成以及發(fā)酵液的理化性質(zhì)均會受誘導(dǎo)溫度的影響。誘導(dǎo)溫度過高或過低都不利于菌體的正常生長和目標(biāo)基因的表達(dá)，最終選擇30 ℃作為最佳誘導(dǎo)溫度。

2.3.3 甲醇添加方式對AaeUPO 表達(dá)的影響

甲醇添加方式對AaeUPO 表達(dá)的影響見圖7。

圖7 甲醇添加方式對AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.7 Effect of methanol adding method on expression of AaeUPO

由圖7 可知，甲醇添加方式也會對畢赤酵母的表達(dá)有很大的影響。將分批加入甲醇（即每隔24 h 添加1 次）的方式優(yōu)化為流加甲醇的方式，獲得的粗酶液最終酶活由20.8 U/mL 提升至25.1 U/mL。畢赤酵母表達(dá)階段以甲醇作為唯一碳源，但當(dāng)甲醇濃度過高時會對畢赤酵母活性造成損傷，進(jìn)而影響酶活。通過流加甲醇可以實現(xiàn)甲醇長時間低濃度供應(yīng)，既保證了碳源的供給，又能減少高濃度甲醇對菌株的損傷。

2.4 優(yōu)化前后粗酶液酶活的對比

優(yōu)化前后粗酶液酶活的對比結(jié)果見圖8。

由圖8 可知，優(yōu)化前粗酶液酶活僅有13.1 U/mL。經(jīng)過在搖瓶水平對培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，最高酶活為18.2 U/mL。在最佳培養(yǎng)基的條件下，進(jìn)行5 L 發(fā)酵罐放大試驗，并對發(fā)酵條件及工藝進(jìn)行優(yōu)化。最優(yōu)的發(fā)酵條件為甲醇濃度1.00%、培養(yǎng)基初始pH5.5、蛋白胨濃度1.5%、酵母粉濃度1.5%、接種量10%、誘導(dǎo)溫度30 ℃、流加甲醇。優(yōu)化后得到的最高酶活為25.1 U/mL，細(xì)胞濕重244 g/L。相較于未優(yōu)化單位粗酶液酶活提升了91.6%，對中試具有一定的指導(dǎo)意義。

2.5 AaeUPO 在H2O2 檢測中的應(yīng)用

2.5.1 H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖9。

圖9 H2O2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Working curve of H2O2

由圖9 可知，采用AaeUPO 檢測H2O2，在H2O2濃度5～80 μmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.028 37x+0.006 71，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 62。按照試驗方法平行20 次測定空白試劑，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04，并由此計算出H2O2最低檢測限為5 μmol/L。

2.5.2 干擾試驗

當(dāng)H2O2濃度為50 μmol/L 時，設(shè)定相對誤差不大于5%。添加10 倍濃度的Fe3+、Zn2+、K+、Na+、NH4+、CO32-、SO42-、SO32-均不會影響測定結(jié)果。

2.5.3 加標(biāo)回收試驗

對3 個試劑樣品進(jìn)行相同程序的加標(biāo)回收試驗，分析結(jié)果見表3。

表3 樣品回收試驗Table 3 Sample recovery experiment

由表3 可知，在蒸餾水和礦泉水中未檢測到H2O2，在啤酒中檢測到H2O2濃度為6.4 μmol/L。此外，3 種不同濃度的H2O2加標(biāo)回收試驗的回收率為85.1%～96.1%，表明使用AaeUPO 檢測H2O2具有很好的適用性，可用于實際樣品的檢測。

3 結(jié)論

本試驗通過搖瓶水平發(fā)酵優(yōu)化了甲醇濃度、培養(yǎng)基初始pH 值、酵母粉濃度和蛋白胨濃度，通過正交試驗確定了畢赤酵母搖瓶水平高效表達(dá)AaeUPO 的基本發(fā)酵條件：甲醇濃度1.00%、培養(yǎng)基初始pH5.5、蛋白胨濃度1.5%、酵母粉濃度1.5%。根據(jù)驗證試驗，得出最優(yōu)發(fā)酵條件下粗酶液酶活達(dá)到18.2 U/mL。在搖瓶水平發(fā)酵試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行5 L 發(fā)酵罐放大試驗，優(yōu)化后以接種量10%、誘導(dǎo)溫度30 ℃、流加甲醇作為最終工藝條件。最終得到的細(xì)胞濕重244 g/L，最高酶活為25.1 U/mL，相較于初期未優(yōu)化酶活提升了91.6%。將AaeUPO 用于實際樣品的H2O2檢測，結(jié)果表明，AaeUPO對于H2O2具有較好的檢測性能，檢測限達(dá)到5 μmol/L，抗干擾性能強(qiáng)。