河南傳統面食發酵劑中微生物菌群結構分析

李斌，彭兆帝，杜帆帆，楊龍輝，王靜

（河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450046）

我國把傳統面食發酵劑稱為老面、酵子、酸面團或面肥等。老面是我國最古老的面團起發劑，從13 世紀開始老面就被人們用來發酵面團[1]。老面是一種混合型發酵劑，以米粉、小麥粉或玉米粉等谷物為主要原料，加入酒曲（大曲或小曲）和水，在酵母菌、霉菌以及乳酸菌等各種微生物的共同作用下，連續經過多次發酵而成[2]。采用傳統老面制作的發酵面食，較之采用酵母的純種發酵，具有更好的香氣和口感，這與老面菌種的多樣性有關[3-5]。在我國的不同地區，生產老面的工藝與原材料卻大不相同，以河南的南陽、商丘以及三門峽3 個地區為例：南陽地區的老面原料是米粉，酵種為小曲，經過多次保溫發酵而成；商丘地區老面的主要原料是玉米粉，酵種為大曲；三門峽地區的老面則是以小麥粉作為原料，小麥曲和黃酒作為酵種[6]。不同的原料和工藝使不同產地的老面的微生物菌群結構存在一定的差異，對饅頭的組織結構、老化速率、風味特性和保質期等有不同的影響[7-8]。

我國傳統老面與西方國家的酸面團相似，但是我國對于傳統老面的研究卻遠遠落后于西方國家[9]。近年來，老面被越來越多的研究者所重視，主要是針對不同地區的傳統老面中的微生物多樣性進行分析研究。高靜等[10]采用高通量測序技術分析了河北、山西、山東和云南4 個不同地區老面的菌群組成，并探究菌群對饅頭品質的影響。閆博文[2]采用高通量測序技術研究了山東老面和河南酵子的微生物的菌群多樣性以及不同菌群對饅頭風味特征的影響。傅莉莉[11]采用傳統平板分離技術結合高通量測序檢測方法，揭示了采自甘肅和新疆的酸面團中微生物菌群的多樣性以及結構組成。

高通量測序技術（high-throughput sequencing，HTS）具有高速、高通量以及高精確性等特點，為認識傳統老面釀造微生物多樣性提供了有利手段[12]。河南是全國主要的面粉及面制品加工基地之一[13]，河南位于黃河流域，具有悠久的傳統發酵面制品的歷史[14]。本研究以鄭州、南陽、三門峽、周口、商丘和安陽6 個不同地區的傳統面食發酵劑為研究對象，利用Illumina MiSeq高通量測序技術對傳統面食發酵劑菌群中的微生物多樣性進行分析，以期解析河南傳統面食發酵劑中復雜的菌群結構，為后續傳統饅頭工業化生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

河南本地傳統面食發酵劑采自鄭州（樣本1）、南陽（樣本2）、三門峽（樣本3）、周口（樣本4）、商丘（樣本5）、安陽（樣本6）6 個地區，均為自然發酵而成，被長期用于制作手工饅頭。樣品采集后置于無菌瓶中，在4 ℃冰箱中保存備用。

1.1.2 試劑

瓊脂糖（生物純）：德國Biofroxx 公司；土壤基因組DNA 提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；醋酸（分析純）：天津市德恩化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16C 臺式高速離心機：上海安亭科學儀器廠；MJ-78A 立式電壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；DYCP-31E 瓊脂糖水平凝膠電泳槽：北京市六一儀器廠；GelDocTMEZImager 凝膠電泳成像分析系統：美國Bio-rad 公司；Nano2000 超微量紫外分光光度計；英國柏點公司；Illumina Miseq2500 測序儀：美國Illumina 公司；SW-CJ-2G 超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取

根據土壤基因組DNA 提取試劑盒說明書提取樣品中的微生物總DNA。提取的DNA 保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.3.2 聚合酶鏈式反應及測序

對真菌的ITS 基因序列進行PCR 擴增，其中包括引物ITS1（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2-Rev（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）[15]。對細菌的16S rDNA 的V3～V4區域基因序列進行PCR 擴增，其中包括引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）[16]。PCR擴增體系和擴增條件參考文獻[17]的方法。按照Illumina MiSeq2500 測序儀操作說明進行pe250/300 雙端測序，序列信息由MiSeq 控制軟件讀取。

1.4 數據處理與分析

首先對原始數據進行剪接和低質量過濾，然后去除嵌合序列，得到有效的序列進行聚類分析，具體參考文獻方法[17]。計算各個樣品中微生物的Alpha 多樣性指數，繪制香農（Shannon）指數曲線，同時統計分析各個樣品中的真菌和細菌的群落信息。

2 結果與分析

2.1 真菌菌群多樣性分析

2.1.1 序列的拼接

利用Illumina Miseq 測序平臺獲得樣本1 至樣本6 對應的真菌原始序列分別為36 482、47 852、38 298、43 467、56 916 條和45 355 條，其平均堿基長度分別為340、337、432、375、311 bp 和337 bp。經拼接、過濾，得到有效序列分別為36 459、47 849、38 226、43 387、56 873、45 318 條，它們的平均堿基長度分別為298、295、389、334、269 bp 和295 bp。操作分類單元（operational taxonomicunits，OTU）數量分別為39、23、43、53、23 和53。

2.1.2 Alpha 多樣性分析

通常用于描述微生物群落物種多樣性的Alpha 多樣性指數主要是香農指數、ACE 指數、超1（Chaol）指數和辛普森（Simpson）指數，它們可以綜合性地評價群落物種組成的豐富度[18-19]。ACE 指數（或超1 指數）越小，說明菌群的物種豐富度越低；香農指數越小，說明菌群中物種的多樣性越低；辛普森指數越小，說明菌群中物種的多樣性越高；覆蓋率越小，說明樣本中序列沒有被測出的概率越高，若覆蓋率＞97%，則說明本次試驗結果是可信的[20]。不同樣品中的真菌菌群的Alpha多樣性指數的分析結果見表1。

表1 不同面食發酵劑中真菌菌群Alpha 多樣性指數分析Table 1 Alpha diversity index of fungi community in different dough starter cultures

根據表1 可知，樣本1 的香農指數最大，辛普森指數最小，證明其真菌物種多樣性最高；樣本4 的超1 指數和ACE 指數最大，表明其真菌群落的物種豐富度最高；辛普森指數值最大的是樣本3，說明它的群落中真菌物種多樣性最低。6 個樣品的覆蓋率都大于99%，證明本研究取樣合理，測序結果可以反映樣本真實情況。

為了比較不同樣本的測序數據量不同時物種多樣性的大小和判斷樣本的測序數據量是否合理，用Shannon 指數作為縱坐標，提取的序列數目作為橫坐標繪制稀疏性曲線[5]，結果如圖1。

圖1 不同面食發酵劑真菌菌群的Shannon 指數曲線Fig.1 Shannon index curves of fungi community in different dough starter cultures

根據圖1 可知，6 個樣品真菌菌群多樣性的大小為樣本1＞樣本6＞樣本4＞樣本5＞樣本2＞樣本3，并且隨著提取序列數目的不斷增加，Shannon 指數基本穩定不變，曲線趨于平緩，說明測序的數據量逐漸合理。

2.1.3 基于屬水平各樣本中真菌的種類和相對豐度分析

在屬水平上，以傳統面食發酵劑真菌的類型和相對豐度為基礎，將樣品中的菌屬按相對豐度劃分，相對豐度≥0.01%的菌屬作為優勢菌屬，相對豐度＜0.01%的菌屬作為次要菌屬，把所有次要菌屬劃分為其他，結果如表2 所示。

表2 不同面食發酵劑中真菌菌屬及相對豐度Table 2 Genera and relative abundance of fungi in different dough starter cultures

根據表2 可知，不同產地的傳統面食發酵劑的真菌菌群結構存在著明顯差異，酵母屬（Saccharomyces）是傳統面食發酵劑中的優勢真菌屬。酵母屬屬于子囊菌門、酵母亞門、酵母綱、酵母目、酵母科，其中最典型的是釀酒酵母，它是一種與人類有著密切聯系的酵母。釀酒酵母也是迄今為止對人類社會具有較大貢獻的菌種，是釀酒行業中非常重要的菌種之一，也是面包、糕點和制藥行業中的主要菌種之一[21]。有孢圓酵母屬（Torulaspora）是一株非釀酒酵母菌，發現于傳統面食發酵劑中，而且是主要存在的酵母類群之一。隨著德爾布有孢圓酵母菌的高耐受性和抗凍性的發現，引起了非常多的科研工作者的注意[22]。德爾布有孢圓酵母對面團發酵的能力和商業面包酵母能力非常相近，因此在食品發酵行業具有巨大的潛在應用價值[23]。在葡萄糖不足氧氣充足的條件下，德爾布有孢圓酵母的生物生長量和釀酒酵母的生長能力非常接近，當氧氣的量逐漸缺乏的時候，釀酒酵母就開始改變呼吸方式，進行發酵代謝，但是德爾布有孢圓酵母仍然可以進行有氧呼吸。德爾布有孢圓酵母不但具有耐高滲透壓能力，還有很高的產酯能力，可以使發酵過程中產生濃郁的果香味[24]。威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）是一種非釀酒酵母，它的發酵量很小，但是它可以通過合成酶，使原料中的前體物質轉化成酯、酸、醇、醛等芳香物質，在釀造過程中也起著重要的作用，其中的異常威克漢姆酵母就是一種典型的產香酵母，具有很強的產香產酯能力[25]。

2.2 細菌菌群多樣性分析

2.2.1 序列的拼接

利用Illumina Miseq 測序平臺獲得的樣本1 至樣本6 對應的細菌原始序列分別為73 460、60 215、51 109、46 030、58 818 條和48 140 條，其平均堿基長度分別為464、462、462、457、458 bp 和451 bp。經拼接、過濾，得到有效序列分別為73 284、60 092、50 615、45 482、58 273 條和47 388 條，它們的平均堿基長度分別為426、425、426、423、423 bp 和417 bp。OTU 數量分別是34、22、82、98、96 和91。

2.2.2 Alpha 多樣性分析

不同樣品中細菌菌群的Alpha 多樣性指數分析結果見表3。

表3 不同面食發酵劑中細菌菌群Alpha 多樣性指數分析Table 3 Alpha diversity index of bacterial community in different dough starter cultures

根據表3 可知，樣本5 的香農指數最高，辛普森指數最低，說明樣本5 中的細菌群落分布多樣性在所有樣本中是最高的，樣本1 則剛好相反。ACE 指數和超1指數最大的樣本均為樣本4，由此可見樣本4 中的細菌群落分布豐富度在6 個樣本中是最高的，而樣本2則為最低。6 個樣本的覆蓋率都大于99%，證明本次取樣合理，測序結果可以反映樣本真實情況。

不同面食發酵劑細菌菌群的Shannon 指數曲線見圖2。

圖2 不同面食發酵劑細菌菌群的Shannon 指數曲線Fig.2 Shannon index curves of bacterial community in different dough starter cultures

由圖2 可見，6 條曲線最終都趨于平穩，說明測序結果是合理的。并且根據圖中Shannon 指數的數值可以看出，6 個樣品的細菌群落多樣性由高到低依次是樣本5＞樣本4＞樣本2＞樣本6＞樣本3＞樣本1。

2.2.3 屬水平細菌種類和相對豐度分析

在屬水平上，以傳統面食發酵劑細菌的類型和相對豐度為基礎，將樣品中的菌屬按相對豐度劃分，相對豐度≥0.01%的菌屬作為優勢菌屬，相對豐度小于0.01%的菌屬作為次要菌屬，并將所有次要菌屬劃分為其他，結果如下表4 所示。

表4 不同面食發酵劑中細菌菌屬及相對豐度Table 4 Genera and relative abundance of bacterial in different dough starter cultures

根據表4 可知，6 個樣本都存在的優勢細菌菌屬是乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）。乳酸菌為傳統面食發酵劑中的優勢細菌，且不同地區樣本中的優勢細菌菌屬存在一定的差異。乳桿菌屬（Lactobacillus）包含發酵乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、哈爾濱乳桿菌（Lactobacillus harbinensis）和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）等多個菌種。乳桿菌屬是目前開發研究比較深入的一類益生菌，是人類腸道中重要的菌群[26]。片球菌屬（Pediococcus）較為常見的菌種有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、小片球菌（Pediococcus smallus）和有害片球菌（Pediococcus harmful）等。其中的戊糖片球菌是被批準的可食用菌種，戊糖片球菌具有抑制食源性致病菌、抗氧化以及提高機體免疫力等優點，而且在動物飼料以及發酵食品等方面還有廣泛的應用前景[27-28]。魏斯氏菌屬（Weissella）不僅能對發酵食品的風味以及發酵進程產生巨大影響，而且還能夠提高食品的安全性和保質期[29-30]。明串球菌屬（Leuconostoc）包括冷明串珠菌（Leuconostoc frigida）、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis）等7 個菌種。檸檬明串珠菌是明串球菌屬中較為常見的菌種，其產生的細菌素可以在不同發酵食品中進行生物保存，也可以應用于抗生素耐藥的動脈或腸球菌感染的生物治療中[31]。Zhang 等[32]通過對老面的菌群結構研究發現，乳桿菌屬在自然發酵面團中最普遍；片球菌常存在于植物性發酵食品中，在發酵面團中也常被發現。De Vuyst 等[33]發現酵子中的乳酸菌主要包括片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和明串珠菌屬（Leuconostoc）等。

3 結論

采用Illumina MiSeq 高通量測序技術分析了河南6 個不同地區（鄭州、南陽、三門峽、周口、商丘和安陽）的傳統面食發酵劑中的微生物多樣性。研究結果表明：真菌菌群多樣性分析結果表明在6 個樣品中鄭州樣本的Shannon 指數最大，Simpson 指數最小，證明其真菌物種多樣性最高。6 個樣品的優勢真菌屬主要是酵母屬（Saccharomyces）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）。細菌群落多樣性分析結果表明商丘樣本的Shannon 指數最大，Simpson 指數最小，說明其細菌物種多樣性最高。6 個樣品中的細菌絕大部分是乳酸菌，優勢細菌屬主要有乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串球菌屬（Leuconostoc）和魏斯氏菌屬（Weissella）等。在不同地區的樣品中優勢真菌和細菌菌屬的種類和含量存在較大差異。本研究將根據上述試驗結果，采用傳統平板劃線分離的方法，以期獲得優勢菌種純種，并對其發酵性能進行研究，為后續工業化生產具有傳統風味饅頭提供一定的理論依據。