血清miR-520h和miR-376c對妊娠期高血壓患者發生妊娠結局不良的多因素分析及臨床價值

吳麗華,陳 辰,高玲玲

復旦大學附屬婦產科醫院產科,上海 200090

妊娠期高血壓(HDCP)是妊娠期特發疾病,其發病率為5%～10%,且呈逐年升高趨勢[1]。HDCP一般發生在妊娠20周至分娩后2周,表現為血壓升高,出現蛋白尿和水腫等癥狀,易導致多種妊娠結局不良的發生[2]。因此,發現早期預測HDCP患者發生妊娠結局不良的標志物,對改善母嬰預后有重要意義。微小核糖核酸(miRNAs)是由22個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA,在基因的調控中發揮重要作用[3]?，F有研究證實,子癇前期(PE)患者足月胎盤和血漿中的miR-376c水平降低,其被認為是PE診斷的標志物。并發現miR-376c可促進滋養細胞活力、遷移和侵襲,其水平下降會導致孕婦妊娠并發癥的發生[4]。另一項研究顯示,miR-520h在孕婦細胞、胎盤和血液中呈高水平,故被認為是PE診斷的重要標志物[5]。miR-520h和miR-376c對HDCP患者發生妊娠結局不良的診斷價值尚未明確。本研究通過觀察HDCP患者血清miR-520h和miR-376c水平,分析其對HDCP患者發生妊娠結局不良的預測效能,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2022年12月于本院就診的HDCP患者128例作為HDCP組,HDCP組年齡24～43歲,平均(31.66±4.50)歲;孕周36～40周,平均(38.16±0.87)周。根據HDCP患者的疾病嚴重程度分為妊娠高血壓組54例,輕度PE組41例和重度PE組33例。另選取同期在本院體檢的健康孕婦75例作為對照組,年齡24～43歲,平均(31.04±4.96)歲;孕周36～40周,平均(37.92±0.80)周。納入標準:患者符合HCDP的診斷標準[6];單胎妊娠。排除標準:病歷資料不完整;存在心、肝、腎等重要功能障礙;伴高血壓、冠心病和肺病等慢性疾病;合并腫瘤或其他免疫性疾病;智力低下和有精神疾病;未定期進行產檢。HDCP組與對照組研究對象年齡、孕周比較,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。所有患者均知情同意,并簽署知情同意書,本研究經醫院倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1血液標本留取 留取所有研究對象的清晨空腹靜脈血10 mL,取5 mL放置在無抗凝劑的試管中,分離血清并將其放置在1.5 mL的離心管中,再將其置于在4 ℃的環境下按照3 000 r/min的速度離心10 min,然后以12 000 r/min的速度離心15 min,清除細胞沉積物后,將其置于-80 ℃的冰箱保存。另5 mL靜脈血用于測定血脂和miRNAs水平。采用全自動生化儀(OTA-400 型,沈陽萬泰醫療設備有限責任公司)測定血清血紅蛋白、總膽固醇和甘油三酯。留取HDCP患者24 h尿液,通過生化分析儀測定24 h尿蛋白。所有的試劑盒均為配套試劑盒,嚴格按照說明書操作。

1.2.2實時熒光定量PCR 提取總RNA:采用Trizol 法對血漿進行總RNA提取,按照總RNA分離試劑盒說明書操作。合成cDNA:采用Taqman 探針法合成,首先配置反應體系。RNA 4.5 μL,RNA引物1.5 μL,無水核糖核酸酶(RNase)0.4 μL,脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.2 μL,10×buffer 0.8 μL和抑制劑0.1 μL。反應條件:在95 ℃的環境下先以起始模板預變性10 min,在中模板中95 ℃環境下變性15 s,在60 ℃環境下退火1 min,共循環40次。其中引物序列為miR-520h正向引物:5′-ACA AAGUGCUUCCCUUUAGA-3′,反向引物:5′-UCUAAAGGGAAGCACUUGUUU-3′。miR-376c正向引物:5′-GGGGACACTTTGGAC-3′,反向引物:5′-GGTCCGTGAGGGATGATGTC-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)正向引物:5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3,反向引物:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。PCR反應體系:dNTP 1.6 μL、10 μmol/L的正反向引物1.0 μL、Taq DNA 聚合酶1.0 μL、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)12.5 μL,加反應反沖液至25.0 μL。PCR反應條件:在95 ℃環境下變性10 s,在65 ℃環境下退火20 s,在75 ℃環境下延伸在15 s,共40個循環。以2-ΔΔCt計算出miR-520h和miR-376c的水平。

1.2.3妊娠結局 選擇發生早產、胎膜早破、產后出血、胎兒生長受限、新生兒窒息和胎兒窘迫等的HDCP患者為妊娠結局不良組(55例),其余患者為妊娠結局良好組(73例)。

1.2.4觀察指標 觀察HDCP組和對照組血清miR-520h和miR-376c水平變化;比較HDCP患者妊娠結局良好組與不良組的一般資料及實驗室指標;分析HDCP患者發生妊娠結局不良的多因素;比較不同嚴重程度HDCP患者的血清miR-520h和miR-376c水平;評估血清miR-520h和miR-376c水平對HDCP患者發生妊娠結局不良的預測效能。

2 結 果

2.1HDCP組和對照組患者血清miR-520h和miR-376c水平比較 HDCP組血清miR-520h水平高于對照組,而血清miR-376c水平低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 HDCP組和對照組患者血清miR-520h和miR-376c水平比較

2.2不同嚴重程度HDCP患者的血清miR-520h和miR-376c水平比較 重度PE組患者的血清miR-520h水平高于輕度PE組和妊娠高血壓組,輕度PE組患者的血清miR-520h水平高于妊娠高血壓組,差異均有統計學意義(P<0.05);重度PE組血清miR-376c水平低于輕度PE組和妊娠高血壓組,輕度PE組低于妊娠高血壓組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同嚴重程度HDCP患者的血清miR-520h和miR-376c水平比較

2.3HDCP患者妊娠結局良好組與妊娠結局不良組的一般資料及實驗室指標比較 兩組發病孕周、不同HDCP嚴重程度及收縮壓、24 h尿蛋白和血清miR-520h和血清miR-376c水平比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 HDCP患者妊娠結局良好組與不良組的一般資料及實驗室指標比較或n(%)]

2.4影響HDCP患者妊娠結局的二元Logistic回歸分析 將表3中差異有統計學意義的指標[發病孕周(≥38周=1,<38周=0)、HDCP嚴重程度(妊娠期高血壓=1,輕度PE=2,重度PE=3)、收縮壓(≥131.12 mmHg=1,<131.12 mmHg=0)、24 h尿蛋白(≥5.97 g/24 h=1,<5.97 g/24 h=0)、miR-520h(≥2.70=1,<2.70=0)和miR-376c(≥1.67=1,<1.67=0)]進行賦值,根據是否發生妊娠結局不良進行二元Logistic回歸分析,結果顯示發病孕周≥38周、HDCP嚴重程度越高、血清miR-520h≥2.70是HDCP患者發生妊娠結局不良的危險因素(P<0.05),miR-376c≥1.67是HDCP患者發生妊娠結局不良的保護因素(P<0.05)。見表4。

表4 HDCP患者妊娠結局影響因素的二元Logistic回歸分析

2.5血清miR-520h和miR-376c水平對HDCP患者發生妊娠結局不良的預測效能 根據HDCP患者是否發生妊娠結局不良進行Logistic分析,聯合應用時建立回歸預測模型:Y= 1.39×XmiR-520h-3.73×XmiR-376c+1.65。結果顯示血清miR-520h和miR-376c聯合檢測的靈敏度為76.4%,特異度為94.5%,曲線下面積(AUC)為0.929高于miR-520h(AUC=0.805)和miR-376c(AUC=0.880)單獨檢測。見表5。

表5 血清miR-520h和miR-376c水平對HDCP患者發生妊娠結局不良的預測效能

3 討 論

HDCP是最常見的妊娠特有的并發癥,隨著病情加重,患者常發生妊娠結局不良。HDCP病理基礎是全身小血管痙攣導致胎盤供血減少,出現滋養細胞侵襲不足,引起母嬰并發癥發生[7-8]。目前尚未找有效預測HDCP患者發生妊娠結局不良的靈敏指標。miRNA對細胞增殖、分化和凋亡有明顯的調控作用,在維持胎盤功能穩態中起到重要作用,有望成為預測HDCP患者發生妊娠結局不良的靈敏指標[9-10]。因此本研究采用血液作為標本,檢測HDCP患者血清miR-520h、miR-376c水平,觀察其在HDCP患者發生妊娠結局不良的預測價值,因為miRNA在血液中較為穩定,可以在反復凍融,且不同酸堿度和裂解酶的條件下保持miRNA的穩定性,同時血液標本易得,可重復檢測。

本研究表明,HDCP組血清miR-520h水平高于對照組,并且隨著HDCP嚴重程度升高而升高,差異均有統計學意義(P<0.05),說明miR-520h與HDCP的發生發展有關。有研究證實miR-520h水平在晚期乳腺癌患者中明顯升高,認為miR-520h是一種對癌細胞具有保護作用的RNA,是腫瘤細胞復發和轉移的潛在標志物[11-12]。有研究表明,miR-520h在復發性流產患者的絨毛組織中呈高水平,可導致DNA損傷,促進滋養細胞凋亡,并提示miR-520h作為一種新的抑制因子可能與復發性流產有關[13]。有研究顯示,miR-520可通過抑制核因子-kB信號激活,減少炎癥因子釋放,調控炎癥的發生發展[14]。本研究通過二元Logistic回歸分析發現miR-520h水平升高是HDCP患者發生妊娠結局不良的危險因素(P<0.05),提示血清miR-520h水平越高,孕婦發生妊娠結局不良的可能性越高。因此對這類患者是否要采取干預措施,需進一步研究。

本研究結果顯示,HDCP組血清miR-376c水平低于對照組,并且血清miR-376c水平隨著HDCP嚴重程度升高而降低,差異均有統計學意義(P<0.05),說明miR-376c參與了HDCP的發生發展。miR-376c在多種腫瘤細胞中的水平不一,在子宮頸癌[15]和膽管癌[16]等腫瘤中呈高水平,而在卵巢癌[17]中呈低水平,作為抑癌基因參與腫瘤細胞增殖、遷移和轉移等生物學行為,從而影響腫瘤細胞增殖和凋亡。在關于HDCP的研究中發現,miR-376c水平在PE胎盤中明顯降低,并與胎盤細胞的增殖和胎盤的發育有關,因此認為胎盤miR-376c水平降低,可以導致胎盤異常發育甚至發生孕婦早產[18]。本研究顯示,miR-376c水平上升是HDCP患者發生妊娠結局不良的保護因素(P<0.05);血清miR-520h和miR-376c聯合預測HDCP患者發生妊娠結局不良的AUC為0.929,明顯高于各項指標單獨預測,說明miR-520h和miR-376c在診斷HDCP患者發生妊娠結局不良方面具有某種互補性,2個基因水平具有某種平衡,這種平衡被打破可能導致患者發生妊娠結局不良,對于2個基因水平均異常的患者,是否需要采取進一步的干預措施,需要在未來的研究中進行證實。

總之,血清miR-520h和miR-376c參與HDCP的發生發展,聯合檢測miR-520h和miR-376c水平有助于預測HDCP患者妊娠結局。