血清lncRNA XIST和miRNA-130a表達與膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度及患者預(yù)后的關(guān)系

劉維娜,楊志勇

西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,陜西西安 710100

膿毒癥主要由宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)引起,其特點為能早期激活炎癥反應(yīng)、引起免疫抑制及凝血障礙[1]。目前,有多種治療該疾病的方法,如液體復(fù)蘇、抗菌治療、血管活性藥物和膿毒癥引起的器官功能障礙的支持治療等,但膿毒癥患者的預(yù)后仍然不良,住院病死率為40%[2]。因此需要探索更具敏感性和特異性的生物標(biāo)志物用于膿毒癥的早期診斷和提前預(yù)防。長非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的RNA,但缺乏蛋白質(zhì)編碼能力,諸多研究表明,lncRNA可通過多種機制,如表觀遺傳調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)等參與基因組調(diào)控[3]。最新發(fā)現(xiàn)的lncRNA X非活性特異性轉(zhuǎn)錄本(XIST)被確認(rèn)與多種腫瘤的進展有關(guān),但XIST在膿毒癥中的作用尚不清楚。有研究表明,lncRNA XIST在幾種炎癥相關(guān)疾病,如關(guān)節(jié)炎和急性肺炎誘導(dǎo)的炎癥損傷中過度表達,可能參與了膿毒癥的疾病進展和炎癥反應(yīng)[4-5]。微小RNA(miRNA)屬于小的非編碼RNA,具有18～24個核苷酸,通過靶向3′-非翻譯區(qū)的mRNA參與多種細(xì)胞功能[6]。在各種miRNA中,腫瘤抑制因子——miRNA-130a通過多種機制抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng),PAKRAVAN等[7]提出,阿霉素治療后可通過上調(diào)miRNA-130a的表達緩解心肌炎的炎癥水平。但lncRNA XIST 和miRNA-130a在膿毒癥中的作用尚不清楚。基于此,本研究旨在研究lncRNA XIST和miRNA-130a與膿毒癥患者的疾病風(fēng)險、嚴(yán)重程度、炎癥標(biāo)志物和預(yù)后的相關(guān)性,以期為臨床早期診斷及治療膿毒癥提供參考依據(jù),現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2022年12月本院收治的膿毒癥患者73例作為研究對象,根據(jù)癥狀嚴(yán)重程度分為膿毒癥組(52例)和膿毒性休克組(21例)。膿毒癥組男23例,女29例,平均年齡(62.46±10.27)歲。膿毒性休克組男11例,女10例,平均年齡(63.63±11.16)歲。收集患者年齡、性別、病史(肺炎、創(chuàng)傷、外科手術(shù)后、胰腺炎、糖尿病等)、感染部位等一般資料,留取血標(biāo)本進行白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、血小板壓積(PCT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、乳酸(Lac)水平檢測,記錄入院時序貫器官衰竭(SOFA)評分和急性生理與慢性健康(APACHEⅡ)評分。膿毒癥患者納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡18～80歲;(2)符合國際膿毒癥定義SPESIS 3.0診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)妊娠期或哺乳期婦女;(2)患有其他腫瘤、血液等疾病;(3)合并艾滋病;(5)住院時間小于24 h。對73例膿毒癥患者進行28 d隨訪,根據(jù)患者轉(zhuǎn)歸情況分為存活組(54例)和死亡組(19例)。另選取30例同期在本院接受體檢的健康者作為對照組,其中男17例,女13例;平均年齡(64.38±10.27)歲;無基礎(chǔ)疾病。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書,本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2方法 采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測血清lncRNA XIST和miRNA-130a表達水平。采集各組靜脈血各3 mL用于分析血清lncRNA XIST和miRNA-130a 表達水平。3 000 r/min離心10 min 后取血清并加入RNA提取液,用于提取RNA。將所提取RNA溶解并調(diào)整質(zhì)量濃度為100～500 ng/μL,根據(jù)試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。最后進行PCR擴增。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃,10 min;變性95 ℃,15 s;退火60 ℃,60 s;延伸95 ℃,15 s;循環(huán)60次。引物信息:lncRNA XIST,正向為5′-AATGACTGCCACTGCTGGG-3′,反向為5′-GTGTAGGTGGTTCCCC AAGG-3′。miR-23a,正向為5′-TGCGTGCGA TCACATTGCCAGGGA-3′,反向為5′-TACGAAGGGTCCGAACAC-3′。U6,正向為5′- GCCGCAGTGCAATGTTAAAA-3′,反向為5′- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACATGCCC-3′。

2 結(jié) 果

2.1膿毒癥組與膿毒性休克組一般資料及各指標(biāo)水平比較 兩組性別、年齡、WBC、病史比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組SOFA評分、APACHEⅡ評分、PCT、CRP、Lac水平比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 膿毒癥組組與膿毒性休克組一般資料及各指標(biāo)水平比較

2.2對照組、膿毒癥組、膿毒性休克組血清lncRNA XIST和miRNA-130a表達水平比較 與對照組比較,膿毒癥組和膿毒性休克組lncRNA XIST表達水平均升高,且膿毒性休克組高于膿毒癥組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較,膿毒癥組和膿毒性休克組血清中miRNA-130a表達水平均降低,且膿毒性休克組低于膿毒癥組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 對照組、膿毒癥組、膿毒性休克組血清lncRNA XIST和miRNA-130a表達水平比較

2.3存活組與死亡組一般資料及各指標(biāo)水平比較 兩組性別、年齡、WBC比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組病情嚴(yán)重程度(膿毒癥/膿毒性休克)、SOFA評分、APACHEⅡ評分、CRP、PCT、Lac、lncRNA XIST、miRNA-130a比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 存活組與死亡組一般資料及各指標(biāo)水平比較中位]

2.4膿毒癥患者預(yù)后情況影響因素的多因素 Logistic回歸分析 以膿毒癥患者結(jié)局狀態(tài)為因變量(死亡=1,存活=0),以表3中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的8項指標(biāo)為自變量。賦值見表4。結(jié)果顯示,膿毒性休克、SOFA評分≥7.85分、APACHEⅡ評分≥19.55分、lncRNA XIST表達水平升高、miRNA-130a表達水平降低是膿毒癥患者預(yù)后情況的獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

表4 賦值

表5 膿毒癥患者預(yù)后情況影響因素的多因素 Logistic回歸分析

2.5血清lncRNA XIST和miRNA-130a單獨及聯(lián)合表達對膿毒癥預(yù)后情況的預(yù)測價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清lncRNA XIST和miRNA-130a聯(lián)合診斷ROC曲線下面積(AUC)大于各項指標(biāo)單獨檢測,診斷價值理想。見表6。

表6 血清lncRNA XIST和miRNA-130a單獨及聯(lián)合表達對膿毒癥預(yù)后情況的預(yù)測價值

3 討 論

本研究結(jié)果表明,與對照組比較,膿毒癥組和膿毒性休克組血清lncRNA XIST表達水平均升高,且膿毒性休克組高于膿毒癥組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較,膿毒癥組和膿毒性休克組血清miRNA-130a表達水平均降低,且膿毒性休克組低于膿毒癥組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。有研究表明,一些lncRNAs通過與多個基因和信號通路的相互作用而參與炎癥性疾病,如與核因子-κB(NF-κB)相關(guān)的lncRNA通過防止NF-κB的過度表達來抑制炎癥,從而減少乳腺癌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移[8]。另一項動物研究表明,lncRNA EPS的下調(diào)通過與異質(zhì)核核糖核蛋白相互作用來抑制小鼠巨噬細(xì)胞中的免疫應(yīng)答基因,從而增強炎癥反應(yīng)[9]。FU等[10]發(fā)現(xiàn),HK2細(xì)胞中脂多糖(LPS)通過激活NF-κB途徑促進促炎癥因子的產(chǎn)生,而MLN4924藥物可抑制其產(chǎn)生,并減輕LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷中的腎炎癥。ZHAO等[11]發(fā)現(xiàn),在大鼠模型中XIST上調(diào)腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導(dǎo)的蛋白的表達,增加NF-κB活性,從而加劇神經(jīng)病理性疼痛。XIST通過調(diào)節(jié)Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子及NF-κB途徑減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[5]。MA等[12]提出,激活NF-κB途徑促進了XIST的表達,且XIST產(chǎn)生了一個負(fù)反饋環(huán),以調(diào)節(jié)NF-κB/淋巴細(xì)胞家族卡結(jié)構(gòu)域和熱蛋白結(jié)構(gòu)域的炎癥體途徑,從而介導(dǎo)炎癥過程。表明lncRNA XIST可能通過調(diào)控炎癥相關(guān)基因和相應(yīng)的信號通路,在炎癥性疾病中發(fā)揮促進作用。同樣在由感染引起的炎癥性疾病中發(fā)現(xiàn),lncRNA XIST發(fā)揮重要調(diào)控作用,GHAFOURI-FARD等[13]發(fā)現(xiàn),lncRNA XIST是參與膿毒癥相關(guān)并發(fā)癥的重要lncRNA之一。膿毒癥的特征是全身出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),并可導(dǎo)致急性腎損傷等。WANG等[14]提出,lncRNA XIST促進炎癥因子產(chǎn)生,并通過調(diào)控miRNA-155-5p在急性腎損傷進展中發(fā)揮調(diào)控作用。心肌損傷是膿毒癥的一種較為嚴(yán)重的并發(fā)癥,影響危重患者的生存狀態(tài),lncRNA XIST在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達上調(diào),通過體內(nèi)試驗證實lncRNA XIST通過miRNA-150-5p調(diào)控LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,抑制lncRNA XIST表達可改善心臟功能和動物存活率,減少細(xì)胞凋亡[15]。SONG等[16]提出,lncRNA XIST在膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷中發(fā)揮調(diào)控作用,lncRNA XIST在膿毒癥大鼠和LPS刺激的細(xì)胞和肺組織中表達下調(diào),lncRNA XIST低表達促進肺水腫,增加炎癥因子表達,抑制細(xì)胞活力,降低超氧化物歧化酶水平,lncRNA XIST通過靶向調(diào)控miRNA-16-5p降低膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷。LncRNA XIST與多種炎癥性疾病有關(guān),在膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷中l(wèi)ncRNA XIST高表達誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡[17]。因此 lncRNA XIST參與了感染性炎癥疾病及其并發(fā)癥的進展,可作為膿毒癥診斷和治療的生物標(biāo)志物。有研究表明,miRNA-130a-5p的失調(diào)與多種炎癥性疾病有關(guān)[18]。此外,miRNA-130a-3p在脊髓損傷(SCI)誘導(dǎo)的大鼠新蝶呤(NP)和LPS誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中明顯過度表達,抑制miRNA-130a-3p表達可激活胰島素樣生長因子1/胰島素樣生長因子1受體,從而減輕SCI誘導(dǎo)的NP[19]。然而,上述研究產(chǎn)生了不同的結(jié)果,這與miRNA-130a-5p的不同下游靶點有關(guān)。在慢性縮窄性損傷大鼠和LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的脊髓組織中miRNA-130a-5p的表達呈時間依賴性下降[20]。miRNA-130a-5p mimic的轉(zhuǎn)染提高了miRNA-130a-5p的表達,抑制了LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥[21]。在膿毒癥小鼠和膿毒癥患者的血液中miRNA-130表達降低,注射miRNA-130 mimic可降低炎癥和急性肺損傷[22]。有研究表明,LPS誘導(dǎo)細(xì)胞激活NF-κB,并抑制miRNA-130a和miR-125b,促進TNF-α的表達,增加炎癥水平[23]。在LPS刺激心肌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),lncRNA XIST 通過下調(diào) miRNA-130a-3p 并上調(diào)磷酸二酯酶4D促進心肌細(xì)胞的凋亡,抑制細(xì)胞的增殖[24]。CUI等[25]提出,膿毒癥伴血小板減少癥患者的血漿白細(xì)胞介素-18水平升高,miRNA-130a表達降低,表明miRNA-130a參與了膿毒癥相關(guān)血小板減少癥的病理生理學(xué),是一種潛在的生物標(biāo)志物。另外,利用微陣列和miRNA測序分析膿毒癥合并急性肺損傷小鼠與健康小鼠肺樣本差異表達miRNA的研究表明miRNA-130a表達明顯異常[26],與本研究結(jié)果一致。

本研究多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,膿毒性休克、SOFA評分≥7.85分、APACHEⅡ評分≥19.55分、lncRNA XIST表達水平升高、miRNA-130a表達水平降低是膿毒癥患者預(yù)后情況的獨立危險因素(P<0.05)。ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清lncRNA XIST和miRNA-130a聯(lián)合診斷AUC大于各項指標(biāo)單獨檢測,兩者聯(lián)合預(yù)測膿毒癥準(zhǔn)確度具有臨床意義。

綜上所述,本研究通過分析膿毒癥患者血清lncRNA XIST 和miRNA-130a表達差異,證實其具有預(yù)測膿毒癥發(fā)生的價值,為膿毒癥診斷提供了潛在的預(yù)后標(biāo)志物和靶點。但本研究尚存在不足之處,如臨床樣本收集困難,能夠積極配合研究的病例數(shù)較少,因此關(guān)于lncRNA XIST和miRNA-130a在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中的具體機制還需要進一步深入探討。