無菌體液標本中碳青霉烯類異質性耐藥銅綠假單胞菌的危險因素分析

賴漢瑜,岑麗蓮

肇慶市第一人民醫院檢驗科,廣東肇慶 526060

銅綠假單胞菌(Pae)是引起醫院內感染的主要條件致病菌,可引起人體多部位感染,如消化道、呼吸道、泌尿道、肺部、心臟瓣膜和手術部位感染,甚至還能引起血流感染[1-4]。Pae易對多種抗生素產生耐藥性,因此臨床治療Pae感染一直具有挑戰性[3]。亞胺培南(IPM)和美羅培南(MEM)等碳青霉烯類藥物已被廣泛用于治療嚴重感染,且對Pae表現出較強的活性[3]。有研究表明,異質性耐藥(HR)的出現可能會降低碳青霉烯類的有效性[4]。HR定義為在同一培養皿中存在具有更高抗生素耐藥性水平的亞株[5]。HR分離株通過常規藥敏試驗確定為敏感菌,當患者連續大劑量暴露于抗生素后,高水平耐藥亞群發展為優勢菌,最終導致治療失敗,甚至反復感染[6]。目前,國內外僅有少量關于描述碳青霉烯HR Pae(CHPA)分離株發病率的流行率數據,這些數據可能準確地呈現了臨床環境中HR的動態變化。本研究分析了臨床送檢無菌體液中分離的Pae中CHPA的檢出情況,以期為感染控制和指導臨床合理用藥提供參考依據,現報道如下。

1 材料與方法

1.1一般資料 (1)菌株來源:選取2020年1月至2021年12月本院臨床送檢無菌體液中非重復培養標本,剔除同一患者同一部位重復分離的菌株,分離出首次非重復Pae 139株作為研究標本。所有菌株均由Vitek2 Compact全自動微生物鑒定系統進行常規抗菌藥物敏感性測試。(2)患者臨床資料:收集患者的基本信息與臨床資料,如性別、年齡、入住科室、是否接受侵入性醫療操作(包括手術、氣管插管、胃管、尿管、引流管和胃腸鏡檢查等)及分離后是否持續或反復發生細菌感染。記錄菌株分離前、后1天內的常規生化項目,包括鉀(K)、鈉(Na)、氯(Cl)、鈣(Ca)、二氧化碳結合力(CO2CP)、肌酐(Cr)、血糖(Glu)、尿素氮(BUN),以及分離前、后1 d內的白細胞計數(WBC)、中性粒細胞計數(NEUT)、淋巴細胞計數(LYMPH)等。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會審核批準。

1.2試劑 血平板、微生物培養基(MH平板)均購自梅里埃(上海)生物制品有限公司;MEM和IPM藥敏紙片(10 μg/片)均購自英國Oxoid公司;MEM和IPM干粉均購自美國Apexbio公司。采用標準菌株CHPA ATCC27853進行質量控制,標準菌株由國家衛生健康委員會臨床檢驗中心提供。

1.3方法

1.3.1K-B紙片擴散法 所有操作均按照《臨床檢驗操作規程》第4版[7]進行。藥敏試驗結果參照美國臨床和實驗室標準協會指南(CLSI)2020年版標準判定。結果判讀時觀察抑菌圈內是否有菌落生長,根據生長情況將菌株分為3類:(1)HR為抑菌圈內有細菌生長;(2)非HR為抑菌圈內無細菌生長;(3)完全耐藥為沒有抑菌圈。

1.3.2群體譜分析(PAP)實驗 PAP實驗是確認HR表型的金標準[5]。配制 0.25～32 μg/mL共8個質量濃度梯度且含抗菌藥物的MH平板。菌株復蘇后接種于血平板37 ℃培養16～18 h后,挑取單個菌落接種于MH肉湯,37 ℃培養過夜以增菌,取50 μL菌液均勻涂布于配置好抗菌藥物的平板上,37 ℃培養24 h后進行菌落計數。對照菌株由國家衛生健康委員會臨床檢驗中心提供,為非HR的CHPA ATCC27853和完全耐藥的p2020(本實驗室分離的菌株)。

2 結 果

2.1CHPA檢出情況

2.1.1K-B法初篩 139株臨床分離的Pae中初篩結果提示存在碳青霉烯HR,主要表現為碳青霉烯類藥物藥敏試驗紙片的抑菌圈內出現了分散菌落。見圖1。

圖1 分離株對碳青霉烯HR的現象(K-B 法)

2.1.2確證試驗 使用PAP對初篩HR陽性的標本進行確證試驗。HR菌株的PAP曲線隨抗菌藥物濃度升高而降低,并在抗菌藥物濃度高于最低抑菌濃度的平板上仍可生長。非HR的CHPA ATCC27853 表現為在最低抑菌濃度附近菌落數急劇下降至無菌生長。經PAP確認,139株臨床分離株中有61株為CHPA菌株,HR率為43.88%。其中對IPM-HR檢出29株,HR率為20.86%;MEM-HR檢出19株,HR率為13.67%。同時對 MEM 和 IPM 均表現為HR的CHPA有13株,占9.35 %。見表1、圖2。

表1 CHPA檢出結果[n(%),n=139]

圖2 分離株對碳青霉烯HR的PAP 分析

2.23種分離株的臨床特征情況比較 將確證試驗中的3種分離株分別進行比較,將只對IPM產生HR、對 MEM 和 IPM 均產生HR的菌株作為IPM-HR分離株(42株),其余作為IPM-非HR分離株(97株)。將只對MEM產生HR、對MEM和IPM 均產生HR的菌株作為MEM-HR分離株(32株),其余作為MEM-非HR分離株(107株)。將對IPM和(或)MEM產生HR的菌株作為CHPA-HR分離株(61株),其余對兩種藥物都不產生HR的作為CHPA-非HR分離株(78株)。與IPM-非HR比較,IPM-HR男性、老年、侵入治療手段、多次感染比例及CO2CP測量值均更高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與MEM-非HR比較,MEM-HR 侵入治療手段、多次感染比例均更高,WBC、BUN、Cr測量值均更低,差異均有統計學意義(P<0.05)。與CHPA-非HR比較,CHPA-HR男性、侵入治療手段、多次感染比例及CO2CP測量值均更高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3種分離株的臨床特征情況比較

2.3多因素Logistic回歸分析 將上述表2中差異有統計學意義的指標進行多因素Logistic回歸分析患者感染CHPA菌株的危險因素。因變量為分離株的HR情況,自變量為侵入治療手段、多次感染、老年、男性、WBC、CO2CP、BUN、Cr。其中,WBC、CO2CP、BUN、Cr以實際測量值賦值,其余變量賦值見表3。多因素Logistic回歸分析結果顯示,侵入治療手段(OR=5.165,95%CI:1.158～23.033,P=0.031)、多次感染(OR=13.203,95%CI:3.698～47.136,P<0.001)、老年(OR=3.258,95%CI:1.054～10.076,P=0.040)和男性(OR=47.793,95%CI:4.406～518.371,P=0.001)是IPM-HR感染的獨立危險因素;而WBC升高(OR=0.848,95%CI:0.740～0.973,P=0.018)是IPM-HR感染的保護因素。多次感染(OR=3.582,95%CI:1.284～9.999,P=0.015)是MEM-HR感染的獨立危險因素。侵入治療手段(OR=16.046,95%CI:4.231～60.853,P<0.001)、多次感染(OR=14.700,95%CI:5.279～40.938,P<0.001)和男性(OR=3.312,95%CI:1.074～10.215,P=0.037)是CHPA感染的獨立危險因素;而WBC升高(OR=0.891,95%CI:0.798～0.995,P=0.041)是CHPA感染的保護因素。

表3 變量賦值

3 討 論

有研究表明,HR發生率涉及殺菌類抗生素,包括β-內酰胺類、糖肽類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類和作用于厭氧菌的硝基咪唑抗生素,且對革蘭陽性菌的HR相對多見,對于革蘭陰性菌HR的文獻報道多集中在Pae、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌等臨床常見致病菌[8-9]。HR中更具耐藥性的亞群在無抗生素培養基中連續傳5～10代后,一部分可恢復到母菌的耐藥水平且同時保留HR的特性,而其他亞群則保持其高水平的抗性[10]。這些亞群難以被傳統微生物藥敏試驗檢出,可能對細菌耐藥檢測產生很大影響,甚至影響患者預后。因此需要了解細菌HR的現狀。研究CHPA的流行情況、感染的危險因素及臨床意義對耐藥性監測和評估患者的預后至關重要。

本研究經PAP確認,139株臨床分離株中61株為 CHPA 菌株,HR率為43.88%。據文獻報道,無菌體液標本中CHPA分離株在中國西南部的檢出率可達80%以上,而廣東地區則在30%左右[11]。此外,本研究觀察到具有IPM-HR的CHPA分離株比MEM-HR更常見,這與其他地區的文獻報道結果不一致,可能與不同地區使用碳青霉烯治療嚴重感染的用藥習慣不同及碳青霉烯藥物處方增加造成的選擇壓力有關。

本研究大部分CHPA主要來源于重癥醫學科,可能是這些病區的患者基本都接受了侵入性治療并有留置管,而CHPA則是引起導管相關性細菌感染最主要的細菌之一[12]。侵入治療手段(OR=16.046,95%CI:4.231～60.853,P<0.001)是CHPA感染的獨立危險因素,也是CHPA發生的主要危險因素。侵入性操作對患者造成不同程度的損傷,人體的正常屏障受到破壞,長期置管使得CHPA更容易感染這部分患者。有創性操作的插管內壁上可檢出生物膜,而CHPA極易形成生物膜[13]。生物膜的特性表現出協同效應,延緩了抗菌劑的滲透,降低了微生物的生長速率,促進菌株中具有不同水平耐藥性亞群的出現[14]。另有研究表明,CHPA中分離的耐藥亞群比非CHPA菌株更容易形成生物膜,在CHPA的耐藥機制中,生物膜的形成與CHPA的發生具有相輔相成、互相促進的作用[4]。而CHPA來源的標本類型主要為痰,與呼吸機的應用相關。有學者指出,少數CHPA同時存在對多種抗生素HR的現象[4]。本研究結果顯示,與MEM-非HR比較,MEM-HR 侵入治療手段、多次感染比例均更高,WBC、BUN、Cr測量值均更低,差異均有統計學意義(P<0.05)。與CHPA-非HR比較,CHPA-HR男性、侵入治療手段、多次感染比例均更高,差異均有統計學意義(P<0.05)?？赡芘c患者患有慢性基礎疾病相關,患有多種基礎疾病的患者基礎情況較差、多數處于昏迷狀態或病情較重,使得這部分患者容易感染HR菌。

綜上所述,本院無菌體液分離的Pae中存在CHPA的情況。有學者指出,碳青霉烯類藥物消耗的增加與碳青霉烯HR菌株的生長呈正相關,常規推薦劑量的抗生素對HR細菌引發的感染并非最佳治療方案,若這些細菌長期處在抗生素的壓力下容易引起耐藥基因的突變而發展為多重耐藥菌,導致治療失敗,甚至感染復發[14]。因此在進行藥敏試驗時可對易感人群補充臨床常用抗菌藥物的K-B法藥敏試驗,提高CHPA檢出率;在治療過程中應合理使用抗生素,且避免長期使用一種抗生素,且盡量聯合用藥,利用協同效應達到療效,減少侵入性操作的次數、縮短置管時間等,進一步防控CHPA的感染和傳播。