黃芩苷對大鼠橫紋肌溶解綜合征導致急性腎損傷的保護作用及機制研究*

李祖攀,谷 江△, 張永春,楊清滔,劉 淼

1.貴州醫科大學附屬醫院泌尿外科,貴州貴陽 550004;2.武警貴州省總隊醫院泌尿外科,貴州貴陽 550005

多種機械或非機械原因造成的橫紋肌溶解綜合征(RM)有13.0%～50.0%會導致急性腎損傷(AKI),其病死率約為59.0%[1-2]。RM導致AKI的機制包括腎血管收縮、管型形成、肌紅蛋白過氧化損傷、炎癥及內質網應激等[3]。目前,RM導致AKI的治療方法不多,并且經典藥物治療預后較差,血漿置換或血液透析等治療經濟成本高,且只能在醫院完成治療[4]。因此,研發RM導致AKI的新型藥物成為當前該領域的研究熱點。有研究表明,Klotho基因在多種病因導致的AKI中通過抗炎、抗氧化應激、抗凋亡等表現出腎保護作用,且Klotho基因可拮抗RM導致的AKI[5-6]。黃芩苷具有較強的生物活性,具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用,并且可提高Klotho基因表達后改善糖尿病小鼠模型的AKI[7-8],但目前將黃芩苷用于RM導致AKI的研究較少見。本研究構建RM導致AKI的大鼠模型,觀察不同劑量黃芩苷對大鼠的保護作用,并探究其可能的作用機制,現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 選取健康SD雄性大鼠30只作為研究對象,體質量200～220 g。采用隨機數字表法將其分為陰性對照組、陽性對照組、黃芩苷低劑量干預組(低劑量組)、黃芩苷中劑量干預組(中劑量組)和黃芩苷高劑量干預組(高劑量組),每組6只。常規鼠餌喂養,自由進食、進水,適應性飼養1周后進行實驗干預。

1.2儀器與試劑 721分光光度計(上海躍進醫療器械有限公司);7170型全自動生化分析儀(日本日立公司);CFX96實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測儀(美國Bio-Rad公司)。黃芩苷(成都錦泰和醫藥化學技術有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術公司);丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)(南京建成生物工程研究所有限公司);Trizol試劑(賽默飛世爾科技公司);實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司);引物及逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.3方法

1.3.1模型制備與處理 動物實驗嚴格按照《實驗動物管理條例》及相關制度要求執行。經適應性飼養1周后禁食、禁水24 h。采用50.0%甘油,按10 mL/kg濃度注射大鼠雙下肢肌肉,建立RM模型。將腎組織病理檢測和腎功能檢測結果作為AKI的判斷標準。各干預組大鼠于注射甘油前20 min腹腔注射黃芩苷溶液,低、中、高劑量組注射分別為50、100、200 mg/kg。陽性對照組肌肉注射生理鹽水。陰性對照組不做任何處理。所有實驗大鼠均于藥物干預5 h后采用股動脈放血法剖殺,收集血液標本,左腎多聚甲醛固定待病理檢測,右腎液氮轉運后于-80 ℃低溫冰箱保存待用。

1.3.2血清生化指標檢測 采用全自動生化分析儀測定各組大鼠血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、肌酸激酶(CK)水平。

1.3.3腎組織病理學檢查 HE染色:將左腎組織石蠟切片脫蠟后浸入蘇木素染色10 min,經1.0%鹽酸乙醇、0.1%氨水處理后,浸入0.5%伊紅染色2 min 。漂洗、脫水、透明后,采用中性樹膠封固。

1.3.4腎組織SOD、MDA水平檢測 取 1 g 腎組織加入玻璃勻漿管中制成組織勻漿,2 500 r/min離心 10 min,取上清液,采用比色法檢測SOD、MDA水平。

1.3.5腎臟Klotho基因表達情況檢測 大鼠右腎組織研磨后進行細胞裂解,使用Trizol試劑提取總RNA,經純度檢測后,將核酸純度指示值(A260/A280)大于1.8的作為合格樣品通過逆轉錄試劑盒合成模板單鏈DNA,使用PCR檢測試劑盒進行RT-qPCR檢測過程。引物序列分別為:Klotho基因正向引物為5′-CAATGGCTTCCCTCCTTTAC-3′,反向引物為5′-AGCACAGGTTTGCGTAGTCT-3′;β-actin基因正向引物為5′-TGACGTGGACAT CCGCAAAG3′,反向引物為5′-CTGGAAGGTGGAC AGCGAGG-3′。反應條件為:95 ℃ ,1 min;92 ℃,30 s;60 ℃,30 s;74 ℃,30 s。連續循環40次,每個樣品均設置3個復孔。

2 結 果

2.1黃芩苷對RM大鼠腎組織的病理學影響 HE染色結果顯示,陰性對照組大鼠腎小管基底膜完整,上皮細胞結構清晰,無炎癥細胞浸潤。陽性對照組大鼠可見腎小管上皮細胞壞死脫落,腎小管管腔擴張,腎間質水腫,有較多的炎癥細胞浸潤。黃芩苷干預組的腎組織損傷程度與陽性對照組比較均有所減輕,炎癥細胞浸潤明顯減少,且隨著黃芩苷劑量的升高,腎組織損傷程度明顯減輕。見圖1。

注:A為陰性對照組;B為陽性對照組;C為低劑量組;D為中劑量組;E為高劑量組。

2.2黃芩苷對RM大鼠腎組織血清BUN、Cr、CK水平的影響 陽性對照組血清BUN、Cr、CK水平明顯高于陰性對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。低、中、高劑量組血清BUN、Cr、CK水平均高于陰性對照組,但明顯低于陽性對照組,且高劑量組<中劑量組<低劑量組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 黃芩苷對RM大鼠腎組織血清BUN、Cr、CK水平的影響

2.3黃芩苷對RM大鼠腎組織氧化應激指標水平的影響 陽性對照組和低、中、高劑量組血清MDA水平均明顯高于陰性對照組,而血清SOD水平均明顯低于陰性對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。與陽性對照組比較,血清MDA水平在黃芩苷低、中、高劑量組明顯下降,且高劑量組<中劑量組<低劑量組,差異均有統計學意義(P<0.05);血清SOD水平在黃芩苷低、中、高劑量組中明顯高于陽性對照組,且高劑量組>中劑量組>低劑量組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 黃芩苷對RM大鼠腎組織氧化應激指標水平的影響

2.4黃芩苷對RM大鼠腎組織Klotho基因表達的影響 RT-qPCR結果顯示,陽性對照組的Klotho基因的表達量為(1.16±0.56),明顯低于陰性對照組的(2.12±0.25),差異有統計學意義(P<0.05)。低、中、高劑量組Klotho基因表達量分別為(2.43±0.49)、(4.15±0.24)和(5.82±0.36),明顯高于陰性對照組的(2.12±0.25),且高劑量組>中劑量組>低劑量組,差異均有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

AKI作為RM的常見并發癥,病死率高且涉及的病理機制復雜,目前相關治療手段尚待優化和提高[4]。因此,研究如何拮抗RM導致的AKI具有一定的臨床意義。當前治療RM導致AKI的方法主要為經典藥物治療和腎臟替代治療,但其療效不理想,且預后較差,仍需進一步探索RM導致AKI的分子機制,為研發新的靶向藥物提供依據。

黃芩苷是黃芩中重要活性成分之一,是天然的抗氧化劑,具有明顯的抗炎功效[9]。黃芩苷中的黃酮類和多酚類可有效清除活性氧自由基,對AKI有明顯保護作用[10]。本研究實驗大鼠經雙后肢肌肉注射甘油,HE染色觀察腎組織病理學變化,同時檢測血清BUN、Cr、CK水平,構建RM導致AKI的大鼠模型。本研究結果顯示,與陽性對照組比較,低、中、高劑量組血清BUN、Cr、CK水平均明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。提示黃芩苷可改善大鼠AKI。

Klotho基因編碼的單次跨膜蛋白在診斷AKI敏感性和特異性方面優于傳統生物標志物,有望成為AKI早期診斷的新型生物標志物[11]。有研究證實Klotho是一種對AKI有保護作用的基因,可防御因缺血再灌注、氧化應激和RM等所致AKI[5]。在AKI中,腎小管上皮細胞大量壞死,機體釋放的Klotho基因可降低血清BUN、Cr水平、抑制AKI標志物與促炎癥細胞因子的表達。上調Klotho基因還可抑制腎小管上皮細胞壞死,促進腎小管細胞增殖[12]。既往有研究證實,黃芩苷可提高Klotho基因的表達,進而改善動物模型的AKI[8]。

RT-qPCR結果顯示,不同劑量黃芩苷處理RM所致AKI大鼠后, 低、中、高劑量組Klotho基因表達量分別為(2.43±0.49)、(4.15±0.24)和(5.82±0.36),明顯高于陰性對照組的(2.12±0.25),且高劑量組>中劑量組>低劑量組,差異均有統計學意義(P<0.05)。提示黃芩苷可促進Klotho基因的表達,且黃芩苷劑量越大,Klotho基因的表達越高。本次研究還發現,黃芩苷處理RM所致AKI大鼠后,與陽性對照組比較,黃芩苷干預組血清MDA水平明顯下降,且高劑量組<中劑量組<低劑量組,差異均有統計學意義(P<0.05);血清SOD水平在黃芩苷低、中、高劑量組明顯高于陽性對照組,且高劑量組>中劑量組>低劑量組,差異均有統計學意義(P<0.05)。提示黃芩苷可減輕氧化應激,且劑量越高,氧化應激減輕程度越高。

綜上所述,黃芩苷可明顯改善大鼠RM導致的AKI,其機制可能與促進Klotho基因表達和減輕氧化應激相關。但本研究仍存在局限性,如尚不能明確黃芩苷促進Klotho基因表達和減輕氧化應激的具體機制,因此,黃芩苷的長期作用效應還需要進行深入研究。