清熱養(yǎng)陰除濕湯對Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎大鼠炎癥因子的調節(jié)作用*

張陽利，張 凈，王 北，劉密鳳

（首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其主要特征為廣泛的滑膜炎導致的關節(jié)破壞，伴有關節(jié)外器官受累。本病全球患病率為0.5%～1.0%[1]。我國RA患病率為0.32%～0.38%[2]，是造成我國勞動力喪失的主要疾病之一。RA治療藥物除改善病情的抗風濕藥物（DMARDs）外，還包括非甾體抗炎藥（NSAIDs）、糖皮質激素（GCs）、生物免疫抑制劑及靶向小分子制劑等。這些藥物在臨床實踐中又有其各自的局限性[3-5]。中醫(yī)藥治療RA具有豐富的經(jīng)驗和策略，加之中醫(yī)藥具有多成分、多靶點、多途徑的作用特點，使其廣泛應用于臨床。北京中醫(yī)醫(yī)院風濕科國家級老專家王為蘭教授認為RA多因風、寒、濕邪內侵或內生濕邪，久蘊不解，化熱傷陰，灼津釀毒，熱毒濕濁瘀滯，痹阻經(jīng)隧，致成痹熱[6]。其據(jù)此創(chuàng)立清熱養(yǎng)陰除濕湯（Qingre Yangyin Chushi Decoction，QYCD），該方由半枝蓮、虎杖、金銀花、連翹等藥組成，臨床療效確切。本研究以Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎模型大鼠（collagen-induced arthritis，CIA）為研究對象，探討清熱養(yǎng)陰除濕湯對CIA模型大鼠關節(jié)損傷的保護作用及其機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 40只健康SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物有限公司。動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（京）2018-0006。SPF級動物房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22～26℃，濕度48%～52%，12 h光照周期，實驗期間自由攝食，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。動物實驗方案符合本院動物福利倫理委員會要求。所有動物實驗均按照中華人民共和國衛(wèi)生部出版的《動物護理和使用指南》（1998年1月）進行。

1.2 藥物與試劑 QYCD組方中所有飲片均購自北京杏林藥業(yè)有限責任公司，其中白花蛇舌草（批號：19060202）、金銀花（批號：19022102）、連翹（批號：18111203）、半枝蓮（批號：19070802）、虎杖（批號：19062201）、生地黃（批號：19070601）、白鮮皮（批號：19030101）、桂枝（批號：19051606）、忍冬藤（批號：19022503）、牡丹皮（批號：19050201）由北京杏林藥業(yè)有限責任公司檢驗；制川烏（批號：XE8011）由北京華邈藥業(yè)有限公司檢驗；土茯苓（批號：1805023）由北京太洋樹康中藥飲片廠檢驗。以上藥材均符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定標準。中藥湯劑由本院中藥房制劑室提供，以中藥煎煮機統(tǒng)一制成。甲氨蝶呤（MTX）（上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：H31020644）；牛Ⅱ型膠原（批號：20022）、弗氏不完全佐劑（批號：7002）均購自美國Chondrex.Inc；TGF-β ELISA檢測試劑盒（批號：DG20110D）、IFN-γ ELISA檢測試劑盒（批號：DG20066D）、IL-4 ELISA檢測試劑盒（批號：DG94488Q）和IL-17 ELISA檢測試劑盒（批號：DG94480Q）均購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司；TRNzol總RNA提取試劑（批號：DP405-02）購自天根生化科技北京有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Erase（r批號：RR047B）、SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）ROX plus（批號：RR82LR）和DL2000 DNA Marker（批號：3427Q）均購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；PCR引物由美國英杰生命技術有限（Invitrogen）公司合成。

1.3 主要儀器 FS-1/DQ-3型勻漿機（金壇區(qū)西城基銘實驗儀器廠）；ME204T型梅特勒托勒多電子天平（Merrler Toledo上海有限公司）；Centrifuge 5415D型高速臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；88400V Thermo型超低溫保存冰箱（日本SANYO公司）；Rayto RT-6100型酶標分析儀（美國Rayto公司）；SKYSCAN 1276型micro-CT檢測儀（德國Bruker公司）；NANODROP 2000型分光光度計（Therno scientific公司）；ABI7500型熒光定量PCR檢測儀（Applied Biosystems公司）；IM-15型制冰機（常熟市雪科電器有限公司）。

2 方 法

2.1 大鼠膠原誘導性關節(jié)炎（CIA）模型的建立和評估 參照文獻[7]建立大鼠CIA模型。將等體積的牛Ⅱ型膠原溶液和不完全弗氏佐劑充分混勻制備成濃度為1 mg/mL的乳劑，備用。每只大鼠尾部皮下注射0.2 mL乳劑進行初次免疫，7 d后再次注射0.1 mL乳劑加強免疫。正常對照組大鼠注射等量生理鹽水。大鼠致敏后第7天開始，每周進行1次關節(jié)炎指數(shù)評價。按5級評分方法[7]計算關節(jié)炎評分。0分：正常；1分：小趾紅腫；2分：趾關節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關節(jié)以下足爪腫脹；4分：包括踝關節(jié)在內的全部足爪腫脹。將各個關節(jié)的積分累計得出每只大鼠的關節(jié)炎指數(shù)。關節(jié)炎指數(shù)越高，說明關節(jié)炎病變程度越重。首次免疫后第14天，關節(jié)炎評分≥4分的大鼠視為造模成功。

2.2 動物分組及干預 將24只造模成功的大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組（CIA組）、甲氨蝶呤組（MTX組）、清熱養(yǎng)陰除濕湯高劑量組（QYCD-H組）、清熱養(yǎng)陰除濕湯低劑量組（QYCD-L組），每組6只。另隨機取6只未造模大鼠作為正常對照組（Control組）。參照文獻[8]，大鼠與人換算系數(shù)為6.17，以成人體質量約為60 kg計算大鼠臨床等效劑量。Control組和CIA組大鼠分別給予等量生理鹽水；QYCD-L組、QYCD-H組劑量分別為臨床等效劑量（17 g/kg）和2倍臨床等效劑量（34 g/kg）。MTX組為臨床等效劑量（0.625 mg/kg）。除MTX組大鼠每周給藥2次外，其余各組大鼠每天給藥1次。所有大鼠均灌胃給藥，給藥體積為10 mL/kg。每周觀察大鼠的生存狀態(tài)并記錄體質量。藥物干預5周后用1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min收集血清，-80 ℃保存待測。取血后處死大鼠，剪取大鼠后肢踝、趾關節(jié)，置于中性福爾馬林固定，用于制作病理切片。另一側踝關節(jié)及后爪用于骨微觀結構變化的檢測。

2.3 觀察指標

2.3.1 足跖腫脹度檢測 大鼠致敏后第7、14、21、28、35、42、49天，使用足跖容積測量儀檢測大鼠右后足跖容積并記錄。

2.3.2 關節(jié)炎評分 大鼠致敏后第7、14、21、28、35、42、49天按照“2.1”中按5級評分方法[7]計算各組大鼠關節(jié)炎評分。

2.3.3 關節(jié)病理組織學分析 將后肢固定在4%甲醛液，并在10%乙二胺四乙酸（EDTA）中脫鈣4周，進行乙醇梯度脫水（70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ液及100%Ⅱ液）。二甲苯透明，石蠟包埋。制備成5 μm厚的石蠟切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度（從高到低）脫水，蘇木精和伊紅法（hematoxylin-eosin staining,HE）染色。顯微鏡下觀察大鼠踝關節(jié)組織病理形態(tài)學改變，并對滑膜炎癥、關節(jié)軟骨侵蝕和軟骨下骨侵蝕程度進行半定量評分[9]。（1）滑膜炎癥分級評分。0分：正常滑膜，1～2層滑膜細胞，無炎癥細胞浸潤；1分：3～5層滑膜細胞，輕度炎癥細胞浸潤，細胞密度低；2分：多層滑膜細胞，中度炎癥細胞浸潤，細胞密度增高；3分：全關節(jié)腔重度炎癥細胞浸潤，滑膜增生，細胞密度高。（2）軟骨侵蝕評分。0級：正常軟骨，關節(jié)軟骨表面光滑；1分：淺表非鈣化軟骨層輕微變粗糙或輕度缺失，約占軟骨面積的1/3；2分：中等程度的淺表非鈣質軟骨損失，約占軟骨面積的2/3；3分：淺表非鈣化軟骨完全喪失，椎管延伸至下面的鈣化軟骨層。（3）骨侵蝕評分。0分：正常完整骨表面；1分：皮質骨表面小的局灶性骨病變；2分：局灶性、軟骨下骨侵蝕增強，皮質骨部分或完全穿透，皮質骨可能有少量突破至骨髓腔；3分：骨組織大面積擴展延伸性侵蝕，滑膜血管翳侵入導致皮質骨完全突破到骨髓腔，骨結構喪失。

2.3.4 關節(jié)形態(tài)計量學指標 固定大鼠后肢，采用微計算機斷層掃描技術（Micro computed tomography，Micro-CT）檢測關節(jié)形態(tài)計量學指標。將踝關節(jié)置于Micro-CT的測試管內，沿標本長軸進行掃描，以獲取連續(xù)的圖像。Siemens Inveon Micro-CT掃描參數(shù)：圖像矩陣為4 096×4 096，層間距為28.6 μm，源電壓為70 kV，電流為400 μA，掃描時間為432 s，360°范圍內旋轉掃描。Micro-CT掃描結束后進行重建，進行閾值分割獲取大鼠骨骼三維圖像并保存，使用Micro-CT自帶的軟件進行定量分析，分析骨體積（bone volume, BV）、骨表面積和骨體積的比值（bone surface/bone volume, BS/BV）、骨密度（bone mineral density, BMD）和骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）等骨損傷程度及骨形態(tài)參數(shù)。

2.3.5 血清炎癥細胞因子 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒分析外周血中IL-4、IL-17A、TGF-β、IFN-γ表達。按照試劑盒說明書進行操作，酶標儀檢測450 nm處吸光度值，然后參考標準曲線計算血清濃度。IL-4、IL-17、TGF-β和IFN-γ的最高檢測濃度分別為120、48、240、2 000 pg/mL。

2.3.6 脾臟組織T-bet mRNA、Gata-3 mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達 Trizol法提取脾臟細胞總RNA，NanoDropRND-2000測定RNA濃度和純度。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉錄；TakaRa SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒檢測組織相關基因表達量。上述實驗操作均按產(chǎn)品說明書要求進行。以總RNA為模板合成cDNA，進行PCR反應。擴增條件：95 ℃，30 s；40個PCR循環(huán)（95 ℃，5 s；60 ℃，40 s）。為建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應結束后，按（95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s），并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃。各樣品的目的基因和內參分別進行Realtime PCR反應，每個樣本檢測3個復孔。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法計算各mRNA相對表達量。

表1 引物序列

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料符合正態(tài)分布且方差齊，以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法或Tamhane法進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 各組大鼠踝關節(jié)病理改變比較 關節(jié)癥狀一般自后足首發(fā)，逐漸蔓延至前足，癥狀呈進行性加重，在初次免疫后7 d左右出現(xiàn)雙足明顯腫脹。初次免疫后3～5周出現(xiàn)腫脹高峰，逐漸出現(xiàn)關節(jié)強直、畸形以至功能障礙，提示有慢性、對稱性、多發(fā)性關節(jié)炎發(fā)生。Control組大鼠關節(jié)結構正常，滑膜組織無充血水腫，襯覆1～2層滑膜細胞，無炎癥細胞浸潤，無血管擴張充血，無血管翳，關節(jié)軟骨表面光滑平整。CIA組大鼠可見不同程度的滑膜細胞增生，并可見炎癥細胞浸潤；增生的滑膜組織形成絨毛狀，向軟骨面爬行形成血管翳。MTX、QYCD-L、QYCD-H治療對骨質侵蝕和血管翳的形成有明顯抑制作用，明顯改善炎癥、滑膜細胞增殖和細胞浸潤，對踝關節(jié)病理具有明顯的改善作用。（見圖1）致炎3周后，CIA組大鼠右后足關節(jié)腫脹程度高于Control組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MTX、QYCD-L、QYCD-H治療可以緩解大鼠足關節(jié)的腫脹程度（P＜0.05）。CIA組在致炎后5周關節(jié)炎評分最高（P＜0.05），MTX組、QYCD-L組、QYCD-H組致炎后4周關節(jié)炎評分最高，并于4周后其腫脹程度有所緩解，其中MTX效果最好（P＜0.05）。CIA組大鼠HE評分明顯高于Control組（P＜0.01）；MTX組、QYCD-L組、QYCD-H組大鼠HE評分均低于CIA組（P＜0.05或P＜0.01），表明MTX、QYCD-L、QYCD-H治療對減緩踝關節(jié)病理改變具有一定的積極作用。（見圖2）

圖1 大鼠踝關節(jié)典型病理切片 （HE 染色）

圖2 各組爪體積、關節(jié)炎評分、HE 評分比較 （±s）

3.2 各組大鼠顯微CT指標BV、BS/BV、BMD、Tb.Th比較 Control組大鼠關節(jié)表面光滑沒有骨侵蝕現(xiàn)象。CIA組大鼠出現(xiàn)了嚴重的軟骨和骨質破壞，關節(jié)表面不光滑，具有嚴重的骨侵蝕現(xiàn)象。MTX具有很好的保護作用，MTX組大鼠關節(jié)破壞程度最輕。QYCD具有一定的保護作用，QYCD-L組、QYCD-H組大鼠的骨破壞程度在一定程度上被緩解，關節(jié)較為完整，只有輕微的骨質缺失。表明QYCD對CIA模型大鼠關節(jié)損傷具有一定的保護作用。（見圖3）

圖3 大鼠右爪顯微CT 檢查代表性圖像

CIA組大鼠BV和BS/BV值均明顯高于Control組（P＜0.01），BMD和Tb.Th值均明顯低于Control組（P＜0.01）。MTX組、QYCD-L組、QYCD-H組大鼠BV值均顯著低于CIA組（P＜0.01），BMD值顯著高于CIA組（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖4）

圖4 各組大鼠顯微CT 指標BV、BS/BV、BMD、Tb.Th 比較 （±s）

3.3 各組大鼠血清細胞因子IL-4、IL-17A、TGF-β、IFN-γ水平比較 CIA組大鼠血清促炎因子IL-17A、IFN-γ的水平均高于Control組（P＜0.01），血清抗炎因子IL-4、TGF-β的水平均低于Control組（P＜0.01）；MTX組、QYCD-L組、QYCD-H組大鼠血清IL-17A水平均低于CIA組（P＜0.01），MTX組和QYCD-H組大鼠血清IFN-γ水平均低于CIA組（P＜0.05或P＜0.01）；MTX組、QYCD-L組、QYCD-H組大鼠血清IL-4、TGF-β水平均高于CIA組（P＜0.01）。表明MTX、QYCD均可以抑制炎癥，且以MTX對炎癥反應的抑制作用最強。（見圖5）

圖5 各組大鼠血清IL-4、IL-17A、TGF-β、IFN-γ 水平比較 （±s）

3.4 各組大鼠脾臟組織T-bet mRNA、Gata-3 mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達比較 CIA組大鼠脾臟T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對表達量均顯著低于Control組（P＜0.01）；MTX組大鼠脾臟上述4項指標表達水平均顯著高于CIA組（P＜0.01）；QYCD-L組、QYCD-H組大鼠脾臟T-bet mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA 相對表達量均高于CIA組（P＜0.05或P＜0.01）；QYCD-L組、QYCD-H組大鼠脾臟Gata-3 mRNA相對表達量與CIA組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖6）

圖6 各組大鼠脾臟細胞特異性轉錄因子Gata-3 mRNA、T-bet mRNA、Foxp3 mRNA 和RORγt mRNA 表達水平比較 （±s）

4 討 論

中醫(yī)學認為RA屬于“痹證”范疇，其病因多為氣血虧虛，風、寒、濕、熱之邪外襲，痰瘀互結，痹阻經(jīng)絡。如《素問·痹論篇》所言：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。”[10]其病因主要為風、寒、濕三邪所致。《素問·刺法論篇》指出：“正氣存內，邪不可干”[11]。《素問·評熱病論篇》指出：“邪之所湊，其氣必虛。”[11]又如《濟生方·諸痹門》[12]曰：“皆因體虛腠理空疏，受風寒濕氣而成痹也。”指出正虛是該病發(fā)病的內因。QYCD中白花蛇舌草、半枝蓮、虎杖、銀花、連翹為君藥，既可清熱解毒于內，又可透邪達表于外，兼有消腫止痛之功效。土茯苓、白鮮皮、生地黃、熟地黃、白芍為臣藥。其中土茯苓、白鮮皮二藥合用祛內毒解外邪，可起到清熱解毒除濕之功效。熱邪內郁久必傷陰，故以生地黃、熟地黃、白芍養(yǎng)陰血補腎精。桂枝、川烏為佐藥。二藥性辛溫通以防苦寒太過，且溫經(jīng)通絡止痛。忍冬藤為使藥，清熱解毒，疏通經(jīng)絡。全方共奏清熱解毒、通絡止痛之功效[13]。

RA是一種以周圍關節(jié)病變?yōu)橹鞯亩嘞到y(tǒng)炎癥性自身免疫疾病，其中Th細胞亞群失衡及相關細胞因子網(wǎng)絡和“瀑布效應”異常是其發(fā)病的重要機制[14-15]。衰老的CD4+T細胞聚集是RA的一個重要標志[16]。幼稚的CD4+T細胞在不同的刺激模式、抗原濃度和細胞因子環(huán)境下分化為不同的細胞亞群[17]。Th1/Th2和Th17/Treg細胞亞群的失衡在RA的發(fā)病和進展中起重要作用，與RA疾病活動和骨侵蝕有關，且相關細胞因子水平的變化可能是其主要原因[18]。Th1/Th2細胞的平衡被認為是由其特異性轉錄因子T-bet/GATA-3的表達比例決定的，對于誘導自身免疫和過敏性免疫反應具有重要作用[19]。Th1/Th2細胞失衡可誘導自身免疫疾病，包括RA、糖尿病及克羅恩病等。隨著認識的深入，Th1/Th2失衡已無法解釋RA的部分病變[20-21]，提示RA疾病進展中可能還存在著其他重要的機制。相關研究也由Th1/Th2模式逐漸轉變?yōu)門h1/Th2/Th17/Treg假說，即來自同一Th前體細胞的多譜系分化模式[22-23]。Thl7/Treg失衡及其相關細胞因子的異常表達與包括RA在內的多種自身免疫性疾病的發(fā)病及病理損傷密切相關。IL-17是Th17細胞分泌的主要細胞因子，可誘導滑膜細胞產(chǎn)生金屬蛋白酶，抑制軟骨基質形成，促進滑膜血管翳形成，加重關節(jié)破壞[24-26]。此外，IL-17還可以刺激患者滑膜細胞產(chǎn)生GM-CSF和PGE2[27]，上調IL-6[28-29]、IL-1β、TNF-α[28]等局部炎癥介質協(xié)同作用[30]，并誘導核因子κB受體活化劑配體（receptor activator of the nuclear factor kappa B ligand, RANKL）的表達，在破骨細胞形成和骨溶解吸收中充當著重要角色[25]。研究發(fā)現(xiàn)Treg細胞表面高表達抑制性輔助因子細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTAL-4），可抑制效應細胞功能，并分泌IL-10、TGF-β、IL-2等抑制性細胞因子，從而發(fā)揮免疫抑制作用[31-34]。Treg細胞已成為RA發(fā)病機制新模式中的核心成員之一，且這一模式強調了Treg和Th17之間的平衡[35-37]。

本研究結果表明，給予QYCD-L、QYCD-H處理均可降低CIA大鼠血清促炎因子IFN-γ和IL-17A水平，提高抗炎因子IL-4和TGF-β水平。對炎癥細胞因子的調節(jié)可能成為RA治療的重要靶點。QYCD治療RA的可能機制之一是通過調節(jié)炎癥細胞因子對RA發(fā)揮保護作用。QYCD-L、QYCD-H處理對CIA大鼠脾臟T-bet mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達下降均有不同程度的緩解，但對RA患者Foxp3/RORγt比值變化無明顯影響，與TADA Y等[38]報道的藥物治療與其比值變化無明確相關性相一致。代謝組學研究[39]顯示，QYCD對L-蘋果酸、抗壞血酸、L-絲氨酸3種差異代謝物及紊亂的甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路均有回調趨勢，提示其可能通過調節(jié)異常的能量代謝過程和抗氧化應激來減輕炎癥反應。

綜上所述，清熱養(yǎng)陰除濕湯能有效改善CIA大鼠關節(jié)炎癥狀，調節(jié)炎癥細胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-4和TGF-β水平及轉錄因子T-bet mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達。更多作用機制有待進一步的深入研究。