基于miR-128-3p/SIRT1/自噬探討虎杖苷促進糖尿病潰瘍模型大鼠創(chuàng)面愈合的機制*

童海江，周愷驊，王亞玲，孫海燕，王社梁，夏偉仁

（紹興第二醫(yī)院，浙江 紹興 312000）

長期高血糖會促進炎癥細胞因子和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的表達，進而抑制血管生成。這會引起足部傷口不受控制的感染，引起糖尿病（diabetes mellitus，DM）足潰瘍（diabetic foot ulceration，DFU）[1]。DM患者終身患有DFU的概率高達15%，也是成年人截肢的主要因素[2]。細胞的自噬可將受損的蛋白質(zhì)和細胞器運輸?shù)饺苊阁w進行降解，從而減少ROS的生成，是細胞在高糖等壓力環(huán)境下自我保護的方式。研究發(fā)現(xiàn)自噬可以緩解DFU，促進傷口愈合[3]。微小RNA（micorRNA，miR）是內(nèi)源的小型非編碼RNA，可通過與目標mRNA的3'非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3'-UTR）堿基-堿基互補配對來抑制基因表達。研究表明mi-128可通過靶向抑制下游Sirtuin（SIRT1）蛋白的表達調(diào)控自噬[4-5]。虎杖苷是從虎杖中分離的天然羥基-二苯基乙烯化合物，研究顯示其可通過調(diào)節(jié)STIR加速蛋白發(fā)揮抗氧化和抗炎的作用[6]。虎杖苷可通過調(diào)控自噬保護心肌細胞免受心肌梗死損傷[7]。本研究主要基于miR-128-3p/SIRT1探討虎杖苷對DFU模型大鼠創(chuàng)面愈合和自噬水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級的Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，12周齡，體質(zhì)量220～250 g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006。所有大鼠飼養(yǎng)溫度為22～24 ℃，濕度為40%～60%，均飼養(yǎng)在光照12 h/黑暗12 h的環(huán)境中。實驗過程完全遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》，并通過紹興第二醫(yī)院倫理委員會審核批準，倫理批號：2020031。

1.2 藥物與試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma公司，批號：20190217）；HE染色試劑盒（北京Solarbio公司，批號：20211207）；RNAspin Mini試劑盒（美國GE Healthcare，批號：217004）；Bestar qPCR RT（批號：2020665）和BestarTMqPCR試劑盒（批號：2020890）均購自德國DBI Bioscience公司；一抗anti-GAPDH（批號：ab9485）、anti-LC3Ⅰ（批號：ab232463）、anti-LC3Ⅱ（批號：ab232940）、anti-Beclin1（批號：ab207612）、anti-SIRT1（批號：ab110304）和山羊抗兔HRP-IgG二抗（批號：ab205718）均購自美國Abcam公司；ECL化學發(fā)光底物（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：RMO0021）；大鼠內(nèi)皮祖細胞（美國ATCC公司，批號：BH0015）；專用培養(yǎng)基（美國Gibco，批號：2177684）；hsa-miR-128-3p、NC mimics、雙熒光報告基因載體h-SIRT1-3UTR-wt和雙熒光報告基因載體h-SIRT1-3UTR-mu均由上海漢恒生物科技公司合成。Lipofectamine 2000（加拿大Invitrogen公司，批號：11668019）；雙熒光素酶報告試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司，批號：E60800）。

1.3 主要儀器 Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)（美國Santa公司）；Leica DM2500光學顯微鏡、Leica RM2235組織包埋機均購自美國Leica Microsystems公司；KH20R高速冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；Invitrogen Qubit Flex定量PCR儀（美國Thermo Fisher公司）；干式生化分析儀-Compass2000（江蘇康尚生物醫(yī)療科技有限公司）；Invitrogen iBright凝膠成像系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）。

1.4 造模與分組 將45只大鼠連續(xù)4周給予高脂高糖飲食，然后根據(jù)參考文獻通過腹腔內(nèi)注射STZ（70 mg/kg）建立DM模型[8]。在STZ注射后第3天檢測尾靜脈血中血糖水平，血糖高于16.7 mmol/L表明模型建立成功。本研究建模成功率為80%（36/45）。隨機選擇30只建模成功的大鼠，隨機分為模型組（n=15）和虎杖苷組（n=15）。另取15只健康大鼠作為對照組，給予連續(xù)4周的正常飲食后，禁食12 h，再通過腹腔注射生理鹽水（70 mg/kg）。參考文獻方法建立DM傷口愈合的模型[8]。3組大鼠均腹腔注射10%水合氯醛溶液進行麻醉（350 mg/kg），隨后用脫毛膏脫去除大鼠背部的毛，75%的酒精進行消毒，然后切除圓形范圍為1 cm×1 cm的皮膚。

1.5 實驗給藥 虎杖苷組大鼠予虎杖苷灌胃，劑量為40mg/kg[9]，1次/d，持續(xù)給藥10 d。模型組、對照組作為自然愈合組不給藥處理。

1.6 觀察指標

1.6.1 傷口愈合評估 每天觀察并測量傷口大小，在第5天和第10天拍照并計算傷口面積及傷口愈合率。傷口面積采用最大長寬法進行測量與計算。測量傷口邊到邊的最大長度和與長徑相垂直的最大寬度，長與寬相乘得出傷口估算面積。傷口愈合率=[（初始傷口面積-最終傷口面積）/初始傷口面積]×100%。

1.6.2 組織病理學觀察 大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥溶液進行麻醉（40 mg/kg），隨后收集愈合邊緣組織。用4%的多聚甲醛將愈合邊緣組織固定，脫水、包埋后切片（4 μm）。用蘇木精在室溫下染色10 min，然后用0.5%的伊紅室溫下染色3 min，顯微鏡（×200）下進行組織病理學觀察。

1.6.3 創(chuàng)面組織SOD和MDA水平 取大鼠創(chuàng)面組織，消毒后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｈ∵m量組織，剪碎后加入生理鹽水，在冰水浴中進行勻漿，制作成質(zhì)量濃度10%的組織勻漿液。2000r/min下低溫（4 ℃）離心20 min（離心半徑為13.5 cm），收集上清液，分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｈ〈郎y組織勻漿上清液，采用ELISA試劑盒檢測組織勻漿上清液中SOD和MDA水平。

1.6.4 創(chuàng)面組織SIRT1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表達水平收集各組愈合邊緣組織中總蛋白，每份樣本中取出總量為40 μg的總蛋白電泳分離（80～120 V，90 min）。通過濕法將分離的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜（100 mV）。在5%牛血清白蛋白中于室溫孵育1 h。將膜與1∶500稀釋的一抗anti-LC3Ⅰ、anti-LC3Ⅱ、anti-Beclin1、anti-SIRT1在4 ℃下孵育過夜。洗滌后在室溫下添加HRP標記的二抗孵育1 h。然后加入化學發(fā)光試劑進行顯影。使用Image J軟件分析目標蛋白的灰度值。GAPDH作為內(nèi)參，通過灰度值分析目標蛋白與GAPDH的比值來分析表達水平。

1.6.5 創(chuàng)面組織miR-128-3p、SIRT1 mRNA表達水平 使用RNAspin Mini試劑盒從愈合邊緣組織中提取RNA，然后使用Bestar qPCR試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA。條件如下：37 ℃，15 min；98 ℃，5 min。然后使用BestarTMqPCR預混液進行qPCR實驗。條件如下：95 ℃，2 min；94 ℃，20 s；58 ℃，20 s；72 ℃，20 s。40個循環(huán)，最后在72 ℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析。U6和GAPDH分別作為miR-128-3p和SIRT1 mRNA的內(nèi)參，通過比較循環(huán)閾值評估相對表達水平。引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列

1.7 miR-128-3p靶向SIRT1的驗證 通過雙熒光素酶報告在大鼠內(nèi)皮祖細胞中驗證miR-128-3p靶向抑制SIRT1。首先根據(jù)Targetscan預測miR-128-3p與SIRT1 mRNA的3'-UTR的互補位點，將野生型（wt）和突變型（mut）的3'-UTR克隆到pmiR熒光基因中，分別命名為pmiR-wt-SIRT1和pmiR-mut-SIRT1。然后分別將miR-128-3p（50 pmol/mL）或miR-NC（50 pmol/mL）轉(zhuǎn)染到細胞中，將pmiR-wt-SIRT1和pmiR-mut-SIRT1轉(zhuǎn)染到細胞中。分組：pmiR-wt-SIRT1+miR-NC組、pmiR-wt-SIRT1+miR-128-3p組、pmiR-mut-SIRT1+miR-NC組、pmiR-mut-SIRT1+miR-128-3p組。轉(zhuǎn)染體系（96孔板，每組3個復孔）：3 μL siRNA（100 nmol/L）、15 μL質(zhì)粒（40 ng/μL）分別稀釋于180 μL無血清高糖培養(yǎng)基，6 μL Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑稀釋于450 μL無血清高糖培養(yǎng)基，室溫靜置5 min后，按分組及與轉(zhuǎn)染試劑混合繼續(xù)靜置15 min。將上述復合物加入細胞培養(yǎng)基中并混勻。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行雙熒光素酶檢測。

通過雙熒光素酶報告試劑盒檢測相對熒光素酶活性。當miR-128-3p與SIRT1 mRNA結(jié)合后，熒光素酶活性會降低。然后通過熒光定量PCR檢測miR-128-3p、SIRT1 mRNA表達水平，通過Western blotting檢測SIRT1蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 26和GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件對數(shù)值進行統(tǒng)計分析處理。對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，多組數(shù)據(jù)均數(shù)的比較用ONE-WAY-ANOVA檢驗，兩兩比較采用SNK-q檢驗。兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠傷口愈合情況比較 第5天，模型組、虎杖苷組大鼠傷口愈合率低于對照組（P＜0.05）；第10天，對照組大鼠傷口基本愈合，而模型組大鼠出現(xiàn)潰瘍且傷口愈合停滯；第10天，虎杖苷組大鼠傷口愈合率高于模型組（P＜0.05），低于對照組（P＜0.05）。（見圖1、表2）

圖1 大鼠傷口愈合情況

表2 3 組大鼠傷口愈合率比較 （±s，%）

表2 3 組大鼠傷口愈合率比較 （±s，%）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別 n 給藥劑量/（mg/kg） 第5天 第10天對照組 15 - 49.25±5.64a 70.43±7.81a b模型組 15 - 51.41±6.42a 53.67±7.08a虎杖苷組 15 40 61.36±4.90 84.92±7.32 F 18.918 65.336 P 0.000 0.000

2.2 大鼠傷口愈合的組織學情況 圖2中紅色為細胞質(zhì)，藍色為細胞核。對照組有大量的成纖維細胞樣細胞及較多的肉芽組織和瘢痕組織；模型組見大量炎癥細胞浸潤，膠原沉積松散，排列不規(guī)則，傷口恢復情況較對照組差；虎杖苷組有較明顯的肉芽組織和瘢痕組織，提示傷口愈合情況較模型組好。

圖2 大鼠傷口愈合的組織學情況 （HE，×200）

2.3 3組大鼠創(chuàng)面組織中氧化應激水平比較 模型組大鼠創(chuàng)面組織中SOD水平低于對照組（P＜0.05），MDA水平高于對照組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中SOD水平高于模型組（P＜0.05），MDA水平低于模型組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中SOD水平低于對照組（P＜0.05），MDA水平高于對照組（P＜0.05）。（見表3）

表3 3 組大鼠創(chuàng)面組織中SOD 和MDA 水平比較 （±s）

表3 3 組大鼠創(chuàng)面組織中SOD 和MDA 水平比較 （±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別 n 給藥劑量/（mg/kg） SOD/（nmol/mg） MDA/（U/mg）對照組 15 - 184.93±15.74 7.54±0.94模型組 15 - 87.46±9.05a 23.17±2.21a虎杖苷組 15 40 150.72±15.78a b 12.85±1.43a b F 185.945 355.746 P 0.000 0.000

2.4 3組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p、SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表達水平比較 模型組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p高于對照組（P＜0.05），SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白相對表達量低于對照組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p低于模型組（P＜0.05），SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白相對表達量高于模型組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p高于對照組（P＜0.05），SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白相對表達量低于對照組（P＜0.05）。（見圖3、表4）

圖3 3 組大鼠創(chuàng)面組織中SIRT1 蛋白表達Western blotting 圖

表4 3 組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p、SIRT1 mRNA 和SIRT1 蛋白表達量比較 （±s）

表4 3 組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p、SIRT1 mRNA 和SIRT1 蛋白表達量比較 （±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別 n 給藥劑量/（mg/kg） miR-128-3p SIRT1 mRNA SIRT1蛋白對照組 15 - 0.89±0.07 4.97±0.42 3.28±0.29模型組 15 - 3.62±0.32a 1.35±0.11a 0.94±0.07a虎杖苷組 15 40 1.56±0.11a b 3.06±0.24a b 2.15±0.18a b F 745.949 586.327 496.335 P 0.000 0.000 0.000

2.5 3組大鼠創(chuàng)面組織中自噬標志蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin1表達水平比較 模型組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達量及LC3Ⅱ/Ⅰ均低于對照組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達量及LC3Ⅱ/Ⅰ均高于模型組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達量及LC3Ⅱ/Ⅰ均低于對照組（P＜0.05）。（見圖4、表5）

圖4 3 組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin1 蛋白表達Western blotting 圖

表5 3 組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ和Beclin1 蛋白相對表達量及LC3Ⅱ/Ⅰ比較 （±s）

表5 3 組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ和Beclin1 蛋白相對表達量及LC3Ⅱ/Ⅰ比較 （±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別 n 給藥劑量/（mg/kg） LC3Ⅱ Beclin1 LC3Ⅱ/Ⅰ對照組 15 - 2.45±0.21 1.87±0.15 1.95±0.13模型組 15 - 0.87±0.08a 0.81±0.07a 1.12±0.1a虎杖苷組 15 40 1.94±0.17a b 1.43±0.12a b 1.54±0.21a b F 360.331 298.526 106.736 P 0.000 0.000 0.000

2.6 miR-128-3p與SIRT1靶向結(jié)合的驗證 通過雙熒光素酶報告在內(nèi)皮祖細胞中驗證miR-128-3p靶向SIRT1。miR-128-3p與SIRT1靶向結(jié)合位點見表6。同時轉(zhuǎn)染miR-128-3p mimic和pmiR-wt-SIRT1后祖細胞中相對熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），提示miR-128-3p可以與SIRT1靶向結(jié)合。（見表7）

表6 miR-128-3p 與SIRT1 靶向結(jié)合位點

表7 各組細胞中相對熒光素酶活性比較 （±s）

表7 各組細胞中相對熒光素酶活性比較 （±s）

注：與miR-128-3p NC組比較，aP＜0.05；與pmiR-mut-SIRT1組比較，bP＜0.05。

組別 n miR-128-3p NC miR-128-3p mimic pmiR-wt-SIRT1 5 1.00±0.08 0.23±0.03a b pmiR-mut-SIRT1 5 0.99±0.10 1.04±0.11 t 0.015 126.173 P 0.890 0.000

2.7 miR-128-3p對SIRT1的抑制作用 為進一步分析驗證miR-128-3p能夠靶向抑制SIRT1的表達，通過轉(zhuǎn)染miR-128-3p mimic 質(zhì) 粒 過 表 達miR-128-3p。miR-128-3p mimic 組miR-128-3p水平高于miR-128-3p NC組（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染實驗成功。miR-128-3p mimic組SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白相對表達量低于miR-128-3p NC組（P＜0.05）。（見圖5、表8）

圖5 過表達miR-128-3p 內(nèi)皮祖細胞中SIRT1 蛋白Western blotting 圖

表8 各組內(nèi)皮祖細胞中miR-128-3p、SIRT1 mRNA 和SIRT1 蛋白相對表達量比較 （±s）

表8 各組內(nèi)皮祖細胞中miR-128-3p、SIRT1 mRNA 和SIRT1 蛋白相對表達量比較 （±s）

注：與miR-128-3p NC組比較，aP＜0.05。

組別 n miR-128-3p SIRT1 mRNA SIRT1蛋白miR-128-3p NC 5 1.07±0.07 4.35±0.38 2.67±0.24 miR-128-3p mimic 5 5.68±0.48a 1.14±0.09a 0.61±0.05a t 225.798 168.920 176.522 P 0.000 0.000 0.000

3 討 論

DM患者約占世界人口的9.5%，由于人們愈加不良的飲食習慣，預計到2030年，糖尿病的發(fā)病率將增加50%以上[10]。DFU是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，由神經(jīng)和血管生成受損、慢性低度炎癥等引起的足部傷口感染不受控制引起的。DM患者傷口愈合較慢而引起DFU，但是目前尚無治療DFU的方法，目前臨床治療DFU的方法以控制血糖、延緩病情進展為主[11]。高糖微環(huán)境會引起細胞氧化應激損傷，這不但會影響細胞新生，還會導致血管生成抑制和不受控制的炎癥反應，進而引起潰瘍和不良的傷口愈合[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)自噬可將細胞內(nèi)的ROS和炎癥相關蛋白運送至溶酶體溶解，并且可通過細胞內(nèi)代謝維持細胞活力，減少細胞凋亡，進而促進傷口愈合[13]。臨床研究顯示誘導自噬在促進傷口愈合中具有關鍵作用[14]。

虎杖苷為白藜蘆醇葡萄糖苷，具有抗氧化應激、抗炎等生物學活性[15]。研究顯示積雪草苷可通過提高人黑素細胞內(nèi)的自噬通量減少ROS的生成，進而保護細胞免受過氧化氫引起的氧化應激損傷[16]。WANG C G等[17]研究顯示激活內(nèi)皮祖細胞中自噬可促進SOD并抑制MDA，進而加速傷口愈合。曹媛媛等[18]研究表明虎杖苷可通過激活細胞內(nèi)的自噬水平，緩解肺泡上皮細胞氧化應激損傷。體外研究顯示虎杖苷可通過誘導自噬緩解阿爾茨海默病模型細胞的損傷[19]。也有研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷可通過誘導自噬緩解氧化應激水平，進而提高腎小球足細胞對高糖環(huán)境的抵抗性[20]。這提示虎杖苷可通過促進傷口組織的自噬水平緩解高糖引起的氧化應激反應，進而促進DM模型大鼠的傷口愈合。本研究結(jié)果顯示虎杖苷可緩解DM模型大鼠的傷口潰瘍并促進組織修復。模型組SOD低于對照組，而MDA高于對照組；虎杖苷組SOD水平高于模型組而低于對照組，MDA低于模型組而高于對照組。表明虎杖苷可能通過調(diào)控自噬來緩解糖尿病潰瘍組織中的氧化應激反應。

SIRT1可誘導肝細胞的自噬水平從而緩解胰島素抵抗[21]。有研究顯示SIRT1可被白藜蘆醇激活進而緩解DM引起的心臟炎癥和纖維化[22]。SIRT1會受到miR-128-3p的靶向調(diào)控，miR-128-3p可通過靶向SIRT1/ROS途徑提高大腸癌對腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體誘導的細胞凋亡敏感性[24]。這些結(jié)果提示虎杖苷可能通過影響miR-128-3p/SIRT1自噬通路來緩解糖尿病潰瘍組織中的氧化應激反應。為進一步驗證這個假設，本研究對虎杖苷調(diào)控自噬的機制進行分析，檢測了其對miR-128-3p和SIRT1的影響。結(jié)果顯示模型組大鼠傷口周圍組織中miR-128-3p水平被上調(diào)而SIRT1轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平被下調(diào)，而虎杖苷可以抑制miR-128-3p并促進SIRT1 mRNA和蛋白的表達水平。此外，本研究在內(nèi)皮祖細胞中驗證了miR-128-3p可靶向抑制SIRT1的轉(zhuǎn)錄和翻譯。研究顯示脂肪間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體可通過抑制miR-128-3p促進SIRT1的表達，進而促進DM大鼠的傷口愈合[23]。

虎杖苷可能通過抑制miR-128-3p促進SIRT1的表達，提高內(nèi)皮祖細胞的自噬，緩解細胞氧化應激損傷，進而抑制炎癥反應抑制潰瘍的產(chǎn)生，并促進新組織生成。虎杖苷大鼠LC3Ⅱ和Beclin1水平顯著高于模型組。為了證實miR-128-3p與SIRT1之間是否存在靶向結(jié)合作用，本研究進行生物信息學分析和熒光素酶報告基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT1 3’-UTR存在1個miR-128-3p的結(jié)合位點，而且miR-128-3p mimic可減少wt-SIRT1熒光素酶活性，但對mut-SIRT1熒光素酶活性無影響，從而鑒定SIRT1為miR-128-3p的靶基因。同時過表達miR-128-3p可降低內(nèi)皮祖細胞SIRT1 mRNA與蛋白表達水平，表明miR-128-3p在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控SIRT1表達。

綜上所述，虎杖苷可能通過調(diào)節(jié)miR-128-3p/SIRT1通路誘導自噬，進而緩解高糖引起的氧化應激損傷，促進DM模型大鼠的傷口愈合。但是關于虎杖苷促進DM傷口愈合的機制仍需要及進一步研究，并且其調(diào)控miR-128-3p/SIRT1通路的分子機制也需要深入探討。本研究結(jié)果為虎杖苷治療糖尿病潰瘍提供了新的理論基礎與研究思路。