基于藥效學(xué)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)選穿王消炎片提取工藝研究*

李 鶴，龔來覲，陳冬平，楊 琴

（江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院，江西 樟樹 331200）

穿王消炎片為中藥復(fù)方制劑，源于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》，由穿心蓮、了哥王兩味中藥組成，具有消炎、解毒功效，用于痰熱咳喘、腹痛，以及急慢性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎，急性腸胃炎、急性菌痢見以上癥狀者[1]。穿心蓮來源于爵床科屬植物穿心蓮干燥地上部分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化應(yīng)激、消炎、抗菌等廣泛藥理作用[2-4]。了哥王來源于瑞香科植物了哥王干燥根[5]，具有抗菌、消炎鎮(zhèn)痛、抗病毒等藥理作用[6-7]，療效確切，但有一定毒副作用。有文獻(xiàn)指出，了哥王有大毒，其果實(shí)、莖、葉和根皮均有毒，中毒時(shí)可導(dǎo)致腹瀉、嘔吐等消化道反應(yīng)及皮疹等皮膚反應(yīng)[8]。

以往文獻(xiàn)中穿心蓮和了哥王大部分以乙醇為溶劑采用超聲、滲漉、回流等方法提取[9-10]，兩味藥材的提取方法及提取工藝參數(shù)如乙醇的濃度、用量等均不同[11-12]。因此傳統(tǒng)工藝中將穿心蓮和了哥王分別提取，再合并濃縮制成稠膏[13-15]，且尚未考慮了哥王毒性對(duì)用藥安全的影響，同時(shí)未對(duì)提取成分的抗炎藥效和毒性進(jìn)行藥效學(xué)驗(yàn)證。

了哥王的炮制減毒方法為“汗?jié)n法”[16-17]，故本研究模擬汗?jié)n減毒的方法采用人工汗液與乙醇的混合溶劑進(jìn)行提取，達(dá)到減毒增效的作用。為便于工業(yè)大生產(chǎn)的推廣，本研究選擇加熱回流的方法同時(shí)提取兩味藥材，以簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝流程。結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，綜合評(píng)價(jià)穿王消炎片抗炎療效、肝毒性和浸膏收率。全面考察穿心蓮和了哥王提取的影響因素，以期獲得最佳的穿王消炎片提取方法和生產(chǎn)工藝，為工業(yè)生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wister大鼠168只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006。大鼠于室內(nèi)保持12 h光照，12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，且控制室內(nèi)溫度為（25±1）℃，相對(duì)濕度在（50±10）%。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審核，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)定，審查編號(hào)：JNDL-20210910。

1.2 藥物及試劑 穿心蓮、了哥王藥材均購(gòu)于江西樟樹藥材交流中心，經(jīng)龔福保教授鑒定，穿心蓮為爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees的干燥地上部分，了哥王為瑞香科蕘花屬植物了哥王Wikstroemia indica (Linn.) C.A. Mey的干燥根。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20200610）購(gòu)于南京建成生物工程研究所；人工汗液：含L-組氨酸鹽酸鹽0.5 g/L、氯化鈉5 g/L、二水合磷酸二氫鈉2.2 g/L，用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，即得；其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 CP213型電子天平（美國(guó)奧豪斯）；MIKRO 220R型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；ADVIA 1800型全自動(dòng)生化分析儀（德國(guó)Siemens Healthcare Diagnostics公司）。

2 方 法

2.1 提取 根據(jù)穿王消炎片處方，取60 g穿心蓮和40 g了哥王粉碎成粗粉，加8倍量30%的人工汗液乙醇溶液（V人工汗液∶V乙醇=30∶70），于60 ℃加熱提取2次，每次2 h，合并提取液，過濾，濃縮成稠膏狀，干燥至恒重，得穿王干膏。稱重，計(jì)算浸膏收率。

2.2 分組與給藥 取雄性Wistar大鼠168只，按體質(zhì)量隨機(jī)分組，包括：40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃試驗(yàn)組，10%、20%、30%、40%、50%試驗(yàn)組，響應(yīng)面1～17試驗(yàn)組及模型組，每組6只。各試驗(yàn)組大鼠分別灌胃穿王干膏[用1.0%羧甲基纖維素鈉（CMC）配制成混懸液]，給藥劑量均為2.2 g/kg；模型組大鼠灌胃給予等體積1.0% CMC蒸餾水混懸液；大鼠灌胃的體積均為20 mL/kg，1次/d，連續(xù)給藥1周。給藥期間正常供給飼料與水。

2.3 抗炎效果測(cè)定 采用角叉菜膠致大鼠足跖炎癥模型。末次給藥前，用記號(hào)筆在每只大鼠的右后肢踝關(guān)節(jié)周圍做上記號(hào)，用容積法測(cè)定足容積為致炎前足容積，然后各組大鼠再灌胃給藥，1 h后將1%角叉菜膠0.1 mL注入大鼠右后足跖腱膜下致炎，致炎3 h后再次測(cè)定足容積為致炎后足容積，以致炎前、后足容積之差（即腫脹度）為指標(biāo)，計(jì)算每只大鼠的足腫脹抑制率。足腫脹抑制率=（模型組腫脹度-試驗(yàn)組腫脹度）/模型組腫脹度。

2.4 肝毒性測(cè)定 采用肝功能生化指標(biāo)AST測(cè)定法。“2.3”項(xiàng)下大鼠腹主動(dòng)脈取血，血液靜置40 min，12 000 r/min離心15 min，分離血清，于-20 ℃保存，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清AST水平。

2.5 單因素試驗(yàn) 前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提取溫度對(duì)足腫脹抑制率、AST值、浸膏收率3個(gè)指標(biāo)中的足腫脹抑制率影響明顯，人工汗液乙醇溶液用量對(duì)浸膏收率影響顯著，人工汗液乙醇濃度對(duì)足腫脹抑制率及AST值影響顯著，因此單因素試驗(yàn)中以足腫脹抑制率為指標(biāo)考察適宜提取溫度，以浸膏收率為指標(biāo)考察適宜人工汗液乙醇溶液用量，以足腫脹抑制率和AST值為指標(biāo)考察適宜人工汗液乙醇濃度。故單因素試驗(yàn)的篩選條件設(shè)為：（1）提取溫度分別在40、50、60、70、80 ℃下，按“2.1”項(xiàng)下方法提取，其他條件不變，測(cè)定浸膏的抗炎效果，初步確定合適的提取溫度。（2）人工汗液乙醇溶液用量分別用4、6、8、10、12倍量，按“2.1”項(xiàng)下方法提取，其他條件不變，計(jì)算浸膏收率，初步確定合適的人工汗液乙醇溶液用量。（3）分別采用10%、20%、30%、40%、50%人工汗液乙醇，按“2.1”項(xiàng)下方法提取，其他條件不變，測(cè)定浸膏的抗炎效果和肝功能指標(biāo)，初步確定合適的人工汗液乙醇濃度。

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 13.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以提取溫度（X1）、人工汗液乙醇溶液用量（X2）、人工汗液乙醇溶液配比（X3）為響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素，大鼠足腫脹抑制率（Y1）、肝功能生化指標(biāo)（Y2）、浸膏收率（Y3）的綜合評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，應(yīng)用三因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，優(yōu)化穿王消炎片的提取條件[18]。其中Y以Y1、Y2、Y3的總評(píng)“歸一值”計(jì)算，根據(jù)3個(gè)指標(biāo)對(duì)穿王消炎片提取影響的重要性，設(shè)定各自權(quán)重分別為0.5、0.3、0.2，Y=（Y1/Y1max）×50%+（100+Y2min-Y2）×30%+（Y3/Y3max）×20%，式中Y2越小越好，將各試驗(yàn)組中Y2min定為100分，其余各組按100+Y2min-Y2計(jì)算分?jǐn)?shù)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，穿王消炎片提取物各試驗(yàn)組分別與模型組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取溫度 隨著溫度升高，抗炎效果呈上升趨勢(shì)，其中60 ℃試驗(yàn)組大鼠足腫脹度最小，提示抗炎效果最佳；當(dāng)提取溫度超過60 ℃時(shí)，大鼠足腫脹度變大，其抗炎效果下降。由此可知，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高其有效組分的溶出增大，抗炎效果也增加；但溫度過高，其抗炎有效成分會(huì)被破壞，使其抗炎效果下降。故選取50、60、70 ℃提取溫度進(jìn)行下一步試驗(yàn)。（見表1）

表1 提取溫度對(duì)抗炎效果的影響 （±s）

表1 提取溫度對(duì)抗炎效果的影響 （±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

組別 n 腫脹度/mL 腫脹抑制率/%模型組 6 0.419±0.153 -40 ℃試驗(yàn)組 6 0.407±0.168 3.13±1.67images/BZ_31_317_787_318_788.png50 ℃試驗(yàn)組 6 0.335±0.132 19.32±8.34 60 ℃試驗(yàn)組 6 0.239±0.081a 42.13±14.92 70 ℃試驗(yàn)組 6 0.286±0.116a 30.46±11.68 80 ℃試驗(yàn)組 6 0.382±0.141 9.05±4.25

3.1.2 人工汗液乙醇溶液用量 隨著人工汗液乙醇溶液用量的增加浸膏收率也呈增加趨勢(shì)，但在人工汗液乙醇溶液用量到8倍用量后，再增加其用量，浸膏收率變化不大，故選取6、8、10倍量人工汗液乙醇溶液進(jìn)行下一步試驗(yàn)。（見表2）

表2 人工汗液乙醇用量對(duì)浸膏收率的影響

3.1.3 人工汗液乙醇濃度 與模型組比較，10%、20%人工汗液乙醇組大鼠血清AST水平明顯升高（P＜0.05）；30%、40%、50%人工汗液乙醇組大鼠血清AST水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，10%、20%、30%人工汗液乙醇組大鼠足腫脹度明顯減小（P＜0.05）；40%、50%人工汗液乙醇組大鼠足腫脹度與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。故選取20%、30%、40%人工汗液乙醇溶濃度進(jìn)行下一步試驗(yàn)。（見表3）

表3 人工汗液乙醇濃度對(duì)毒性和抗炎效果的影響 （±s）

表3 人工汗液乙醇濃度對(duì)毒性和抗炎效果的影響 （±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

組別 n AST/（U/L） 腫脹度/mL 腫脹抑制率/%模型組 6 125.42±17.83 0.419±0.153 -10%人工汗液乙醇組 6 209.52±25.37a 0.227±0.068a 44.93±15.7 20%人工汗液乙醇組 6 173.15±23.48a 0.205±0.064a 49.38±16.24 30%人工汗液乙醇組 6 122.74±16.87 0.242±0.072a 41.87±13.65 40%人工汗液乙醇組 6 127.89±19.54 0.353±0.140 14.85±6.49 50%人工汗液乙醇組 6 124.63±18.05 0.395±0.174 5.97±2.86

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化穿王消炎片的提取工藝條件

3.2.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果及Box-Benhken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)提取溫度（X1）、人工汗液乙醇溶液用量（X2）、人工汗液乙醇溶液（X3）3個(gè)因素設(shè)計(jì)的3個(gè)編碼水平見表4。按響應(yīng)面1～17試驗(yàn)組條件進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)大鼠足腫脹抑制率（Y1）、肝功能生化指標(biāo)（Y2）、浸膏收率（Y3）3個(gè)指標(biāo)，計(jì)算綜合評(píng)分（Y），結(jié)果見表5。

表4 響應(yīng)曲面因素及水平編碼值表

表5 響應(yīng)曲面因素及水平編碼值表

對(duì)表5進(jìn)行多元回歸擬合，得自變量提取溫度（X1）、人工汗液乙醇溶液用量（X2）、人工汗液乙醇溶液濃度（X3）與因變量綜合評(píng)分（Y）之間的線性回歸方程為Y=87.56+6.63X1+2.36X2-2.43X3-1.12X1X2-3.17X1X3-3.09X2X3-13.17X12-4.81X22-6.68X32。

回歸模型方差分析結(jié)果見表6。模型P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.186 1＞0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著，說明殘差是由隨機(jī)因素引起，回歸方程擬合度和可信度較高，使用該方程模擬實(shí)際的三因素三水平分析可行。決定系數(shù)R2=0.984 5＞0.95，說明此模型擬合度很高，與實(shí)際情況相符，且誤差較小，能充分反映出各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系；校正決定系數(shù)Radj2=0.964 6，說明此模型可解釋96.46%數(shù)據(jù)變異性。各因素之間存在著一定交互作用，X1、X3、X12、X22、X32為極顯著項(xiàng)（P＜0.01），X2、X1X3、X2X3為顯著項(xiàng)（P＜0.05），而X1X2對(duì)綜合評(píng)分影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值可判斷，3個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響順序?yàn)閄1＞X3＞X2。

3.2.2 提取工藝響應(yīng)面分析及優(yōu)化 根據(jù)顯著性分析繪制響應(yīng)面圖，由等高線可得，X1X3、X2X3交互作用顯著（等高線呈橢圓形），X1X2交互作用不顯著（等高線呈圓形）。由響應(yīng)面可知，提取溫度和人工汗液乙醇溶液濃度對(duì)綜合評(píng)分有顯著影響，表現(xiàn)為響應(yīng)面陡峭，而人工汗液乙醇溶液用量的響應(yīng)面較為平緩，對(duì)綜合評(píng)分的影響不顯著。（見圖1～3）

圖1 因素X1 和X2 對(duì)穿王消炎片提取工藝的影響

圖2 因素X1 和X3 對(duì)穿王消炎片提取工藝的影響

圖3 因素X2 和X3 對(duì)穿王消炎片提取工藝的影響

3.2.3 提取工藝驗(yàn)證 利用Design-Expert的Numerical分析得最佳提取工藝條件：提取溫度為62.76 ℃，人工汗液乙醇溶液用量為8.63倍量，人工汗液乙醇溶液濃度為26.8%，在此條件下的綜合評(píng)分為89.24。為驗(yàn)證響應(yīng)面結(jié)果的可靠性，結(jié)合實(shí)際操作方便，將工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化：提取溫度為63 ℃，人工汗液乙醇溶液用量為8.5倍量，人工汗液乙醇溶液濃度為27%，在此條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，結(jié)果綜合評(píng)分的均值為89.12，與回歸模型預(yù)測(cè)值有良好的吻合性，說明模型可靠，可用于穿王消炎片的提取。

4 討 論

穿王消炎片其功效主要是消炎解毒。臨床可用于痰熱咳喘，腹痛，以及急慢性扁桃體炎、咽喉炎、肺炎、急性腸胃炎和急性菌痢等炎癥。其作為“綠色消炎藥”具有廣闊的市場(chǎng)前景，但目前提取方法大都將兩味藥分別提取，生產(chǎn)工序既繁瑣復(fù)雜，且不符合中醫(yī)整體煎煮的用藥思想。故對(duì)其提取工藝進(jìn)一步研究。

當(dāng)前兩者的提取工藝大都采用測(cè)定提取物中某類有效成分的含量，如對(duì)穿心蓮內(nèi)酯、總黃酮等進(jìn)行評(píng)價(jià)[9-11]。此評(píng)價(jià)方法不能反映提取物中所有成分的藥效，因此本試驗(yàn)以藥效學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，可反映提取工藝的真實(shí)效果。本試驗(yàn)嘗試用乙醇合并提取，并找出最適濃度，同時(shí)考慮到了哥王毒性，模擬“汗?jié)n法”采取人工汗液和乙醇作為混合溶劑提取其有效成分，降低毒性。本試驗(yàn)提取方法改變了以往對(duì)穿心蓮和了哥王的提取均采用不同濃度的乙醇或甲醇分別提取的方法[12-15]。同時(shí)本研究使用造角叉菜膠致大鼠足跖炎癥模型，以大鼠足腫脹抑制率為藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)，全面評(píng)價(jià)提取物的抗炎效果。

肝臟是藥物代謝的主要器官，藥物肝毒性一直是藥物安全性評(píng)價(jià)的重點(diǎn)之一。AST是反映肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)，符合本試驗(yàn)評(píng)價(jià)藥物毒性的指標(biāo)。鑒于生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，本研究選取浸膏收率為提取完全的評(píng)價(jià)指標(biāo)。故本研究以足腫脹抑制率、AST值、浸膏收率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，全面評(píng)價(jià)穿王消炎片的提取工藝，以期較全面反映提取工藝的合理性。

單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中大鼠足腫脹抑制率結(jié)果顯示，提取溫度在60 ℃左右、人工汗液乙醇溶液濃度在低于30%時(shí)提取物的抗炎效果較好，可能有以下兩方面原因：一是提取溫度過低則有效成分溶出不完全，而提取溫度過高，導(dǎo)致穿心蓮內(nèi)酯水解；二是人工汗液乙醇溶液濃度過高，使乙醇含量少致有效成分溶出少。由AST值可知，人工汗液乙醇溶液濃度在30%以上時(shí)，其肝毒性較小，而低于30%時(shí)肝毒性較大，說明用人工汗液提取能降低了哥王的毒性。由浸膏收率可知，人工汗液乙醇溶液用量到8倍量以上時(shí)，其浸膏收率的增加不明顯，低于8倍量則提取不完全。

本試驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法對(duì)穿心蓮與了哥王合并提取，進(jìn)一步優(yōu)化工藝程序。對(duì)提取溫度、人工汗液乙醇溶液用量、人工汗液乙醇溶液濃度3個(gè)因素各水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)提取溫度和人工汗液乙醇溶液用量?jī)烧叩慕换プ饔脤?duì)綜合評(píng)分有顯著影響，反映了因素間的交互作用，并以較少試驗(yàn)次數(shù)對(duì)因素間的非線性關(guān)系進(jìn)行研究，克服了正交試驗(yàn)只能對(duì)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析而不能給出整個(gè)區(qū)域最優(yōu)值，精度不高的缺點(diǎn)。本研究通過響應(yīng)曲面法建立了穿心蓮與了哥王合并提取工藝的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，得出了最佳提取工藝條件：提取溫度為63 ℃，人工汗液乙醇溶液用量為8.5倍量，人工汗液乙醇溶液濃度為27%（V人工汗液∶V乙醇=27∶73）。在此條件下進(jìn)行工藝驗(yàn)證，結(jié)果驗(yàn)證值與回歸模型預(yù)測(cè)值有良好的吻合性，模型擬合程度高，試驗(yàn)誤差小。

綜上，本試驗(yàn)采用的提取工藝使提取物抗炎藥效高、毒性低和副作用小，可為工業(yè)生產(chǎn)和臨床用藥提供參考。