基于電導率-含水量曲線法制備、優化廣藿香揮發油微乳的研究*

鐘文嘉，黃益穗，劉灼波

（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405）

廣藿香揮發油是廣藿香的主要藥用有效成分[1]，具有芳香化濁、解暑的功效[2]。現代藥理學表明，廣藿香揮發油具有抗菌、抗炎、調整胃腸運動功能等作用[3]。由于廣藿香揮發油具脂溶性，口服入藥難于在胃腸道被吸收，制成微乳制劑（O/W型）可改善其在胃腸道的吸收性，從而提高生物利用度[4]。微乳制劑是由一定比例的油相、水相、表面活性劑和助表面活性劑配制而成的熱力學穩定體系，其粒徑一般介于10~100 nm之間。要獲得穩定性好的O/W型微乳，找準O/W型微乳成型臨界點尤為重要。目前的報道[5-6]多為目測法，即肉眼觀察體系由混濁至澄清作為O/W型微乳成型臨界點；也有報道[7-9]提到建立電導率-含水量曲線法，以電導率最大值時對應的含水量值作為O/W型微乳成型臨界點，但是沒有采用更為直觀的指標來證實電導率-含水量曲線法的精確性。本研究基于此背景，分別采用目測法、電導率-含水量曲線法確定微乳的O/W型微乳成型臨界點，按各自獲得的臨界點分別配制微乳，通過比較平均粒徑、多分散系數（polydiseperse Index，PDI），證實電導率-含水量曲線法比目測法確定的O/W型微乳成型臨界點更為精確，并在此基礎上，使用該方法制備并優化廣藿香揮發油微乳，以期為中藥微乳制劑的工業化發展提供借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Zetasizer Nano ZS90型納米粒徑電位分析儀（MALVERN公司）；HT7700型透射式電子顯微鏡（HITACHI公司）；MS603S型天平（美國梅特勒-托利多公司）；二級反滲透純化水制水機（廣州萬冠制藥設備公司）。

1.2 試藥 廣藿香揮發油（批號：P905696-23）、肉豆蔻酸異丙酯（IPM）（批號：1811858）均購于上海麥克林生化科技有限公司；油酸（OA）（批號：20220120）、吐溫80（TW80）（批號：20211201）、聚乙二醇400（PEG400）（批號：20211215）、1,2-丙二醇（批號：20210901）、無水乙醇（批號：20211201）均購于天津大茂化學試劑廠；聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40）（批號：2022032038R）購于廣東翁江試劑公司；所有試劑均為分析純，藥用級別純化水等。

2 方法與結果

2.1 目測法和電導率-含水量曲線法制備空白微乳和廣藿香揮發油微乳 從預試驗篩選出3個穩定的空白微乳處方，分別制備3個空白微乳和3個載藥微乳。（見表1）（1）電導率-含水量曲線法：以處方3為例，將助表面活性劑、表面活性劑先混勻，再加入油相，在500 r/min轉速下磁力攪拌10 min，獲得4 g的微乳原液，然后加入0.2 g的純化水，攪拌20 s后，測電導率值并記錄，重復上述操作步驟，直至測得微乳含水量80%時電導率值，將得到的微乳含水量值、對應的電導率值，使用軟件Origin 2021繪制電導率-含水量曲線，將電導率獲得最大值時，對應的含水量值作為O/W型微乳成型臨界點。（見圖1）（2）目測法：將助表面活性劑、表面活性劑先混勻，再加入油相，500 r/min轉速下磁力攪拌10 min，獲得4 g的微乳原液，然后慢慢加入純化水，攪拌，觀察微乳狀態，重復上述操作，直至微乳由混濁狀態變為澄清，記錄加入純化水的質量，此時微乳的含水量值即為O/W型微乳成型臨界點。

圖1 處方3 空白微乳、處方6 載藥微乳的電導率-含水量曲線圖

表1 空白微乳和載藥微乳處方組成、配比

上述兩種配制方法，由3名操作人員單獨進行，將獲得的實驗結果取平均值，作為目測法和電導率-含水量曲線法的O/W型微乳成型臨界點，然后進一步比較兩種方法制備的微乳的平均粒徑和多分散系數（PDI）。由于單獨使用廣藿香揮發油作為油相取代處方1、2的OA、處方3的IPM，均不能獲得穩定的微乳（出現混濁、分層）；將廣藿香揮發油與OA、廣藿香揮發油與IPM按質量比2∶1混勻后，作為混合油相，按表1處方1、2、3的配比，獲得微乳的平均粒徑、PDI偏大，穩定性一般；將廣藿香揮發油與OA、廣藿香揮發油與IPM按質量比1∶1混勻后，獲得微乳的平均粒徑、PDI均較小，穩定性較好，故選定該比例作為混合油相，備用。

2.2 目測法和電導率-含水量曲線法結果對比 依據“2.1”項表格的處方單獨進行，將獲得的實驗結果取平均值，作為目測法和電導率-含水量曲線法的O/W型微乳成型臨界點。各取兩種方法獲得的微乳適量，稀釋100倍后測量平均粒徑、PDI，實驗結果見表2。結果表明，目測法測得的O/W型微乳成型臨界點普遍靠前，在該臨界點下測得微乳的平均粒徑、PDI比電導率-含水量曲線法偏大，將處方1~6微乳各取適量，分別滴入亞甲基藍試劑和蘇丹Ⅲ試劑，靜置觀察，可見上述微乳中，亞甲基藍試劑的擴散速度均明顯大于蘇丹Ⅲ試劑，表明上述微乳類型均為O/W型。該實驗證實了目測法和電導率-含水量曲線法均能對O/W型微乳成型臨界點有較準確的判斷，但是電導率-含水量曲線法精確度更高，獲得的微乳更為穩定，證實了目測法確定的O/W型微乳成型臨界點，體系可能處于W/O型和O/W型雙連續相轉變為O/W型的最后階段[10-11]，尚未完全轉變為O/W型。該結果也進一步驗證了電導率-含水量曲線法確定的臨界點比目測法更為精確。

表2 目測法、電導率-含水量曲線法檢測結果

2.3 工藝篩選

2.3.1 電導率-含水量曲線法制備工藝的設定 將廣藿香揮發油分別與OA、IPM按質量比1∶1的比例混勻，作為油相備用，選取預試驗中篩選出的RH40、TW80 作為表面活性劑，PEG400、1,2-丙二醇、無水乙醇作為助表面活性劑。選擇在室溫（25 ℃）下進行試驗，首先使用磁力攪拌器在500 r/min轉速下將表面活性劑和助表面活性劑按照固定質量配比Km值（Km值=表面活性劑/助表面活性劑）為2∶1混勻，再按（含藥油相/總表面活性劑）質量比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，在500 r/min轉速下攪拌10 min制成微乳原液4 g，然后加入0.2 g純化水，攪拌20 s，測電導率，再加入0.2 g純化水，攪拌，測電導率，直至體系含水量為80%時，將獲得的含水量、電導率值輸入Origin 2021繪圖，建立電導率-含水量曲線，將電導率最大時的含水量值作為O/W型微乳成型臨界點，對于不能成乳或者成乳后平均粒徑未在10~100 nm范圍的處方予以剔除；此外，部分微乳成乳后，靜置24 h又重新出現混濁，這類處方也予以剔除；最后，根據油相、總表面活性劑、水相的占比，使用Origin 2021軟件給合格的微乳處方繪制偽三元相圖。

2.3.1.1 油相、表面活性劑、助表面活性劑類型的選定 按“2.3.1”項的方法，將不同類型的油相、表面活性劑、助表面活性劑一一組合，按照固定配比Km為2∶1，混合油相、總表面活性劑質量比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，配制微乳，將合格的微乳處方繪制偽三元相圖。結果顯示，圖2D的微乳成乳區域最大，故選定廣藿香揮發油/IPM作為含藥油相，TW80作為表面活性劑、PEG400作為助表面活性劑，用于下階段Km值的篩選。（見圖2）

圖2 不同微乳處方的偽三元相圖

2.3.1.2 Km值的選定 按“2.3.1”項的方法，將微乳處方廣藿香揮發油/IPM，TW80、PEG400，選定Km為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，含藥油相、總表面活性劑質量比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、6∶4、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，配制微乳，篩選Km值。結果顯示，當Km值為3∶1時微乳成乳區域最大。（見圖3）

圖3 不同Km 值的偽三元相圖

2.3.2 單因素試驗“2.3.1.1”項和“2.3.1.2”項篩選結果表明，含藥油相與總表面活性劑質量比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4時，可獲得合格微乳，含藥油相與總表面活性劑質量比為7∶3、8∶2、9∶1時不能配制成乳，故選定含藥油相占比最小為10%，最大為60%（即廣藿香揮發油占比5%~30%）用于下一階段響應面法工藝篩選；“2.3.1.2”項篩選結果表明，表面活性劑與助表面活性劑質量配比Km值為2∶1、3∶1時可獲得較大的微乳成乳區域，當Km值為4∶1或1∶1時微乳成乳區域明顯變小，說明上述兩種質量配比下，不能獲得較大的含藥油相占比（微乳載藥量）。當Km值＞4∶1或Km值＜1∶1時，微乳成乳區域會進一步縮小，因此選定最大Km值為4∶1，最小Km值為1∶1進行下一階段響應面法工藝篩選。試驗過程中發現磁力攪拌器轉速的不同，對微乳的成乳效果有一定的影響，為了考察磁力攪拌器轉速對微乳成乳效果的影響，采取固定含藥油相與總表面活性劑質量比為1∶9、Km為3∶1，考察磁力攪拌器轉速對微乳成乳效果的影響。結果發現，磁力攪拌器轉速低于500r/min時成乳時間較長，且攪拌不夠均勻，不利于后續微乳的配制。當磁力攪拌器轉速高于1 100 r/min時，過高的轉速帶動了燒杯的轉動影響了攪拌效果，且過高的轉速有可能將空氣帶入，制得的微乳有氣泡分散在體系中。基于上述原因，選定磁力攪拌器轉速為500~1100 r/min。

2.3.3 響應面法工藝篩選[12-13]

2.3.3.1 響應面法考察因素 按“2.3.2”項的結果制定響應面法考察因素水平表。（見表3）

表3 響應面法考察因素水平表[14-15]

2.3.3.2 方案設計及結果[16]使用軟件Design-Expert 12.0對表3進行響應面法設計，統計結果，見表4。

表4 工藝和結果

對表4的獲得的結果進行平均粒徑、PDI的方差分析，見表5~6。結果顯示，平均粒徑、PDI獲得的數學模型均為極顯著性，且失擬項不具顯著性，表明上述數學模型模擬的情況較為準確[17-18]。顯著因素廣藿香揮發油（%）、Km對粒徑、PDI響應面分析見圖4。平均粒徑、PDI取最低值時擬合方程分別為：平均粒徑=27.230+5.790A+1.875B-0.426C+2.905AB-0.688AC+1.835BC-2.912A2+2.105B2+0.344AC2；PDI=0.102+0.037A+0.024B+0.005C+0.039AB+0.001AC+0.015BC-0.006A2+0.044B2-0.001C2。由于平均粒徑對微乳體系的影響更為重要，故選擇最小平均粒徑對應的點作為最優處方點，即廣藿香揮發 油 為10.07%、IPM 為10.07%、TW80 為60.43%、PEG400 為19.43%，Km為3.11，攪拌速率為622 r/min，獲得的平均粒徑理論值為17.64 nm，PDI為0.069。

圖4 廣藿香揮發油、Km 對平均粒徑、PDI 的響應面圖

表5 平均粒徑的方差分析

表6 PDI 的方差分析

2.3.3.3 最優工藝驗證 對“2.3.3.2”獲得的最優點進行3批次驗證。結果顯示，平均粒徑、PDI值和模擬結果非常接近，說明此處方篩選結果可靠。（見表7）

表7 最優工藝驗證

2.4 微乳的理化性質及穩定性考察

2.4.1 微乳的電鏡圖 取“2.3.3.3”項微乳適量滴至銅網上，靜置10 min后，使用濾紙吸干，再加入2%的磷鎢酸負染10 min，再用濾紙吸干剩余液體，置于電鏡下觀察。圖片顯示微乳外觀飽滿、圓整，穩定性較好。（見圖5）

圖5 微乳的形態

2.4.2 高速離心考察 將微乳于5 000 r/min轉速下高速離心30 min。結果顯示，微乳依舊澄清、透明，未見分層，表明微乳穩定性好。

2.4.3 微乳類型鑒定及25 ℃下遮光、不遮光考察 取“2.3.3.3”項微乳適量，分別滴入亞甲基藍和蘇丹Ⅲ試劑，靜置5 min。圖6A、6B顯示，亞甲基藍在微乳中的擴散效果明顯，而蘇丹Ⅲ停留在液面幾乎不擴散，表明該微乳為O/W型，再取“2.3.3.3”項微乳適量，在室溫（25 ℃）條件下，分別作遮光處理和不作遮光處理，放置60 d后測平均粒徑、PDI，試驗平行3次。圖6C、6D顯示，兩種狀態下微乳的顏色無明顯差異；遮光狀態下，測得微乳的平均粒徑為（19.23±0.26）nm、PDI為（0.085±0.005）；不遮光狀態下，測得微乳的平均粒徑為（19.47±0.31）nm、PDI為（0.089±0.009）。試驗結果進一步證明，在25 ℃下，微乳放置60 d后平均粒徑、PDI雖略為增大，但依舊穩定。

圖6 不同狀態下微乳的外觀

3 討 論

筆者查閱文獻[19]發現可使用滲濾電導模型理論解釋微乳的電導率-含水量曲線變化規律。以圖1為例，微乳原液階段，由于含水量為0，油的導電性又極低，此時電導率接近0。隨著含水量的增加，體系間連續相依舊為油相，故電導率的增加較為緩慢。當含水量到達滲濾閾值[20]（滲濾閾值：導電微粒占整個體系的體積分數）后，帶電液滴增加明顯，故電導率增加迅速，此時體系為W/O型；隨著含水量的進一步增加，微乳液滴與液滴之間發生碰撞，形成了導電鏈，微乳的電導率又進一步增加，直至電導率的頂點，此范圍的微乳為W/O型和O/W型雙連續型。當微乳的電導率到達頂點后，含水量的增加又稀釋了帶電的微乳液滴，從而電導率開始下降，此時體系轉變為單一的O/W型。該理論可以有效解釋微乳電導率的變化與微乳的相間關系，但是之前的報道沒有采用直觀的方式來證實該理論的可靠性，而本研究則通過拍攝微觀狀態下微乳的形態驗證了該理論的可靠性。此外，試驗過程中發現攪拌速率對微乳的成乳有一定的影響，但是實際篩選結果卻并不顯著，因此，微乳的攪拌速率適中即可，太快可減少乳化時間，但容易帶入空氣，太慢則成乳時間過長，或難于配制成乳。再者，適當增加微乳的載藥量可減少服藥量，但是載藥量不宜一味增大，試驗過程中發現微乳載藥過大容易造成平均粒徑增大破壞其穩定性，甚至出現分層、變混濁的現象，因此，要擴大中藥微乳制劑，還須提高中藥精制、提純技術方可實現。本研究通過測定平均粒徑、PDI及生物透射電鏡觀察的手段驗證了電導率-含水量曲線法中電導率最大值作為O/W型微乳成型臨界點的精確性，可以為中藥微乳制劑的制備提供一定的參考。