基于PCR-HRM 的水稻氮高效基因NRT1.1B功能標記開發及應用

房文文王海鳳郭濤薛芳姜艷芳張煥霞張士永

(山東省農業科學院濕地農業與生態研究所/山東省水稻工程技術研究中心，山東濟南 250100)

水稻作為重要的糧食作物，稻谷的穩產與增產對糧食安全至關重要[1]。 氮素是水稻需求量最大的營養元素，也是制約水稻產量的關鍵因子[2]。 化肥尤其是氮肥的施用對水稻增產和改善稻米品質起了重要作用。 但近年來，氮肥施用過量已成為水稻生產中普遍存在的問題[3-4]，對生態環境造成了嚴重破壞[5]。 因此，培育養分高效型水稻新品種是解決這一問題的關鍵[6]。

研究表明，秈稻的氮肥利用率顯著高于粳稻[7-8]。 培育和選育氮肥利用率高的粳稻品種是困擾育種工作者的難題。 Hu 等[9]研究揭示了秈、粳稻亞群氮肥利用差異的遺傳基礎，發現硝酸鹽轉運蛋白基因NRT1.1B單堿基變異是導致秈、粳稻間氮肥利用效率差異的主要原因，將秈型NRT1.1B導入粳稻能大幅度提高其氮利用效率，即在氮肥減半的條件下，產量較對照增加30%～33%，氮肥利用效率提高30%；在正常施肥條件下，增產8%～15%，氮肥利用效率提高約10%。

基因序列比對發現，秈稻中NRT1.1B基因編碼區第980 位堿基為T，而其在粳稻中等位基因堿基為C，從而使編碼蛋白的第327 位氨基酸分別為蛋氨酸和蘇氨酸[9]。 根據NRT1.1B基因變異位點，方琳等[10]開發了特異性功能標記；牛付安等[11]開發了KASP 標記，并開展了氮高效粳稻育種。 本研究根據NRT1.1B基因的SNP 位點開發了一個用于HRM 檢測方法的分子標記，并經測序方法驗證標記的正確性，然后用其對78 份山東省地方品種進行NRT1.1B基因分型鑒定，為培育氮高效水稻新品種提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻材料包括NRT1.1B材料NM73、對照品種日本晴及78 份山東省地方品種。 NM73 由山東省農業科學院濕地農業與生態研究所李平波博士提供，其他水稻材料均由山東省種質資源團隊收集和保存，以常規方法栽培。

試劑及儀器: 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR 試劑，北京全式金生物技術(TransGen Biotech) 有限公司；EvaGreen qPCR 核酸染料，美國Biotium 公司。 SPX 智能型生化培養箱、RXZ-500C-LED 人工氣候培養箱，寧波江南儀器廠；BCD-290W 型立式冰箱，青島海爾股份有限公司；羅氏LightCycler96 實時熒光定量PCR 儀，Roche 公司。

1.2 NRT1.1B 基因序列分析及標記開發

對NRT1.1B基因序列進行分析，利用NRT1.1B與其等位基因及對照品種日本晴中的序列差異，應用Oligo 7 軟件，根據差異的SNP 設計引物對。 引物均由華大基因公司合成。

1.3 DNA 提取、PCR 擴增及HRM 檢測

采用CTAB 法[12]提取水稻樣品的基因組DNA。 10 μL PCR 反應體系:2×EasyTaq?PCR SuperMix 母液5 μL，模板DNA 3 μL，正反向引物各0.2 μL(0.1 mmol/L)，20×Evagreen 0.125 μL，ddH2O 1.475 μL。 PCR 擴增程序:94 ℃預變性3 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環；最后72 ℃延伸10 min 后4 ℃保存。 擴增完成后，熔解曲線分析的程序為:95 ℃變性15 s；60 ℃退火15 s；以0.07 ℃/s 的速率升溫，10 次/℃采集熒光信號，至90 ℃保持1 s。 采用Light Cycler 96 軟件進行熔解曲線分析。

2 結果與分析

2.1 NRT1.1B 序列分析及功能標記的設計

根據NRT1.1B基因編碼區第980 位的SNP變異位點設計分子標記，根據位點上下游基因序列設計了4 條引物，見表1。

表1 NRT1.1B 基因分子標記引物序列

2.2 功能標記的檢測及方法

分別利用引物組合NRT1.1B-HRM -F1R1、NRT1.1B-HRM-F2R1、NRT1.1B-HRM-F2R2、NRT1.1B-HRM-F1R2 對日本晴和NM73 進行擴增分型，結果表明，利用NRT1.1B-HRM-F1R1 引物組合得到的熔解曲線比較平滑，能夠對兩種基因型的樣品進行多態性區分(圖1)。 最終選擇NRT1.1B-HRM-F1R1 組合作為本研究后續試驗采用的引物對。 利用日本晴和NM73 對篩選的引物對NRT1.1B-HRM-F1R1 的基因分型效果進行驗證，能夠檢測出NM73 為含有NRT1.1B基因的高效單倍型，而日本晴為不含NRT1.1B基因的野生型。

圖1 水稻NRT1.1B 基因熔解曲線結果

2.3 功能標記驗證

進一步利用Li 等[13]開發的NRT1.1B標記NRT1.1B I1 ID 基于HRM 方法進行驗證(圖2)，分型結果與NRT1.1B-HRM-F1R1 一致。

圖2 利用NRT1.1B I1 ID 標記檢測NRT1.1B 基因

2.4 水稻品種中NRT1.1B 的檢測

利用篩選的引物對檢測78 份山東省地方水稻品種，共檢測到13個品種為含有NRT1.1B基因(圖3 和表2)的高效單倍型，其他65個品種均不含有NRT1.1B基因。 而且PCR 擴增后，僅需8 min 即可完成78個樣品的NRT1.1B基因分型。

圖3 山東地方水稻品種NRT1.1B 基因檢測結果

表2 山東地方水稻品種NRT1.1B 基因分型結果

2.5 水稻材料NRT1.1B 基因型測序驗證

為了驗證NRT1.1B 標記檢測的準確性，對10份水稻材料(紫皮水旱稻、青旱稻、鐵耙子、水旱稻-2、粘稻、旱粘稻-1、小黃稻、竹稈青、大青秸-1和大紅芒-1)的NRT1.1B基因進行PCR 擴增，然后測序，部分測序結果見圖4。 其中，SNP 位點堿基是T 時，基因型為含NRT1.1B基因的高效單倍型；SNP 位點堿基是C 時，基因型為不含NRT1.1B基因的野生型。

圖4 部分水稻材料NRT1.1B 基因SNP 位點的測序分型結果

對10 份材料的測序結果進行分析發現，6 份的基因型與NM73 相同，分別為紫皮水旱稻、青旱稻、鐵耙子、水旱稻-2、粘稻和旱粘稻-1；4 份的基因型與日本晴相同，分別為小黃稻、竹稈青、大青秸-1 和大紅芒-1。 測序結果與利用本研究開發標記得到的基因分型結果一致，即NRT1.1B 標記能夠準確鑒定出含有NRT1.1B的材料，可為水稻氮高效基因育種提供技術支持。

3 討論與結論

隨著水稻功能基因組學的發展，已克隆了一個編碼NAD(P)H 依賴型硝酸還原酶的OsNR2[14]，克隆了OsNRT2.2、OsNRT2.3a、OsNRT2.4、OsNRT2.3b和OsLHT1等多個水稻硝酸根吸收和轉運基因[15-17]，鑒定了氮高效利用基因NRT1.1A[18]和Ef-cd[19]，兼具早熟、高產、氮高效育種應用價值，為氮高效分子育種提供了基因位點。

隨著氮高效基因的挖掘，陶亞軍等[20]對70份常規秈稻、34 份常規粳稻和84 份太湖資源水稻材料進行氮高效基因鑒定，發現OsNR2在秈稻中分布較廣；OsNPF6.1、OsTCP19、OsGRF4在秈稻中分布較少且在常規粳稻中未被檢出，常規粳稻中僅含有OsLHT1[21]；方琳等[10]對134 份粳稻品種進行NRT1.1B檢測，發現均無高效基因型。 本研究通過開發用于HRM 方法的氮高效基因NRT1.1B的功能標記，并對78 份山東省地方品種進行NRT1.1B篩選，得到13 份含有NRT1.1B基因的高效單倍型材料。 這為水稻氮高效品種的培育提供了供體材料和技術支撐，可加快育種進程。

研究發現，聚合秈型OsNR2和NRT1.1B位點，氮利用效率比單個基因更高[20]。 下一步將針對該問題，開發可利用的功能標記，結合傳統育種手段，對不同氮高效基因系進行聚合，以期將多個基因導入到主推的粳稻品種中，以提高氮利用效率。