南方紅豆杉鮮葉浸提液對3 種藥用植物種子萌發與幼苗生長的化感作用

李文楊魏歌劉秀青魏嵐岳建華

(信陽農林學院林學院/信陽市林木遺傳育種重點實驗室，河南信陽 464000)

植物化感作用在農業、旱生沙地、牧場和草原等農業生態系統中發揮著重要作用，作為一門新興的交叉學科，目前已成為研究的熱點。 Moral等[1]研究指出，短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)對3種植物的化感作用效應不同，表明植物間化感作用存在個體差異。 南方紅豆杉(Taxus wallichianavar.mairei)全株含紫杉醇及其衍生物[2]，具有顯著的發展潛力。 李春英等[3]研究發現，南方紅豆杉枝和根浸提液對喜樹(Camptotheca acuminataDecne.)種子具有化感作用。

近年來，中藥材需求不斷增加。 受我國耕地資源、種植條件限制，加上藥用植物年齡增加和經濟利益驅使而普遍出現的藥用植物連作和生長不良現象，導致藥材質量和產量顯著下降，因此連作障礙已成為制約我國中藥生產發展的重大問題[4-5]。 林藥間作作為林地行間種植中藥材的栽培模式，可充分利用森林資源發展林下經濟，是農林復合經營模式中的一種，具有高效可行性[6-7]。但目前林藥間作還處于探索研究階段，還需要通過試驗來確定合理的不同林藥植物間作模式及其經濟效益、生態效益表現。 關于南方紅豆杉與農作物、草本植物、喬木之間的化感作用及其間套作也有待進一步深入研究。 本試驗以3 種藥用植物即黃芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)、紫花苜蓿(Medicago sativaL.)、牛蒡(Arctium lappaL.)為受體，研究南方紅豆杉鮮葉浸提液對其種子萌發和幼苗生長的化感作用，旨在了解林藥植物之間的化感作用，探明南方紅豆杉與3 種藥用植物林藥間作的可行性，為南方紅豆杉間作套種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

浸提液供試材料選取:于2021年10月下旬在河南省信陽市信陽農林學院南方紅豆杉大棚試驗基地選擇5年生南方紅豆杉植株，采其帶有新鮮嫩綠葉片的枝條。

受體材料:黃芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)、紫花苜蓿(Medicago sativaL.)、牛蒡(Arctium lappaL.)3 種藥用植物種子，2021年9月中下旬購于河北萬草種業有限公司。

1.2 南方紅豆杉浸提液的制備

將選取的南方紅豆杉枝條帶回實驗室，用流水沖洗葉片，再用蒸餾水沖洗若干次，置于實驗臺晾干表面水分，之后將剪碎的葉片用粉碎機粉碎后備用。 稱量100 g 南方紅豆杉葉粉放入到1 000 mL 蒸餾水中浸泡48 h，之后用紗布過濾得到100 g·L-1純濃度母液，-4 ℃冷藏。 用蒸餾水將南方紅豆杉葉浸提液分別稀釋成2、6、10 g·L-1三種不同濃度。

1.3 種子萌發試驗

參照田勝尼等[7]和李怡瑩[8]的方法進行。按種子質量指標分別選取黃芩、紫花苜蓿和牛蒡種子，均用1% KMnO4溶液消毒30 min，再用無菌水沖洗干凈，置于培養皿中培養。 不同處理培養皿分別加入2、6、10 g·L-1南方紅豆杉葉浸提液2 mL，對照(CK)加相同體積的蒸餾水。 每個培養皿放置種子40 粒，每處理重復3 次。 將培養皿置于恒溫培養箱中進行種子萌發試驗，溫度控制在(25±1) ℃，光照強度為2 000 lx，光照14 h/黑暗10 h。 每天觀察種子發芽情況，3 天補充1 次相同濃度的浸提液。 黃芩和牛蒡種子在萌發第5 天、紫花苜蓿種子在第4 天計算初次發芽率，在萌發第10—14 天計算末次發芽率，統計各處理種子每天的發芽指數并計算平均值。

發芽率(GR)＝(正常發芽種子數/供試種子數)×100%；

發芽指數(GI)＝∑Gt/Dt，式中Gt 為第t 天種子發芽數，Dt 為相應的發芽天數。

1.4 幼苗生長試驗

種子萌發試驗結束后，將已發芽種子從培養皿中移栽到帶浮漂板的水培育苗盤(育苗盤規格為:長32.5 cm、寬24.5 cm、高12 cm，用種植棉固定植株于外孔徑35 mm、內徑23.5 mm 的定植籃后再放入孔徑為32 mm 的浮漂板上)中，用7 天營養液(史丹利水培型植物營養液:營養液∶水＝1∶200 mL)與7 天蒸餾水交替培養，蒸餾水與營養液中分別加入不同處理濃度浸提液，培養條件同1.3 步驟，30 天時采樣測定苗高、根長和生理生化指標。

1.5 生理生化指標測定

每個處理隨機選取12 株幼苗為試材，混合采樣后立即用液氮冷凍，-80 ℃下貯藏。 采用乙醇提取比色法[9]測定光合色素含量，采用硫代巴比妥酸法[10]測定丙二醛(MDA)含量，采用WST-1法[11]測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用可見分光光度法[12]測定過氧化物酶(POD)活性，采用紫外分光光度法[13]測定過氧化氫酶(CAT)活性。

1.6 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2019 進行數據處理和作圖，用SPSS 19.0 軟件對數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和差異顯著性檢驗。 參照Williamson[14]、鄒子湘[15]等的方法，采用化感效應指數(RI)進行化感效應分析，公式為:

式中，C 為CK 值，T 為處理值。

化感效應的強弱＝｜RI ｜，與CK 相比，正值表示促進(RI＞0)，負值表示抑制(RI＜0)，化感綜合效應指數(SE)是各項RI 的平均值。

2 結果與分析

2.1 南方紅豆杉浸提液對3 種藥用植物種子萌發與幼苗生長的影響

南方紅豆杉浸提液對3 種藥用植物種子萌發的影響作用不同(表1)。 其中，2 g·L-1浸提液顯著抑制黃芩和牛蒡的發芽率，對紫花苜蓿的發芽率影響不顯著；10 g·L-1浸提液顯著降低紫花苜蓿的發芽率，對黃芩和牛蒡的發芽率影響不顯著。 10 g·L-1浸提液濃度下黃芩、紫花苜蓿和牛蒡的發芽指數最高，比CK 分別上升3.10%、0.93%和3.71%。

10 g·L-1南方紅豆杉浸提液顯著促進黃芩、紫花苜蓿和牛蒡的幼苗生長，苗高比CK 分別增加26.15%、42.23%和109.02%(P＜0.05)，根長比CK 分別增加111.18%、39.53%和48.33%(P＜0.05)。 不同濃度浸提液對黃芩根長均呈顯著促進趨勢，其中6 g·L-1浸提液促進作用最低。 紫花苜蓿苗高和根長分別在2、6 g·L-1浸提液濃度下達到抑制最大值，與CK 相比，分別下降18.94%、32.05%(P＜0.05)。 對牛蒡苗高和根長的抑制作用均在2 g·L-1浸提液濃度下最大，且差異顯著。

2.2 南方紅豆杉浸提液對3 種藥用植物光合色素含量的影響

由表2 可以看出，南方紅豆杉浸提液濃度為10 g·L-1時，黃芩的葉綠素a、類胡蘿卜素含量和葉綠素總含量最高，呈促進作用，與CK 相比分別增加26.09%、16.67%和25.00%，其中葉綠素a 和葉綠素總含量差異顯著。 在2 ～10 g·L-1浸提液濃度下紫花苜蓿的葉綠素a、類胡蘿卜素含量和葉綠素總含量隨濃度增加而降低，表現為抑制作用；10 g·L-1浸提液濃度下紫花苜蓿葉綠素a 和類胡蘿卜素含量比CK 分別下降51.72%和66.67%(P＜0.05)；2 g·L-1浸提液對紫花苜蓿葉綠素b 含量有促進作用，比CK 增加8 倍(P＜0.05)。 南方紅豆杉浸提液對牛蒡的葉綠素a、類胡蘿卜素含量和葉綠素總含量具有“低濃度促進高濃度抑制”的作用，6 g·L-1浸提液對牛蒡的光合色素含量促進作用最強；10 g·L-1浸提液抑制作用最大，其葉綠素a、類胡蘿卜素含量和葉綠素總含量與CK 相比分別下降29.41%、50.00%和13.04%。

2.3 南方紅豆杉浸提液對3 種藥用植物丙二醛(MDA)含量和保護酶活性的影響

2.3.1 對丙二醛(MDA)含量的影響由圖1 可知，2 g·L-1浸提液處理黃芩和紫花苜蓿的MDA含量最高，比CK 分別增加19.43%和141.05%，且紫花苜蓿達到顯著水平；6 g·L-1浸提液處理黃芩和紫花苜蓿的MDA 含量最低，與CK 相比分別下降45.12%和10.14%。 6 g·L-1浸提液處理牛蒡的MDA 含量最高，與CK 相比增加87.71%(P＜0.05)；2 g·L-1濃度處理的MDA 含量最低，與CK相比下降15.20%。

圖1 南方紅豆杉浸提液對3 種藥用植物丙二醛含量及保護酶活性的影響

2.3.2 對過氧化物酶(POD)活性的影響6 g·L-1浸提液處理牛蒡的POD 活性最高，與CK 相比升高164.00% (P＜0.05)。 各濃度處理間相比6 g·L-1浸提液處理紫花苜蓿的POD 活性最高；2 g·L-1浸提液處理黃芩的POD 活性最高，而該濃度下紫花苜蓿的POD 活性最低，兩者比相應CK分別下降34.67%和38.94%(P＜0.05)。 10 g·L-1浸提液處理牛蒡的POD 活性最低，但比CK 仍升高26.00%，達顯著水平(圖1)。

2.3.3 對過氧化氫酶(CAT)活性的影響10 g·L-1浸提液處理黃芩的CAT 活性最高，與CK 相比升高345.46%(P＜0.05)；2 g·L-1浸提液處理的CAT活性最低，與CK 相比也顯著升高227.26%。2 g·L-1浸提液處理紫花苜蓿和牛蒡的CAT 活性最高，比相應CK 分別升高163.64%、227.27%(P＜0.05)；10 g·L-1浸提液處理的CAT 活性最低，但較CK 也分別升高36.36%、63.64%(P＜0.05)。

2.3.4 對超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響2 g·L-1浸提液處理黃芩的SOD 活性最低，比CK下降12.69%；10 g·L-1浸提液處理的SOD 活性最高，比CK 上升8.38%。 10 g·L-1浸提液處理紫花苜蓿的SOD 活性最低，與CK 相比降低23.54%(P＜0.05)；6 g·L-1浸提液處理的SOD 活性最高，與CK 相比差異不顯著。 10 g·L-1浸提液處理牛蒡的SOD 活性最低，比CK 下降37.59%(P＜0.05)；2 g·L-1浸提液處理牛蒡的SOD 活性最高，與CK 相比顯著上升11.21%。

2.4 南方紅豆杉浸提液對3 種藥用植物化感綜合效應指數(SE)的影響

由表3 可以看出，南方紅豆杉浸提液各濃度處理下黃芩發芽率的化感效應指數(RI)均為負值，呈抑制趨勢；根長的RI 均為正值，呈促進趨勢；葉綠素總含量的RI 值說明，隨著浸提液濃度增加呈現低濃度抑制高濃度促進的趨勢，即2 g·L-1濃度下葉綠素總含量的RI 值最小，抑制作用最強。 黃芩CAT 活性的RI 均為正值，呈促進作用，而POD 活性的RI 則與其相反，呈抑制作用。 在2～10 g·L-1浸提液濃度之間黃芩的化感綜合效應指數(SE)值分別為0.060、0.007 和0.098，呈現“V”型變化趨勢。

表3 南方紅豆杉浸提液對3 種藥用植物化感綜合效應指數(SE)的影響

不同濃度南方紅豆杉浸提液處理下紫花苜蓿種子萌發指標的RI 多為負值，呈抑制趨勢；苗高的RI 值說明，其作用為“低抑高促”；根長的RI在10 g·L-1濃度下值最大，為0.283。 2 g·L-1浸提液濃度下紫花苜蓿MDA 含量、CAT 活性的RI 值最大，分別為0.585 和0.621。 在2～10 g·L-1浸提液濃度之間紫花苜蓿的化感綜合效應指數(SE)值為低濃度增大高濃度減小，2 g·L-1浸提液處理下SE 值為0.007，呈促進趨勢。

10 g·L-1南方紅豆杉浸提液處理下牛蒡發芽率和發芽指數的RI 為正值，呈現促進作用；苗高和根長的RI 隨著浸提液濃度增加而增大，呈現促進趨勢，即在10 g·L-1濃度下RI 值最大，分別為0.522 和0.326。 牛蒡葉綠素總含量的RI 值說明，隨著浸提液濃度增加呈現低濃度促進高濃度抑制的趨勢。 牛蒡POD、CAT 活性的RI 分別在6 g·L-1和2 g·L-1濃度下達到最大值，分別為0.621 和0.649。6 g·L-1浸提液處理下牛蒡的SE 值最大，為0.242，具促進作用。

3 討論

植物化感作用廣泛存在于生態系統中，通過對其研究能合理地解釋生態系統中植物種群分布、群落演替、協同進化和生物入侵等現象[16]。而在化感作用性質當中，化感自毒作用嚴重影響著農林業的發展。 藥用植物目前普遍存在化感自毒現象，通過向周圍和同種間釋放化學物質來影響它們的正常生長[17]。 本研究中，南方紅豆杉浸提液對黃芩與牛蒡的化感綜合效應均為正值，表現為促進作用；而對紫花苜蓿的化感綜合效應值呈現高濃度抑制趨勢，這與豬毛蒿(Artemisia scoparia)浸提液[18]和大狼毒(Euphorbia jolkinii)浸提液[19]對紫花苜蓿種子萌發影響的相關研究結果一致，即隨浸提液濃度增加化感抑制作用增強。板栗(Castanea mollissima)葉水浸提液對黃芩種子發芽率的化感作用呈現“低促高抑”，其中20 g·L-1浸提液促進作用最顯著，40 g·L-1浸提液顯著抑制其發芽[20]。 本試驗中，黃芩能較好地適應2～10 g·L-1南方紅豆杉浸提液，10 g·L-1浸提液化感綜合效應值最大。 這說明此浸提液濃度范圍均促進黃芩生長，下一步研究可以在此基礎上進一步擴大浸提液濃度范圍，探索最適黃芩生長的南方紅豆杉浸提液濃度。 人參(Panax ginsengC. A.Meyer)根系分泌物水對牛蒡種子萌發呈現“中低濃度促進高濃度抑制”，其中10 μg·mL-1處理促進作用最顯著[21]。 而本研究發現，6 g·L-1浸提液對牛蒡的化感綜合效應值最大，促進作用最強，說明受體牛蒡對不同植物的化感適應性不同。 綜合以上南方紅豆杉浸提液對3 種藥用植物化感綜合效應的研究發現，南方紅豆杉適宜與黃芩、牛蒡間作栽培，不適宜與紫花苜蓿間作栽培，與牛蒡間作要注意控制行間距、保持低密度種植。

關于不同濃度南方紅豆杉浸提液對受體植物光合色素含量的影響，本研究發現，6 g·L-1浸提液對受體牛蒡光合色素含量促進作用最顯著，10 g·L-1浸提液提高受體黃芩光合色素含量的作用最顯著。 受體植物化感綜合效應值最大的處理其葉綠素含量也最高。 不同濃度浸提液均抑制紫花苜蓿葉綠素含量，且隨浸提液濃度增高化感抑制作用越強，這與光葉紫花苕子(Vicia villosa)地上部和地下部浸提液均抑制紫花苜蓿種子萌發的研究[22]結果一致。 這也說明植物葉綠素含量是反映植物營養脅迫、光合作用和生長狀況的重要指標，對研究植物生理特性和抗性具有重要意義[23]。

植物受到逆境脅迫時會發生膜脂過氧化，以最終產物丙二醛含量來反映植物在逆境下的受損程度。 CAT、SOD、POD 普遍存在于植物組織中，是植物抗氧化系統中的主要酶，通過防止膜脂過氧化來抑制高濃度氧的積累，維持植物的正常生長發育，有效延緩植物衰老[24]。 從本試驗結果來看，黃芩保護酶CAT、SOD 活性隨著南方紅豆杉浸提液濃度增高而逐漸增加，POD 活性的變化趨勢則相反，10 g·L-1浸提液下黃芩POD 活性最低；10 g·L-1和6 g·L-1浸提液下黃芩MDA 含量較低，兩者之間差異不顯著，與CK 相比顯著降低。 這與10 g·L-1核桃(Juglans regiaL.)葉水浸液提高黃芩幼苗SOD、 CAT 活性且降低MDA 含量的結果較一致[25]。 本研究結果顯示，6 g·L-1浸提液下牛蒡MDA 含量和POD 活性最高，其CAT 活性與CK 相比顯著增加，SOD 活性有所增加但與CK 差異不顯著。 戴敏等[26]發現，高濃度Pb 脅迫下牛蒡MDA 含量最大時仍然具有較高的發芽率和保護酶活性，這說明牛蒡的抗氧化系統抵御逆境傷害能力較強。 植物體內存在著許多感受不同逆境信號的受體，參與各種逆境脅迫響應，并形成一個復雜的響應和調控網絡以應對逆境脅迫[27]。 抗氧化酶活性的調節能力是臨時和有限的[28]。 受到脅迫時，植物會誘導體內抗氧化能力的增強，這種適應性的反應只能夠在一定受害程度內發揮作用，當體內氧化產物累積到一定水平時各種酶不能正常發揮作用導致酶活性下降，但不同植物的自身抗氧化酶活性的調節能力和耐受程度不同，受體植物所感受到的化感物質對自身的脅迫程度也不同，從而呈現不同的化感作用。

4 結論

南方紅豆杉浸提液對3 種藥用植物的化感作用強度不同，并且3 種藥用植物所呈現出的化感效應也不同，其對黃芩與牛蒡的化感綜合效應均為正值，其中6 g·L-1濃度對牛蒡的化感綜合效應作用最顯著。 不同濃度南方紅豆杉浸提液會引發紫花苜蓿、黃芩、牛蒡種子萌發和生長過程中體內保護酶和膜脂過氧化產物等物質的變化。 受體植物和化感物質濃度的不同會使其生理代謝物質呈現出不同的化感現象。