外源褪黑素對低溫脅迫下番茄幼苗光合熒光及生化特性的影響

于鄭嬌李書昆褚鵬飛房雨婷王德穎李亞楠吳冰潔

(聊城大學農學與農業工程學院，山東聊城 252000)

溫度是一個影響植物生長發育的重要因素，低溫引起的冷害是植物栽培中經常出現的問題，對植物造成一定的生理危害，減產甚至絕收。 番茄(Lycopersicon esculentum)作為一種喜溫蔬菜在15～35 ℃溫度范圍內均可實現種子萌發和幼苗生長，其同化作用的最適溫度為20 ～30 ℃，10 ℃以下生長緩慢，零下1～2 ℃會被凍死。 番茄生長的最適地溫為20～23 ℃，降到6 ℃時根系停止生長。 番茄如遇連續陰冷天氣，其萌發期和幼果期都會受到低溫脅迫影響，會因光照不足而徒長，引起落花落果、坐果率低，產量下降；遇到低溫，輕者會生長緩慢，苗弱，葉片皺縮，莖和葉均會變紫，或者出現黃白色花斑或呈黃化狀態，嚴重時葉片呈水浸狀，最終會導致全株死亡。 因此，通過提高抗冷性實現番茄增產一直是重要的研究課題。

褪黑素最早在動物體內發現，其研究也是在動物體內進行。 研究發現，褪黑素是一種親脂性的抗氧化劑，具有較強的抗氧化功能，其與自由基間的反應可以消除一定數量的活性氧，當褪黑素大量增加時則可以加速活性氧的消除速度，減少活性氧的產生[1-2]。 目前，關于番茄低溫脅迫的研究主要集中在形態和越冬成活率以及低溫脅迫下抗寒蛋白和信號轉導等各方面，表明低溫下采用ABA(脫落酸)、SA(水楊酸)、CaCl2(氯化鈣溶液)進行預處理，能夠抑制番茄幼苗體內ROS(活性氧)的產生，提高抗氧化酶活性，減少電解質外滲，降低膜脂過氧化水平，保持細胞質膜的完整性，從而降低低溫對番茄幼苗的不利影響，提高幼苗對低溫脅迫的耐受性[3-8]。 目前低溫對番茄生長發育和各項生理指標的影響已有大量研究:陳勝萍等[9]研究表明，低溫脅迫下不同品種番茄各生理指標會有不同程度的變化，而且不同種類番茄在低溫脅迫下生理指標的變化有所不同，主要表現在POD、SOD、CAT 和丙二醛上[10]。 較低的溫度使番茄幼苗產生大量的自由基和活性氧，導致膜脂過氧化，生物膜透性增強，積累大量過氧化產物即丙二醛，而褪黑素有清除自由基和活性氧的作用，能提高抗氧化酶活性，調節植物幼苗體內氧化反應，同時還具有親水和親脂能力，可以在植物細胞內自由活動，以保持番茄幼苗細胞質膜的結構和功能完整性，從而減輕番茄幼苗在逆境中受到的傷害。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試微型番茄品種為Micro-Tom。

外源褪黑素溶液:褪黑素粉劑(純度98%，購于上海麥克林生化科技股份有限公司)用乙醇溶解后再用無菌水配制成所需濃度，分別為50、100 μmol/L 和150 μmol/L。

1.2 試驗設計及處理

1.2.1 番茄幼苗培育選取健康飽滿的Micro-Tom 野生型番茄種子，用75%乙醇浸泡2 min，后用無菌水沖洗3 ～4 次，隨即用3%次氯酸鈉溶液消毒處理，再將種子用無菌水浸泡15 min，用無菌水多次沖洗，徹底除凈種子表面附著的殘留藥液。之后，將種子放進濕潤培養皿中，用濕潤紗布覆蓋后放到光照培養箱中避光室溫條件下催芽生根，待根長至1 ～2 cm 時種入穴盤(32 孔穴，上口徑6.0 cm，底徑2.6 cm，高5.3 cm)中。 穴盤土壤以育苗土和蛭石按1 ∶1混合，濕潤程度以手握成團不滴水為宜，約為田間持水量的50%。 用保鮮膜將穴盤包裹住，保持穴盤中水分不易散失，短期內不用澆水。 三葉一心時將番茄幼苗移入小花盆(上口徑14.8 cm，底徑7.2 cm，高9.8 cm)中，土壤改為腐殖土與蛭石按1 ∶1混合。 整個育苗過程在適宜溫度(20～25 ℃)下的光照培養室(聊城大學農學院植物種質資源創新與利用實驗中心)中進行。

1.2.2 褪黑素以及低溫處理待幼苗長到五葉一心時，于當天下午5 ∶30—6 ∶00 噴施1 次褪黑素，以葉面凝結水滴為準。 每隔24 h 噴施1 次，共噴施3 次。 之后，常溫(25 ℃)環境下放置48 h再移至光照培養箱中進行低溫處理，條件為溫度4 ℃、光強60 μmol/(m2·s)和濕度70%。 試驗共設置5個處理:CK，常溫(25 ℃)+葉面噴施清水，簡稱常溫0；低溫+葉面噴施清水(0 μmol/L 褪黑素溶液)，簡稱低溫0；低溫+葉面噴施50 μmol/L褪黑素溶液，簡稱低溫50；低溫+葉面噴施100 μmol/L 褪黑素溶液，簡稱低溫100；低溫+葉面噴施150 μmol/L 褪黑素溶液，簡稱低溫150。 每處理15 盆，每盆1 株，重復5 次。 每處理選6 株，于低溫處理后第1、2、3、4 天分別進行光合參數和葉綠素熒光參數以及SPAD 值測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 光合參數測定于低溫處理后第1、2、3、4天，將番茄幼苗移至光照下處理30 min，之后選擇完全展開功能葉，利用LCPro-T 便攜式光合作用儀，設定光強600 μmol/(m2·s)，測定葉片凈光合速率(Pn)、胞間二氧化碳濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)。

1.3.2 葉綠素熒光參數測定于低溫處理后第1、2、3、4 天，將番茄幼苗暗處理30 min，隨后使用Handy PEA 熒光儀在弱光下測定葉片初始熒光(Fo)，再用3 000 μmol/(m2·s)紅光強飽和脈沖光激發，使QA 全部處于還原狀態，測得最大熒光值(Fm)[16]。 測出番茄葉片PSⅡ的最大光化學效率Fv/Fm、反應中心吸收的光量子將電子傳遞到電子傳遞鏈中Q-A下游的其它電子受體的概率(φEo)和PSⅠ受體側末端電子受體還原的量子效率(φRo)。

1.3.3 SPAD 值測定于低溫處理后第1、2、3、4天用便攜式SPAD 葉綠素儀測定。 每重復隨機選取4 片葉測定SPAD 值，每片葉至少采15個點，避開葉脈，取其平均值，即為葉片葉綠素相對含量。

適用于不對稱情況的線換相換流器動態相量模型//曾淑云,江全元,陸韶琦,趙敏,徐希望//(11):129

1.3.4 生化指標測定過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創木酚法[17]，過氧化氫酶(CAT)活性測定采用紫外分光光度法[17]，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定用NBT(氮藍四唑)光化學還原法[18]，丙二醛(MDA)含量測定用硫代巴比妥酸法[19]。

1.4 數據處理與分析

采用SigmaPlot 14.0 軟件處理數據和作圖，采用SPSS 16.0 軟件，通過單因素方差分析(oneway ANOVA)和Duncan’s 法進行多重差異顯著性分析(α ＝0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同濃度褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片光合指標的影響

由圖1 看出，與常溫0(CK)相比，低溫處理組番茄葉片的Pn、Gs 顯著下降，Ci 在低溫處理2 d 后顯著上升；連續4 天低溫處理番茄幼苗受凍損傷明顯，Pn、Gs 都呈顯著下降趨勢，Ci 則呈顯著上升趨勢。

圖1 外源褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片Pn、Gs、Ci 的影響

低溫脅迫下不同濃度褪黑素處理對番茄生長影響不同，與低溫0 處理相比，施用褪黑素可以有效緩解低溫脅迫造成的光合抑制。 低溫脅迫第1天，低溫50 處理葉片Pn 比低溫0、低溫100、低溫150 分別高43.25%、44.74%和23.18%(P＜0.05)；而第2 天至第4 天，低溫處理間Pn 差異不顯著。第1 天，低溫50 處理Ci 比低溫0、低溫100、低溫150 分別低17.10%、20.93%和18.42%(P＜0.05)。低溫處理間葉片Gs 差異不顯著。

綜上，低溫處理組中，50 μmol/L 外源褪黑素處理番茄葉片Pn、Gs 高于其它處理，Ci 最低。 因此，該處理可通過保持較高的Gs 和降低Ci 而提高Pn，從而緩解低溫逆境傷害。

2.2 不同濃度褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片葉綠素熒光指標的影響

由圖2A 看出，與常溫0(CK)相比，低溫處理組番茄葉片Fv/Fm 均降低。 低溫處理第1 天，4個低溫處理番茄葉片的最大光化學速率(Fv/Fm)相近，低溫50 處理稍高；第2 天，低溫處理組變幅較大，低溫50 高于低溫0 處理22.50%(P＜0.05)；第3 天、第4 天低溫處理組Fv/Fm 整體大幅下降。

圖2 外源褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片葉綠素熒光指標的影響

圖2B、C 顯示，番茄葉片φEo 值低溫組與CK相比降低，而φRo 值在低溫處理的前兩天升高，第3 天開始除低溫50 處理外也均降低。 低溫處理組番茄葉片φEo 值和φRo 值，整體上以噴施50 μmol/L 褪黑素處理效果最優。 低溫50 處理葉片φEo 值在第2 天分別高于低溫0、低溫150 處理41.50%和31.94%(P＜0.05)。 低溫處理第1 天、第2 天葉片φRo 值，低溫50 處理高于常溫及其余低溫處理組，且在第1 天高于低溫0、低溫100處理21.11%和37.63%(P＜0.05)，而第3 天、第4天低溫50 處理仍然最高，而其它低溫處理則明顯下降，均低于CK。

低溫下外源褪黑素4個濃度處理相比，50 μmol/L 處理番茄葉片的Fv/Fm、φEo 和φRo 均高于其它3個濃度處理。

2.3 不同濃度褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片SPAD 值的影響

由圖3 可知，低溫處理前3 天，50 μmol/L 褪黑素處理的番茄葉片SPAD 值明顯高于常溫0 處理(CK)，但差異不顯著；第4 天，與CK 相近。 低溫處理組間相比較，50 μmol/L 褪黑素處理番茄葉片的SPAD 值要高于其它3個處理，對番茄葉片葉綠素含量的促進效果最優。

2.4 外源褪黑素對低溫脅迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影響

2.4.1 對POD 活性的影響如圖4A 所示，常溫對照番茄幼苗POD 活性基本保持穩定。 前3 天，整體上低溫脅迫組幼苗POD 活性上升，第4 天番茄幼苗受到較大傷害，清除活性氧能力降低，POD活性有所下降。 其中，50 μmol/L 褪黑素處理幼苗POD 活性最高，效果最好；100、150 μmol/L 高濃度褪黑素處理POD 活性降低，但仍顯著高于對照，對提高幼苗低溫脅迫耐受性仍有一定效果。

圖4 外源褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片POD、CAT、SOD 活性的影響

2.4.2 對CAT 活性的影響由圖4B 可知，常溫對照番茄幼苗CAT 活性最高且基本平穩，低溫脅迫下幼苗CAT 活性呈下降趨勢，即低溫處理第1天CAT 活性最高，長時間低溫脅迫使其清除活性氧能力減弱，CAT 活性降低。 各褪黑素濃度處理中，低溫脅迫第1 天至第4 天，50 μmol/L 處理幼苗CAT 活性均最高，提高幼苗低溫脅迫耐受性效果最強，即提高幼苗抗逆性最顯著；褪黑素濃度為100、150 μmol/L 時，CAT 活性逐漸降低，說明過高濃度的褪黑素會抑制CAT 活性。

2.4.3 對SOD 活性的影響由圖4C 可知，隨著低溫脅迫時間延長，番茄幼苗SOD 活性呈先升高后降低趨勢，第2 天時最高，之后降低，清除活性氧能力下降。 4個濃度褪黑素處理幼苗SOD 活性均高于對照，可見噴施褪黑素可以提高低溫脅迫下幼苗SOD 活性。 其中，褪黑素濃度為50 μmol/L時SOD 活性最高，幼苗低溫脅迫耐受性最強，即提高幼苗抗逆性的效果最顯著；褪黑素濃度為100、150 μmol/L 時，其SOD 活性逐漸降低，幼苗抗逆性效果下降。

2.5 外源褪黑素對低溫脅迫下番茄丙二醛含量的影響

由圖5 可知，低溫處理1 天時，各處理番茄幼苗的MDA 含量最低，隨著低溫脅迫時間延長而逐漸升高。 第2 天至第4 天(低溫0)處理幼苗的MDA 含量均較高，各時間點50 μmol/L 褪黑素處理的MDA 含量均最低，濃度增至100、150 μmol/L時幼苗受到高濃度褪黑素的抑制，MDA 含量升高。 由此可見，50 μmol/L 褪黑素處理提高番茄幼苗低溫脅迫耐受性的效果最好，能夠有效減輕低溫對幼苗的傷害。 表明噴施適當濃度的外源褪黑素可有效減輕番茄幼苗低溫脅迫后的膜脂過氧化作用，清除活性氧，維持膜系統結構和功能的完整性，減輕低溫對細胞膜系統的傷害。

圖5 外源褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片MDA 含量的影響

3 討論

褪黑素的首次提取是在牛的松果體中，并且隨即證實它是一種類激素物質。 褪黑素的出現不斷成為學者研究的熱點，無論是在動物還是植物上的研究都被廣泛關注，不斷出現成功應用型案例。 前人研究顯示，50 μmol/L 外源褪黑素處理大豆植株，能顯著促進其生長發育且增產[20]。 向葡萄幼果噴施100 mg/L 褪黑素溶液，能夠促進果實生長和膨大[21]。 噴施適宜濃度的外源褪黑素可以明顯緩解高溫逆境脅迫對黃瓜光合器官造成的損傷[15]。 園藝作物在生物脅迫及非生物脅迫下噴施褪黑素都具有一定程度的抗性調控作用[22]。

溫度是影響園藝作物生長發育最重要的環境因素，尤其是反季節栽培蔬菜的關鍵環境因子。一定濃度的外源褪黑素可以降低光合系統在低溫脅迫下的受損程度[23]。 低溫脅迫對園藝植物尤其是冷敏性植物會產生較大影響，嚴重影響其生長狀態和產量。 馮建燦等[24]研究發現，喜樹葉片在低溫條件下其SPAD 值呈現下降趨勢；馬德華等[25]也發現，低溫條件下黃瓜幼苗葉片SPAD 值也明顯下降；黃偉等[26]認為，低溫處理后，番茄葉片的SPAD 值明顯下降。 低溫不但影響葉綠素的合成，還會造成葉綠素的分解強度加大，光合速率下降[27]。 已有研究表明，低溫脅迫主要抑制PSⅡ的活性，而對PSⅠ的影響相對較小，降低電子傳遞效率[28-29]。 本試驗中，低溫處理組與常溫對照相比，其Pn 和Gs 降低，Ci 值升高，說明非氣孔限制影響番茄葉片的光合作用；低溫脅迫下噴施褪黑素處理的Pn 和Gs 值呈現升高趨勢，而Ci 值則下降，說明褪黑素可緩解低溫對番茄光合作用的影響。 本試驗中，低溫與常溫處理相比，脅迫前兩天番茄葉片SPAD 值差異不顯著，第4 天低溫處理的SPAD 值有所降低；低溫處理組中，50 μmol/L 褪黑素處理的SPAD 值最高，這說明噴施褪黑素可以緩解葉綠素的分解，提高光合速率。

本試驗中，連續低溫導致番茄葉片的最大光化學效率(Fv/Fm)明顯下降，說明低溫引起了番茄葉片的光抑制，而低溫50 處理與低溫0 相比，Fv/Fm 值明顯增加，說明噴施褪黑素可以緩解低溫對番茄葉片的光抑制。 φRo 是指用于還原PSⅠ受體側末端電子受體的量子產額[30]，φEo 則反映了反應中心吸收的光能將電子傳遞到電子傳遞鏈中Q-A下游的其它電子受體的概率[31]。 本試驗中，低溫脅迫第1 天，低溫0 處理φRo 值比常溫對照升高44.83%，后3 天降低，第4 天低溫0 比常溫0 下降18.31%；而φEo 值低溫0 與常溫0 相比，4 天分別降低24.62%、30.76%、40.53%和51.83%(P＜0.05)。這表明低溫對PSⅠ和PSⅡ的電子傳遞產生不同影響，連續低溫抑制PSⅡ的活性，對于PSⅠ呈現后期抑制趨勢，連續低溫對于PSⅡ受體側的傷害更大些。 有研究表明，裉黑素上調PSⅠ反應中心亞基(PsaD、PsaE、PsaF、PsaH 和PsaN)、PSⅡ相關蛋白PsbA(D1)和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶或加氧酶大亞基(RBCL) 和Rubisco 激活酶(RCA)的蛋白[32]。 外源褪黑素通過調控葉黃素循環基因CsVDE與CsVDE的表達來加強葉黃素循環組分的脫環化程度，從而提高調節性能量耗散的占比，減少過多激發能對光系統造成的傷害，進而維護光系統Ⅱ光能利用的最大潛能。 低溫處理2 天后，低溫50 處理比低溫0 的葉綠素熒光指標值均明顯增高，表明適宜濃度褪黑素處理可緩解低溫逆境對番茄幼苗光系統的影響。 褪黑素可提高植物的抗寒性，其在酶、蛋白質、生物小分子水平的作用機理尚不明確。 在遭遇低溫脅迫后，褪黑素還可通過上調冷響應途徑的關鍵轉錄因子CBFs/DREBs 和低溫應答基因COR15a的表達水平，誘導轉錄激活因子CAMTA1、ZAT10 和ZAT12的表達，從而提高擬南芥的冷凍耐受性[33]。 褪黑素可以作為信號分子在逆境脅迫中起重要作用，然而對于植物如何感受褪黑素受體和信號轉導途徑仍未明確，這也將是褪黑素研究的一個重要方向。

包宇等[34]研究表明，對番茄幼苗(大紅番茄“合作903”)進行100 μmol/L 褪黑素預處理之后，其相對電導率和MDA 含量比對照顯著降低，抗氧化酶活性最高，說明該濃度褪黑素對提高番茄幼苗低溫脅迫耐受性的效果最好。 這與本試驗結果不同的原因之一可能為所用番茄品種不同:就番茄特性而言，大紅番茄“合作903”比Micro-Tom 野生型番茄形體大，莖粗葉大，抗氧化活性高，低溫脅迫耐受性較好。 唐鴻呂等[35]的研究表明，甘藍在低溫脅迫24 h 后，各組幼苗表型有明顯變化，主要表現為葉片失水萎蔫；處理48 h 后，噴施外源褪黑素處理可提高抗氧化酶活性和SPAD 值，減少電解質外滲，提高甘藍受冷害后的恢復能力，降低低溫脅迫對甘藍的傷害，幼苗均有所恢復；72 h 低溫脅迫則受到嚴重傷害。 相比較而言，甘藍是耐冷性植物，而番茄為一種冷敏性植物，當溫度低于5℃就會停止生長，長時間低溫脅迫使番茄幼苗受到嚴重傷害，本試驗低溫處理2天時番茄的抗氧化酶活性和丙二醛含量最高。

綜上所述，噴施外源褪黑素能夠有效清除番茄植株細胞內的自由基和活性氧，維持細胞內水分和膜系統功能結構的完整性，從而保持細胞膨壓，增強番茄幼苗低溫脅迫的耐受性，尤以50 μmol/L 褪黑素處理提高幼苗低溫脅迫耐受性的效果最好。

4 結論

本試驗中，3個褪黑素處理相比，低溫脅迫下噴施50 μmol/L 褪黑素處理番茄葉片的凈光合速率(Pn)最高，氣孔導度(Gs)除脅迫第1 天較高外其它時間點也均最高，胞間二氧化碳濃度(Ci)均最低；葉綠素熒光指標中，其最大光化學效率(Fv/Fm)、反應中心吸收的光能將電子傳遞到電子傳遞鏈中Q-A下游的其它電子受體的概率(φEo)和PSⅠ受體側末端電子受體還原的量子效率(φRo) 均最高，SPAD 值也均最高；SOD、POD、CAT 活性也均最高，即能通過提高抗氧化酶活性來調節番茄幼苗體內的氧化反應，提高番茄低溫脅迫的耐受性。 同時，50 μmol/L 褪黑素處理在低溫脅迫2 天時提高幼苗抗逆性的效果最明顯。低溫脅迫下，褪黑素濃度增至100、150 μmol/L時幼苗受到高濃度褪黑素的抑制，提高幼苗抗逆性的效果降低。 隨著低溫脅迫時間延長，過氧化產物丙二醛(MDA)大量積累，噴施50 μmol/L 褪黑素處理番茄幼苗的MDA 含量最低，從而減輕低溫對細胞膜系統的傷害。 以上表明，低溫逆境下噴施50 μmol/L 褪黑素提高番茄抗逆能力的效果最好。