3種地被菊的抗寒生理特性比較

喬謙，朱樂，王江勇*，王璐，賈曦

(1.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2.山東樂惠生態農業發展有限公司，山東 泰安 271000；3.山東省農業科學院，山東 濟南 250100)

菊花(Chrysanthemum)是菊科菊屬多年生宿根草本花卉。作為中國十大傳統名花，深受人們的喜愛[1]。1985年始，陳俊愉院士等人采用小菊與多種野生菊花進行多年雜交，選育便于管理、適宜地栽過冬的地栽菊花品種群，命名為“地被菊”[2]。如今，地被菊新品種已達上千種，主要以東北、華北、西北地區為主，具有花色花型豐富，抗旱性、抗寒性強，植株矮小，覆蓋性好，綠期長等特征，是一種良好地被覆蓋材料與裝飾花卉，在各類園林綠地中廣泛應用，具有良好的觀賞價值與經濟價值[3-4]。

寒害和凍害是北方主要天氣災害，幾乎每年都有不同程度的發生，氣候變化背景下更有加劇的趨勢。低溫脅迫往往伴隨著植物的膜透性、滲透勢、抗氧化酶系統等變化，進而影響植物的生長與發育以及地被菊的產量和品質[5]，導致園林綠地應用地被菊觀賞品質下降，制約城市園林綠化應用，降低經濟效益。隨著城市綠化對四季耐寒地被植物需求的不斷增加，地被菊抗寒品種的選育再次成為了熱點[6]。本文以黃菊1號、紅小與1709品種的地被菊為研究材料，通過人工模擬低溫環境，對比不同低溫處理下各品種地被菊的滲透調節物質、抗氧化酶活性、解剖結構指標等參數，進行抗寒性綜合評定，研究其耐寒性強弱，進行抗寒性綜合評價與篩選，發掘優秀地被菊品種，以期為國內寒冷地區推廣優良地被菊提供科學依據，為進一步研究菊花抗寒性機理、選育抗寒性新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2020年7—8月在山東省果樹研究所金牛山花卉種質資源圃選取長勢良好無病蟲害的黃菊1號、紅小、1709 三個品種的一年生地被菊扦插苗為試驗材料，盡量保證植株生長狀況一致，以保證試驗數據的準確性。

1.2 試驗方法

1.2.1 人工低溫處理

2020年8月上旬，摘取黃菊1號、紅小、1709 三個品種的地被菊健壯植株枝條上第2～4個葉片，每種30～40片并混合均勻，用潮濕紗布包裹，經自來水、蒸餾水、去離子水沖洗去除表面塵土等雜質，用濾紙輕輕吸干葉片上的水分。將每個品種的地被菊葉片平均分成5份，利用低溫恒溫槽/人工氣候箱/冰箱進行低溫處理。先放入冰箱中4 ℃預冷2 h，預冷結束后，共設5個溫度梯度(0、-4、-8、-12、-16 ℃)，每個梯度處理2 h。處理結束放入4 ℃冰箱解凍2 h，解凍后進行解剖結構的觀察與丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量等生理指標的測定，每個處理3次重復。

1.2.2 葉片解剖結構觀察

每個處理取10片解凍后的葉片，剪取該葉片主脈部分，福爾馬林-乙酸-乙醇混合液(FAA液)固定后完成脫水、透明、包埋等制片過程，切片8 μm，番紅-固綠雙重染色，中性樹膠封片并烘干。將制作好的石蠟切片置于LEICA DMLB/熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照，利用 Leica Application Suite 圖像分析軟件測定其主脈直徑、葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、角質膜厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵海比、葉肉組織緊密度和葉肉組織疏松度，所測數據均為15個視野下的平均值，用SPSS軟件對數據進行顯著性分析。

1.2.3 抗寒性生理指標測定方法

相對電導率(relative electric conductivity，REC)采用電導法測定[7]，將葉片避開葉片主脈和葉緣剪成5 mm×5 mm大小，稱取 0.2 g，裝入試管中，加入去離子水 20 mL。試管塞口后置于恒溫振蕩箱充分振蕩 1 h，用電導率儀測量初電導率(S1)。再將試管放入沸水浴中加熱 15 min，冷卻至室溫后測其終電導率(S2)。實驗重復 3 次。

將不同溫度梯度下的各組樣品剪碎混合均勻，準確稱取葉片 0.5 g 置于預冷的研缽中，加入少量石英石和適量液氮，充分研磨后轉入加有5 mL 磷酸緩沖液(50 mmol·L-1，pH值7.8)的離心管中。將離心管置于冷凍離心機中 4 ℃、10 000 r·min-1離心 20 min。所得上清液即為酶液，可用于MDA、可溶性蛋白含量測定和過氧化物酶(peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定。

POD測定采用愈創木酚法，SOD 活性測定采用氮藍四唑法，MDA測定采用BC0025 MDA試劑盒(蘇州科銘)，可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍染色法[8]，3次重復，取平均值進行統計。

1.3 數據分析與處理

根據REC擬合logistic回歸方程確定各植株的半致死溫度。

其中，r為同類中某一指標與其他指標之間的相關系數，n為同類中指標的個數。

采用Excel 2007制表，應用SPSS 22.0(P=0.05)統計分析軟件進行各指標試驗數據顯著性差異分析，運用隸屬函數法，對各指標求得的隸屬值進行累加、取平均數。按照從大到小的順序對各地被菊品種的反隸屬函數平均值進行排序，對3種地被菊進行抗寒性綜合評價。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下3種地被菊的生理指標

2.1.1 低溫脅迫對3種地被菊相對電導率的影響

細胞膜是細胞內部與外部環境之間的分界面，低溫對細胞的影響最先作用于細胞膜，細胞膜透性隨溫度的下降而增加，電解質和一些小分子有機物大量外滲，從而引起相對電導率的上升。在低溫脅迫下3種地被菊REC的變化情況如表1所示。3種地被菊REC的變化趨勢相同，都隨著溫度的降低逐漸升高，但不同品種地被菊的相對電導率變幅不同，總體上看相對電導率均呈“緩慢升高—迅速升高—平穩升高”的“S”型曲線；從0 ℃降至-4 ℃時，1709葉片電導率急劇升高，且高于黃菊1號與紅小，葉片細胞膜受害越嚴重是相對電導率變化幅度越大的主要原因，表明該品種對低溫更敏感，-4 ℃時其細胞膜已被破壞，且被破壞程度遠大于其他品種；在整個低溫脅迫過程中，黃菊1號與紅小的葉片相對電導率較低，初步推測二者抗寒性較強。

表1 低溫脅迫對3種地被菊REC的影響

2.1.2 低溫脅迫下3種地被菊超氧化物歧化酶(SOD)活性變化

由表2可知，隨著溫度的降低，3種地被菊的SOD 活性均呈現先升高后下降的趨勢，以紅小最明顯。紅小和黃菊1號的值大于1709。從0降至-8 ℃時，3種地被菊的 SOD 活性均明顯提高，說明在此期間3種地被菊能迅速產生大量SOD來抵御低溫脅迫，以紅小最明顯，在-12 ℃達到最大值。從-8 ℃降至-12 ℃時，1709的SOD活性轉為下降趨勢，紅小與黃菊1號的SOD活性仍繼續增長，說明-12 ℃已超出1709的低溫耐受限度。

表2 低溫脅迫對3種地被菊葉片SOD活性的影響 單位：U·g-1

2.1.3 低溫脅迫下3種地被菊葉片過氧化物酶(POD)活性變化

隨著脅迫溫度的持續降低，3種地被菊的POD活性均呈先上升后下降的趨勢。從0 ℃降至-8 ℃時，3種地被菊的POD活性均呈上升趨勢，說明POD已開始發揮作用抵御低溫脅迫，黃菊1號和1709在-8 ℃低溫處理下POD活性達到最大值，而紅小在-12 ℃達到最大值，且在整個低溫脅迫過程中，紅小的POD活性平均值最大(表3)。

表3 低溫脅迫對3種地被菊葉片POD活性的影響 單位：U·g-1

2.1.4 低溫脅迫下3種地被菊葉片中丙二醛(MDA)含量變化

低溫脅迫條件下，3種地被菊葉片的MDA含量見表4。由表4可以看出，隨著脅迫溫度的降低，3個品種的地被菊葉片的MDA含量呈現逐漸升高的趨勢，且均在-16 ℃脅迫處理條件下達最大值，整體變化趨勢較為平緩，以1709最明顯。其中-4～-16 ℃脅迫處理條件下黃菊1號葉片MDA含量顯著高于對照，但彼此之間差異不顯著。紅小的MDA含量在-4 ℃脅迫處理條件下與對照差異不明顯，而在-16 ℃脅迫處理下顯著高于對照。

表4 低溫脅迫對3種地被菊葉片MDA含量的影響 單位：nmol·g-1

2.1.5 低溫脅迫下3種地被菊葉片過氧化氫酶(CAT)活性的變化

低溫脅迫條件下，3種地被菊葉片的CAT活性見表 5。隨著脅迫溫度的降低，黃菊1號與1709葉片的CAT活性在0～-8 ℃緩慢升高，在-12 ℃顯著升高(P<0.05)，后又下降；而紅小葉片的CAT活性變化趨勢較為平緩，0～-4 ℃微增，之后呈顯著下降趨勢(P<0.05)。

表5 低溫脅迫對3種地被菊葉片CAT活性的影響 單位：U·g-1

2.1.6 低溫脅迫下3種地被菊可溶性糖含量的變化

低溫處理條件下，3種地被菊葉片可溶性糖含量見表6。由表6可以看出，隨著低溫脅迫程度的增加，3個地被菊品種的可溶性糖含量均呈先增加后降低的趨勢，三者平均可溶性糖差異不大，其中紅小稍高于黃菊1號和1709。黃菊1號葉片的可溶性糖含量在-8 ℃的低溫脅迫處理條件下達最大值；紅小葉片的可溶性糖含量在-12 ℃低溫脅迫處理條件下達最大值；1709地被菊葉片的可溶性糖含量在-8 ℃低溫脅迫處理條件下達最大值；此外，紅小在0～-12 ℃可溶性糖含量持續增加，且含量高于另外兩個品種。

表6 低溫脅迫對3種地被菊葉片可溶性糖含量的影響 單位：mg·g-1

2.1.7 低溫脅迫下3種地被菊可溶性蛋白含量的變化

由表7可以看出，隨著脅迫溫度的降低，3種地被菊的可溶性蛋白含量大致呈先上升后下降趨勢。0 ℃降至-8 ℃時，3種地被菊的可溶性蛋白含量均上升，說明在此低溫脅迫下，3種地被菊均誘導產生了可溶性蛋白來抵御低溫脅迫。但黃菊1號和紅小在-12 ℃達到可溶性蛋白含量最大值，而1709在-8 ℃達到最大值。三者相比，紅小的平均可溶性蛋白含量最高，其次是黃菊1號，1709最小。

表7 低溫脅迫對3種地被菊葉片可溶性蛋白含量的影響 單位：mg·g-1

2.2 葉片解剖結構特征

對3種地被菊葉片表皮及葉肉解剖結構特征等指標進行多重比較(圖1、表8)。葉片表皮是植物葉片表面的一層特殊的保護組織，由一層薄壁細胞緊密排列構成，植物表皮厚度越厚，植物的防損傷性能就越強，3個地被菊品種的葉片厚度平均值為0.254 6 μm，厚度排序為紅小>黃菊1號>1709，3個品種間差異顯著。紅小角質層最厚，為0.003 2 μm；黃菊1號和1709角質層厚度為0.003 1 μm。3個品種上表皮厚度均大于下表皮厚度。其中黃菊1號上表皮最厚，紅小上表皮最薄。黃菊1號下表皮最厚，紅小下表皮最薄。柵欄組織厚度依次為：紅小>1709>黃菊1號。紅小海綿組織最厚，1709最薄。柵海比依次為：1709>黃菊1號>紅小。細胞結構緊密度排序與柵海比一致。細胞結構疏松度依次為：紅小>黃菊1號>1709。

圖1 3種地被菊葉片解剖結構

表8 3個地被菊品種葉片解剖結構指標及多重比較

2.3 利用隸屬函數法進行抗寒性綜合評定

2.3.1 3種地被菊葉片半致死溫度(LT50)分析

通過低溫處理下的相對電導率變化曲線結合logistic方程，擬合出紅小、黃菊1號與 1709的拐點溫度來表示半致死溫度見表 9。由表9可知，紅小、黃菊1號與1709的半致死溫度分別為-5.124、-3.631、-3.408 ℃。半致死溫度越低，說明其忍耐低溫的能力越強；反之則耐低溫能力較弱，根據半致死溫度分析，3種地被菊的抗寒性強弱順序為：紅小>黃菊1號>1709。

2.3.2 3種地被菊葉片各指標隸屬度平均值及抗寒性綜合性評價分析

針對SOD、POD、MDA、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量與相對電導率等生理指標，采用隸屬函數法對黃菊1號、紅小與1709的抗寒性進行評價，結果如表10所示。紅小隸屬函數值最大，為0.572；1709隸屬函數值最小，為0.366。因此，抗寒性由強到弱的排列順序為：紅小>黃菊1號>1709。

表10 3個地被菊各指標隸屬度平均值及抗寒性綜合性評價

2.3.3 3種地被菊葉片解剖結構指標的隸屬函數分析

利用隸屬函數法對10 個解剖結構指標進行抗寒性綜合評價，評價結果見表11，結果表明，與低溫半致死溫度判斷結果一致，抗寒性由強到弱的排列順序為：紅小>黃菊1號>1709。

表11 葉片解剖結構隸屬函數值

3 結論與討論

3.1 滲透調節物質對低溫的響應

細胞膜是細胞內部與外部環境之間的分界面，其重要功能之一是使植物細胞與外界環境隔離，保持細胞內部環境相對穩定性，起著重要的屏障作用，行使細胞與外界環境的物質交換和信息傳遞功能[9-10]。當植物受到低溫脅迫時，細胞膜最先感知低溫刺激，并且作出反應。低溫脅迫對細胞的影響最先作用于細胞膜，細胞膜透性隨溫度下降而增加，電解質和一些小分子有機物大量外滲，從而引起相對電導率的上升[11]。劉大林[12]研究發現，隨低溫持續時間的延長，番石榴的電滲率急劇增大，說明長時間的持續低溫使膜透性增大，造成凍害；相對電導率可在一定程度上反映植物品種間抗寒性的強弱，抗寒性強的品種(品系)質膜的穩定性大于抗寒性弱的品種(系)，陳禹興等[13]研究發現，冬小麥隨著低溫脅迫的加劇，細胞膜透性增大，相對電導率也相應增加，這與本研究結果一致。

低溫脅迫下，自由基和活性氧含量的增加導致膜脂過氧化加劇從而能對細胞膜系統造成損傷[14]。有研究表明，膜脂過氧化的中間產物丙二醛可以抑制細胞保護酶活性并且降低抗氧化物的含量，從而加劇膜脂過氧化，破壞細胞膜結構和功能[15]。MDA 含量越高，膜脂過氧化程度越高，說明膜受傷越嚴重，徐田軍等[16]研究發現，隨低溫脅迫時間的延長，玉米葉片中 MDA 含量呈增加趨勢。低溫脅迫下，白三葉葉片中丙二醛含量隨著溫度的降低呈先升髙后降低趨勢[17]，相對電導率隨溫度降低逐漸增加，與本研究中的趨勢一致：隨著脅迫溫度的降低，3個品種的地被菊葉片的 MDA 含量呈現逐漸升高的趨勢，說明隨著脅迫溫度的不斷降低，其膜脂過氧化程度逐漸加重，當丙二醛含量積累到一定程度時，相對電導率顯著上升，且 LT50越低的植物，其葉片 MDA 含量增加的幅度越小。這與前人在紅掌[18]、柑橘[19]等植物上的研究結果一致。

可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內重要的滲透調節物，有研究表明，在低溫條件下，植物可通過滲透調節作用減輕傷害[20-21]。大量研究表明，可溶性糖含量與植物抗寒性呈正相關，抗寒性越強，可溶性糖含量越高[22-23]。本研究結果也證明了這一點。本研究還發現，隨著脅迫溫度的降低，3種地被菊的可溶性蛋白含量大致呈先上升后下降趨勢，且三者相比紅小的平均可溶性蛋白含量最高，這與曾雯[24]的研究結果一致，可溶性蛋白作為另外一種滲透調節物質，其含量的增加會促進下游物質合成，為植物響應低溫脅迫提供必需的物質和能量，同時也可以促進細胞外代謝活動的變化，從而恢復生物合成和碳水化合物代謝平衡，所以可溶性蛋白含量與抗寒性呈正相關。

3.2 抗氧化酶活性對低溫的響應

超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)是植物酶促防御系統中的主要抗氧化酶，能在一定程度上抵御低溫對植物產生的傷害。SOD是酶促防御系統中的第一道防線，SOD能夠清除活性氧，使其生成氧氣與過氧化氫，再通過 CAT與POD分解過氧化氫，從而保護細胞免受活性氧的傷害[25]。POD 在系統中的主要作用是酶促降解 H2O2，將其分解成氧氣(O2)和水(H2O)，避免細胞膜發生膜脂過氧化。隨低溫脅迫時間的延長，植物葉片細胞膜的傷害越大，葉片中抗氧化酶活性均表現為先升高后降低的變化規律，抗寒性強的植物品種在低溫條件下具有較高的過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性以及較穩定的過氧化物酶活性，清除自由基能力較強[26]。在本試驗中，低溫脅迫初期，3個地被菊品種的 SOD 和 POD 活性大幅度上升，說明此時的低溫脅迫誘導 SOD 和 POD 活性迅速增強，以保護各植物不受傷害，當脅迫溫度超過植物耐受限度后，SOD 和 POD 活性轉為下降趨勢，說明此時的重度低溫脅迫抑制了 SOD 和 POD 活性，對植物體造成了傷害，這與前人在用茄子[27]和花生[28]上的研究結果一致。但抗寒性最強的地被菊品種紅小的POD活性高于其他品種，SOD活性低于黃菊1號，說明單一的生理指標不能對植物的抗寒性強弱進行準確描述，通過對多個指標進行綜合分析后得出植物抗旱性的評價，才更加客觀準確。

3.3 解剖結構對低溫的響應

葉片是植物光合作用和蒸騰作用的主要器官，葉片解剖結構能夠反映植物對環境變化的響應[29-30]。有關研究發現，植物受到低溫脅迫時，通過改變相應結構來應對低溫傷害，降低能量消耗，增強對低溫環境的適應性。植物受到低溫脅迫后，外部形態發生顯而易見的變化，葉片組織結構作為生態適應指標與植物的抗寒性有著密切關系。生理生化指標易受環境的改變而表現出不同的變化，但形態和解剖結構是長期特定環境條件下適應性形成的結果，不會因環境因子的改變而發生較大的變化，能體現植物對生態條件的長期適應特點[31]。因此，在抗寒性研究中，形態解剖結構特征被作為一個重要的參考指標。葉片是植物能夠敏銳感應環境變化的器官之一，經過自然條件篩選，植物葉片的解剖結構和外部結構在一定程度上能夠反映植物對環境變化的響應[32-33]。葉片總厚度、柵欄組織厚度或海綿組織厚度往往會隨低溫脅迫而發生改變。唐立紅等[34]研究發現，紫斑牡丹葉片的表皮厚度、角質膜厚度、葉脈突起度、葉片組織結構緊密度與抗寒性呈正相關，葉片組織結構疏松度與抗寒性呈負相關，其中表皮厚度、葉片結構緊密度和疏松度隨溫度的降低會發生變化，以主動適應低溫環境。研究表明，葉片越厚，角質層越厚，植物的抗寒性越強[35-36]，這與本研究結果基本一致。

本研究從7項生理指標隸屬函數角度和3項葉片結構指標隸屬函數角度分析了3種地被菊的抗寒性，綜合判斷抗寒性，結果表明，紅小、 黃菊1號與1709地被菊品種中，紅小抗寒性最強，可在我國寒冷地區大范圍進行推廣。