金針菇蛋白源抗氧化肽精準制備條件優化

張玉，李雪，王偉，白麗萍，王君虹

(1.浙江省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所，浙江 杭州 310021；2.農業農村部農產品信息溯源重點實驗室，浙江 杭州 310021；3.浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310021)

金針菇(Flammulinavelutipes)學名毛柄金錢菌，為擔子菌綱、傘菌目、口蘑科、金錢菌屬[1]。金針菇營養豐富，富含蛋白質、維生素、膳食纖維等多種營養成分以及多糖、多酚、萜類等生物活性成分，具有抵抗衰老、降血脂、提高人體免疫力、抗腫瘤等多種生理功能[2-7]。

近年來，對于金針菇中營養成分提取和利用方面的研究越來越受到重視，但主要集中在金針菇多糖提取鑒定以及功能活性方面[7-9]。對于金針菇蛋白的精準利用研究報道較少。金針菇富含蛋白，蛋白質含量占干物質的31%，含有17種人體所需要的氨基酸，其中8種必需氨基酸，占金針菇氨基酸總量的49.29%～51.17%[10]。

生物活性肽是氨基酸以不同組成和排列方式構成的多肽，可以通過酶解食物蛋白質獲得，有研究發現多肽具有抗氧化、降血糖、抗炎等生理活性[11-15]，目前對于金針菇蛋白的開發利用研究主要是以氨基酸含量、可溶性固形物得率或多肽得率為評價指標[16-18]。本研究以抑制羥自由基能力為評價指標，通過響應面法優化金針菇蛋白肽酶解制備條件，建立金針菇蛋白源抗氧化肽最佳制備技術，可為金針菇的高值化利用及抗氧化肽的制備提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇，購于杭州農貿市場；酸性蛋白酶(100 U·mg-1)，上海鼎芬化學科技有限公司；堿性蛋白酶(100 U·mg-1)，上海如吉生物科技發展有限公司；中性蛋白酶(100 U·mg-1)、木瓜蛋白酶(800 U·mg-1)和胃蛋白酶(30 U·mg-1)，上海源葉生物科技有限公司；羥自由基測定試劑盒和總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒購自南京建成生物科技公司。

1.2 儀器與設備

分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司；紫外分光光度計，美國Perkin Elmer 公司；MTYK-MI805 pH計，北京中慧天誠科技有限公司；HZQ-B恒溫培養搖床，蘇州威爾實驗用品有限公司；HH-4 數顯單列四孔水浴鍋，金壇市盛藍儀器制造有限公司；H-1650 型高速離心機，長沙湘儀離心機有限公司；冷凍干燥儀，FD-A10N-50上海皓莊儀器有限公司。

1.3 金針菇肽的制備

金針菇蛋白提取：采用堿溶酸沉法提取金針菇蛋白，稱取一定量金針菇干粉，按質量比1∶20加0.5%的氫氧化鈉溶液，50 ℃超聲60 min，4 000 r·min-1離心15 min，棄去沉淀，上清液以HCl溶液調pH值至4.5，離心，去除上清液，沉淀調節pH值至7，真空冷凍干燥，得金針菇蛋白。

金針菇蛋白酶解肽制備：稱取5.0 g的金針菇蛋白粉于150 mL錐形瓶中，以水底比15 mL·g-1加入蒸餾水攪拌混勻，至酶的最適pH值(酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶pH值分別為3、9、7、6、2)后，加入3%的蛋白酶混合均勻，放入搖床中以150 r·min-1的轉速酶解4 h，酶解溫度酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶分別為40、45、45、55、37 ℃，酶解過程中保持pH值穩定。酶解結束后，沸水浴5 min使酶失活，冷卻至室溫，調節pH值至7.0，4 000 r·min-1離心20 min，取上清液真空冷凍干燥后，配成5.0 mg·mL-1溶液，待測活性。

1.4 抗氧化能力的測定

抑制羥自由基能力和總抗氧化能力(T-AOC)測定采用試劑盒法，具體按試劑盒給出的測定步驟進行。

1.5 單因素酶解條件優化

以酶底比3%、水底比15 mL·g-1、酶解溫度45 ℃、酶解體系pH值9.0、酶解時間4 h為基本固定因素，改變其中1個因素，進行單因素試驗，比較不同酶解條件對蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響。各因素梯度設計為：酶底比(1%、2%、3%、4%、5%)，水底比(10、15、20、25、30 mL·g-1)，酶解溫度(25、35、45、55、65 ℃)，酶解體系pH值(7、8、9、10、11)，酶解時間(2、3、4、5、6 h)。

1.6 響應面分析試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇酶解溫度、pH值、時間作為待優化因子，按中心組合試驗設計(CCD)原理，采用Design Experts 8.0軟件進行3因素5水平的響應面試驗設計，優化金針菇蛋白的酶解條件。以抑制羥自由基能力作為響應值，試驗因子水平如表1。

表1 響應面分析因素與水平

1.7 數據統計分析

實驗重復3次，數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶選擇

不同蛋白酶的酶切專一性不同，所得酶解肽段不同，不同肽段的活性也有所差異。選擇酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以酶底比3%，水底比15 mL·g-1，在最適pH 值和溫度條件下，酶解4 h。結果表明，不同蛋白酶酶解產物的抑制羥自由基能力不同，經堿性蛋白酶酶解所得金針菇蛋白肽的抑制羥自由基能力最高(圖1)，因此，選擇堿性蛋白酶作為金針菇蛋白原抗氧化肽制備的蛋白酶。

同系列柱上無相同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖1 不同蛋白酶對金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶底比對蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響

分別以酶底比1%、2%、3%、4%和5%對金針菇蛋白進行酶解，考察酶底比對金針菇蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響，結果如圖2所示。當酶底比為1%～3%時，隨著酶底比的增加，蛋白酶解肽的抑制羥自由基能力上升，酶底比至3%以后，抑制羥自由基能力變化趨于平緩，不同酶底比之間差異不顯著(P<0.05)，可能是由于蛋白濃度固定，3%的酶已達到飽和，進一步增加酶，對反應速率影響變小，所以選擇酶底比3%作為適宜酶濃度。

圖2 酶底比對金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.2.2 水底比對蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響

分別以水底比10、15、20、25和30 mL·g-1對金針菇蛋白進行酶解，考察不同水底比對金針菇蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響，結果如圖3所示。當水底比為10 mL·g-1的時候，所得蛋白酶解肽抑制羥自由基能力相對較低，水底比為15 mL·g-1時所得蛋白酶解肽抑制羥自由基能力提高，而后隨著水底比增加，所得蛋白酶解肽的抑制羥自由基能力差異不顯著(P<0.05)，可能是水底比為10 mL·g-1時，蛋白濃度過高，影響酶和底物的接觸，當水底比達到15 mL·g-1時，酶和底物接觸良好，再增加水對其影響較少，故選擇水底比為15 mL·g-1作為適宜酶解條件。

圖3 水底比對金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.2.3 酶解溫度對蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響

溫度是影響酶活性的重要因素，當溫度升高時，酶促反應速率加快，而當超過一定溫度后，酶受熱變性，其活力減弱，則酶促反應速率降低。分別以酶解溫度25、35、45、55和65 ℃對金針菇蛋白進行酶解，考察不同溫度對金針菇蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響，結果如圖4所示，隨著酶解溫度的升高，蛋白酶解肽的抑制羥自由基能力呈先上升后下降的趨勢，45 ℃下所得蛋白酶解肽抑制羥自由基能力最高，與其他溫度差異顯著(P<0.05)，所以選擇45 ℃作為適宜酶解溫度。

圖4 酶解溫度對金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.2.4 pH值對酶解肽抑制羥自由基能力的影響

pH值能通過影響底物分子和酶分子的解離狀態，進而影響酶與底物的結合，影響酶解速率，不同的酶具有不同的最適pH值。分別以酶解體系pH值7、8、9、10和11對金針菇蛋白進行酶解，考察不同pH值對金針菇蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響，結果如圖5所示。當pH值為8時，所得金針菇蛋白酶解肽的抑制羥自由基能力最高，與pH值為7時差異顯著(P<0.05)，因此，選擇pH值8為適宜酶解條件。

圖5 pH值對金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.2.5 酶解時間對酶解肽抑制羥自由基能力的影響

分別以酶解時間2、3、4、5和6 h對金針菇蛋白進行酶解，考察不同酶解時間對金針菇蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響，結果如圖6所示。隨著酶解時間的增加，蛋白酶解肽抑制羥自由基能力呈先上升后下降的趨勢，在4 h時達到最高，與酶解3 h差異顯著(P<0.05)，而后有所下降，可能是因為隨著酶解時間的增加，一些具有活性的肽進一步被水解，因此，選擇4 h為適宜酶解時間。

圖6 酶解時間對金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.3 響應面分析方法

在實際酶解過程中，各因素相互之間可能會存在互作影響，根據單因素實驗，水底比和酶底比達到一定程度后對酶解產物的影響不顯著，且水底比過高，對于后續干燥工藝將增加較高成本，因此，選擇酶解溫度、pH值和酶解時間為試驗因子，進一步考察各因素之間對目標值的相互影響，按照中心點組合試驗設計的統計學要求，設計了20組試驗來擬合相應曲面的各點，試驗的因素和水平設計見表2。利用Design Experts軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，獲得抑制羥自由基能力與A(酶解溫度)、B(pH值)和C(酶解時間)之間的二次多項式回歸方程為：Y=71.41-0.73A+3.35B+1.11C-0.76AB-0.96AC-0.56BC-6.58A2-5.22B2-3.86C2(R2=0.989 5)

表2 響應面設計方案和試驗結果

由表3的方差分析結果可知，所得回歸模型的F值為104.59，P<0.000 1，說明回歸模型具有高度的顯著性，失擬項P值為0.204 9，表明該模型失擬不顯著，回歸方程模型與實際試驗擬合性好，可靠性較高，可以用此模型對金針菇蛋白酶解效果進行分析及預測。酶解溫度和酶解時間的交互作用顯著，表明適當的調整酶解溫度和時間，有助于所得活性肽抑制羥自由基能力的提高。各因素相互影響曲面圖和等高線圖見圖7，結果顯示，本研究的目標最高值在中心點附近，中心點設置合理。

圖7 響應面圖和等高線圖

表3 響應面回歸模型的方差分析結果

經Design Experts分析，所得模型最佳酶解條件為A(酶解溫度)=-0.08，B(pH值)=0.32，C(酶解時間)=0.13，所對應的實際條件為酶解溫度為44.2 ℃，pH值為8.32，酶解時間4.13 h，水底比15 mL·g-1、酶底比3%，模型預測此條件下所得酶解產物抑制羥自由基能力為72.0 U·mL-1。為驗證模型預測值的可靠性，在所得最佳條件下進行驗證試驗，所得酶解肽抑制羥自由基能力為72.9 U·mL-1。說明此響應面分析法優化所得參數條件準確可靠。

3 討論與結論

羥基自由基和超氧陰離子等自由基都是通過不同的代謝反應產生的，在信號轉導中發揮重要作用，但過量的自由基可與生物大分子發生反應，導致細胞損傷，引發多種健康問題[19-21]。抗氧化劑可通過向自由基提供電子，清除過多的自由基[22]。由于合成抗氧化劑具有一定的毒性，隨著人們對健康的關注，天然抗氧化劑已成為研究熱點，目前已從動植物中獲得了多種抗氧化肽[20-23]。金針菇富含蛋白，目前對金針菇及金針菇蛋白酶解工藝已有部分研究，李桂峰等[15]通過響應面法對金針菇蛋白酶解制備抑菌肽的工藝進行了優化，林群英等[18]以可溶性固性物的得率為評價指標，優化了金針菇酶解條件，并研究了最終酶解物對線蟲氧化應激能力的影響，該研究所用材料為金針菇，所得酶解產物成分復雜，產物凍干粉中蛋白含量僅為24.35%。本研究以金針菇蛋白為原料，研究金針菇蛋白制備抗氧化肽的最佳條件，由于不同蛋白酶的底物特異性不同，酶解蛋白所得的產物也就不同，因此，實驗以酶解所得肽的抑制羥自由基能力為評價指標，對酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶進行篩選，結果顯示，堿性蛋白酶酶解所得蛋白酶解肽抑制羥自由基能力最佳。因此，選擇堿性蛋白酶通過單因素實驗進一步對酶底比、酶解溫度、時間、pH值和水底比等酶解條件進行優化，得到最佳單因素條件為酶解溫度45 ℃，pH值8，酶解時間4 h，酶底比3%，水底比15 mL·g-1。

由于不同酶解工藝參數之間可能會存在交互作用，響應面分析法是利用合理的試驗設計方法，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析預測最優參數，它具有預測準確、精度高等優點，已在動植物源蛋白酶解肽制備研究方面進行了一定的應用[16，24-25]，本實驗在單因素的基礎上進一步通過響應面優化法對酶解溫度、酶解時間、酶解pH值進行優化，實現所得酶解肽的抗氧化活性最大化。所得最佳酶解實際條件為：堿性蛋白酶，酶解溫度44.2 ℃，pH值8.32，酶解時間4.13 h，酶底比3%，水底比15 mL·g-1。對此最佳實驗條件下所得金針菇蛋白酶解肽進行活性測定，其抑制羥自由基能力與預測值具有較高的吻合度，說明該模型具有較好的預測準確性，可用于金針菇蛋白源抗氧化肽的制備工藝優化。所得金針菇蛋白酶解肽在5.0 mg·mL-1時，抑制羥自由基能力為72.9 U·mL-1，總抗氧化能力為9.6 U·mL-1，具有較好的抗氧化能力，因此，經蛋白酶消化后的金針菇蛋白具有更廣闊高附加值應用前景，所得的最佳酶解工藝可為金針菇蛋白精深加工及高值化利用提供一定的研究基礎。