基于UPLC法的甘參復方指紋圖譜研究

洪 博, 李美謙, 劉 軍, 郭麗娜, 王艷萍,李文靜*

1.黑龍江中醫藥大學藥學院,哈爾濱 150000;2. 齊齊哈爾醫學院藥學院,齊齊哈爾 161006

肝纖維化是由多種原因引起的慢性肝損傷所致的病理改變,在中醫學中屬“臌脹”“脅痛”“積聚”“黃疸”等病證范疇,是慢性肝病發展到肝硬化的必經階段,也是導致肝癌的重要原因[1-2]。肝纖維化無法自行痊愈,肝纖維化患者預后的差別很大,主要取決于發病初期是否得到有效控制。若經過規范治療,如脂肪肝逆轉、病毒被根除和停用肝毒性藥物等,病因被去除,肝纖維化病情可長期保持穩定,甚至逆轉[3-4]。若患者慢性肝損傷持續存在,病情逐漸進展,數年至數十年后可進展為肝硬化,最終導致死亡。目前對肝纖維化的診治雖然取得了一些進展,但是抗肝纖維化的藥物仍處于缺乏狀態。因此,找到能逆轉肝纖維化且毒性和不良反應小的藥物是目前科研工作者的重要研究方向,中醫藥在逆轉肝纖維化及抑制肝纖維化進展方面具有顯著的優勢[5-8]。甘參復方(GSC)[9-10]是由甘草和丹參配伍組成的方劑,以丹酚酸與甘草酸為主要藥效指標[10],該方具有多成分、多靶點和多通路的特征,臨床應用較為廣泛,目前研究已證實GSC可用于治療肝纖維化,且治療效果明顯,能很好地將中藥復方傳統藥理學與現代藥理學相結合[11]。近年來,對于GSC的質量控制研究主要集中于對各個藥材活性成分的檢測,較多集中在對其藥理作用機制、提取工藝的研究和含量測定等方面[12],尚未見有關建立GSC指紋圖譜的研究報道。由于中藥復方的化學成分復雜,且復方質量與各味藥材的產地、批次等因素有關,故需要建立能反映GSC化學成分整體性、系統性的質量控制方法。因此,本文用超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography,UPLC),建立12批GSC的指紋圖譜以評價其整體質量,為GSC的質量控制研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SHIMADZU LC-30AD型超高效液相色譜儀(日本島津公司);METTLER TOLEDO精密天平(0.01 mg,瑞士蘇黎世的梅特勒-托利多集團);KH-500DE型數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司);TGL-18C-C型臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠);SCT型數顯攪拌電熱套(菏澤市精科儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品:丹參素(批號180328,質量分數≥98%)、芍藥內酯苷(批號160516,質量分數≥98%)、芍藥苷(批號160524,質量分數≥98%)、芹糖甘草苷(批號160916,質量分數≥98%)、甘草苷(批號161201,質量分數≥98%)、迷迭香酸(批號181018,質量分數≥98%)、丹酚酸B(批號181008,質量分數≥98%)、苯甲酰芍藥苷(批號160517,質量分數≥98%)、甘草酸(批號160602,質量分數≥98%)、二氫丹參酮Ⅰ(批號181019,質量分數≥98%),均購自北京萊耀生物科技有限公司;隱丹參酮(批號110852-201807,質量分數≥98%)、丹參酮Ⅰ(批號110867-201607,質量分數≥98%)、丹參酮ⅡA(批號110766-201721,質量分數≥98%),均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈(色譜純,瑞典Oceanpak公司);磷酸(色譜純,天津科密歐化學試劑有限公司);乙醇(分析純,天津富宇精細化工有限公司);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

藥材均購自其道地產地或主產區(甘草產自新疆,丹參產自四川),經齊齊哈爾醫學院藥學院郭麗娜教授鑒定,丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge. 的干燥根和根莖,甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根和根莖。12批GSC分別為S1(20210901)、S2(20210902)、S3(20210903)、S4(20210904)、S5(20210905)、S6(20210906)、S7(20210907)、S8(20210908)、S9(20210909)、S10(20210910)、S11(20210911)、S12(20210912)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters T3-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。流動相為乙腈(A)-0.5 mL·L- 1磷酸水(B)溶液,梯度洗脫:0～10 min,10%～20%A;10～20 min,20%～24%A;20～35 min,24%～48%A;35～45 min,48%～80%A;45～50 min,80%～90%A;50～60 min,90%～10%A。柱溫為40 ℃;流速為0.3 mL·min-1;進樣量為5 μL;檢測波長為240 nm。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取粉碎后的甘草和丹參各5.0 g,置于250 mL 燒瓶中,用10倍量的體積分數50%的乙醇提取2次,在60 ℃每次提取1.5 h,搖勻,濾過,合并2次濾液置于另一個250 mL 燒瓶中,減壓濃縮,將濃縮液置于100 mL量瓶中,定容,過0.22 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1精密度實驗 取同一批次GSC供試品溶液(S1),按2.1項下色譜條件連續進樣6次,記錄色譜圖,計算得各共有峰的相對保留時間RSD值均<0.7%,相對峰面積的RSD值均<0.5%,表明儀器的精密度良好。

2.3.2重復性實驗 取GSC供試品溶液(S1)6份,按照2.2項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件進樣測定,計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.06%～0.96%、0.39%～1.88%,表明該方法的重復性良好。

2.3.3穩定性實驗 取GSC供試品溶液(S1),分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣測定,記錄色譜圖,計算得各共有峰相對保留時間的RSD值均<0.04%,相對峰面積的RSD值均<0.72%,表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價

取12批GSC樣品,按照2.2項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012年版)”,用中位數法生成對照圖譜,經多點校正后進行色譜峰匹配,生成疊加圖譜,結果見圖1。共標定32個共有峰,其中23號峰(甘草酸)峰形對稱、分離度好、峰面積大,因此選其作為參照峰(S峰),計算相對保留時間和相對峰面積,結果見表1、表2。計算12批GSC樣品圖譜相似度。計算得12批樣品對照圖譜相似度均在0.98以上,結果見表3,表明所建立的GSC指紋圖譜穩定,不同批次藥材的主要化學成分基本一致,可以反映其指紋特征、綜合評價GSC的整體質量。

注:1.丹參素;2.芍藥內酯苷;3.芍藥苷;6.芹糖甘草苷;11.甘草苷;13.迷迭香酸;14.丹酚酸B;19.苯甲酰芍藥苷;23.甘草酸;24.二氫丹參酮Ⅰ;26.隱丹參酮;30.丹參酮Ⅰ;32.丹參酮ⅡA;R為對照指紋圖譜;其他數字表示的色譜峰未鑒定出。

表1 共有峰的相對保留時間

表2 共有峰的相對峰面積

表3 相似度評價的結果

2.5 聚類分析

將12批GSC樣品中32個共有峰的峰面積導入SPSS 24.0軟件,用離差平均和法,測量區間為平方歐氏距離,以12批樣品的共有峰的相對峰面積為變量進行聚類分析,聚類結果見圖2。當平方歐氏距離為15時,可將12批標準湯劑樣品分為3類,其中S9為一類,S8、S10聚為一類,S1～S7、S11、S12聚為一類,結果表明不同批號的GSC質量存在一定的差異。

圖2 12批甘參復方樣品的聚類分析

2.6 主成分分析(PCA)

用SPSS 24.0軟件,以32個共有峰的峰面積作為變量,將12批樣品進行主成分分析(principle component analysis,PCA)。通過降維因子分析,計算特征值、累積方差貢獻率,結果見表4。不同產地的樣品中前6個成分的累積方差貢獻率為92.955%,可基本反映樣品的主要信息。用SIMCA-P 14.1軟件繪制12批不同產地甘參復方樣品的主成分得分圖,見圖3。由圖3可知,12批不同產地GSC樣品明顯分布于3個區域,均可將樣品分為3類,與聚類分析結果一致。

圖3 GSC樣品的主成分分析

表4 不同產地GSC樣品的主成分特征值及方差貢獻率

2.7 偏最小二乘法判別分析

在主成分分析的基礎上,為了更深入地探究不同產地間GSC樣品的差異,本研究進一步用偏最小二乘法對12批樣品進行比較。結果見圖4。結果顯示R2X和R2Y分別為0.782、0.975,預測能力參數Q2為0.777,表明建立的模型預測能力較好,且3類間離散趨勢較為明顯,與上述的聚類分析和主成分分析結果一致,表明不同產地的樣品質量存在差異。

圖4 偏最小二乘法判別分析圖

3 討論

中成藥的質量不穩定是中藥現代化研究中必須要解決的重大問題之一,由于海拔、氣候、光照、降雨量及土壤等自然環境的影響,使同一種中藥材中的有效成分差別很大。藥材的質量直接關系到中藥方劑的質量和療效,《神農本草經》在序錄中記載:“土地所出,真偽新陳,并各有法”;陶弘景在《本草經集注》中指出:“諸藥所生,皆有境界”,并列出40多種中藥材生于何地、何種土壤者良,現代研究將指紋圖譜引入中藥及其方劑的質量研究中。

本實驗用指紋圖譜研究由新疆的甘草和四川的丹參組成的GSC,建立了GSC的指紋圖譜分析方法,可為GSC制劑質量標準的建立奠定基礎。指紋圖譜結果表明,12批樣品的指紋圖譜相似度均在0.98以上,相似度較高,且儀器的精密度、方法的重復性和穩定性均較好,表明所建立的GSC指紋圖譜分析方法穩定、可靠。12批樣品中各成分色譜峰的峰面積略有差別,表明不同批次的GSC中主要成分含量有一定差異,因此,非常有必要制定更加嚴格的標準進行方劑的質量控制。本文后期的研究方向是建立GSC的含量測定方法,對不同批號的GSC中的主要活性成分的含量進行研究,進一步完善GSC的質量標準。

由于本實驗研究成分較多,各成分在不同條件下各有優劣,綜合各方面因素考慮進行分析條件的確定。本實驗首先考察了不同體積分數(30%、50%、75%、100%)的乙醇對GSC有效成分提取的影響,結果表明,用體積分數為50%的乙醇提取效果較好。指紋圖譜測定色譜條件分別考察了乙腈-水、甲醇-水系統,并加入磷酸或甲酸進行調節,最終確定用乙腈-5 mL·L- 1磷酸水系統進行分離,所得各成分色譜圖峰形較好、基線穩定。