陜西產艾葉中非揮發性成分的初步分析

王 昆,馬如龍,王云會,張麗華,王春柳,蘇同生*

1.陜西省中醫醫院,西安 710003;2.西安醫學院,西安 710003;3.陜西省中醫藥研究院,西安 710003

艾葉(ArtemisiaargyiLevl. et Vant.),又名冰臺、遏草、香艾、灸草等[1]。艾葉以全草入藥,具有祛濕止血、驅寒溫經、止咳消炎、防蚊驅蟲等作用[2]。現代研究表明,艾葉含有香豆素、糖苷、黃酮、甾醇、萜類化合物、揮發油等[3],具有活血、抗氧化、抗誘變、抗炎、抗癌、抗菌及調節免疫等生物活性[4-5],其中黃酮類、香豆素類等非揮發性成分的藥理活性也值得關注。

隨著人們保健意識的提高,艾灸作為新興的保健項目,近年來在健康消費和美容消費市場上日益成為熱點,市場潛力巨大[6]。目前我國艾草產業發展處于極不平衡的狀態,湖北蘄春和河南南陽區域產的艾草品牌度較高,供不應求,因此全國多地區也在積極開展優秀品種的種植、培育工作,以期能盡快擴大艾葉產區,盡早滿足市場需求[7]。雖然艾葉的質量控制方法在逐漸提高,但目前2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)中尚無對艾葉非揮發性成分的質量控制內容[1],因此開展相關內容的研究具有一定的實踐意義。

本文擬針對陜西產艾葉中非揮發性成分建立高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)指紋圖譜分析方法,以指紋圖譜聯合多元統計分析、比較蘄春產艾葉與陜西產艾葉中非揮發性成分的主要特征,為陜西產艾葉的質量評價提供一定的實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀(配G1311B型四元泵、G1329B型自動進樣器、G1316A型柱溫箱、G1315型二極管陳列檢測器,美國安捷倫科技有限公司公司);超聲波清洗器(熊貓集團南京電子計量有限公司);SQP型電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司);水浴鍋(泰斯特科技有限公司)。

1.2 試藥

對照品:綠原酸(批號 20081301,四川省維克奇生物科技有限公司);異澤蘭黃素(批號CHB201217)、異綠原酸C(批號CHB201227)、棕矢車菊素(批號CHB210113)、新綠原酸(批號CHB201129)、異綠原酸A(批號CHB201227),均購自成都克洛瑪生物科技有限公司;甲酸(賽默飛世爾科技有限公司);甲醇(色譜純,美國霍尼韋爾公司);實驗用水為超純水。

艾葉樣本為端午前一周采集,避光、晾干后備用[8]。樣本經陜西省中醫藥研究院楊智峰研究員鑒定為Artemisiaargyilevl. et Vant.的干燥葉。產地信息見表1。

表1 樣品產地來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動相為2 mL·L-1甲酸水溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脫:0～5 min,20%～51% B;5～10 min,51%～60% B;10～15 min,60% B;15～35 min,60%～80% B;35～40 min,80%～95% B;40～50 min,95% B。檢測波長為330 nm;流速為0.3 mL·min-1;進樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的配制

分別精密稱定對照品異澤蘭黃素、綠原酸、異綠原酸C、棕矢車菊素、新綠原酸、異綠原酸A適量,加甲醇分別制成含異澤蘭黃素、綠原酸、異綠原酸C、棕矢車菊素、新綠原酸、異綠原酸A 27.6、10.2、18.3、13.0、12.5、24.0 μg·mL-1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制

取適量干燥艾葉,搗碎30 min,精密稱取艾絨與艾粉混合物1 g,加入60 mL體積分數50%甲醇,水浴回流30 min,靜置至室溫后補足質量,用0.45 μm微孔濾膜濾過,備用。

2.4 方法學考察

2.4.1精密度實驗 取混合對照品溶液,按照2.1項下色譜條件連續進樣6次,記錄色譜圖,計算得各共有峰的相對峰面積及相對保留時間的RSD值分別為0.01%～1.81%、0.01%～0.05%[9]。

2.4.2穩定性實驗 取2.3 項下供試品溶液,按照2.1項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣分析,計算得相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.01%～1.96%、0.01%～0.06%[9]。

2.4.3重復性實驗 取1號樣本平行制樣6份,按照2.2項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件進樣測定,計算得相對峰面積和相對保留時間的RSD值分別為0.01%～4.08%、0.01%～0.07%。

2.5 指紋圖譜建立及相似度評價

取不同產地艾葉按照2.2項下方法制備供試品,按照2.1項下色譜條件進樣分析,按照《中藥色譜指紋圖譜》要求,將25批艾葉HPLC色譜圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2015年版)”中進行數據分析。自動匹配色譜峰,生成25批陜西不同產地艾葉指紋圖譜以及對照指紋圖譜,標定并指認出6個共有峰成分,分別為新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、棕矢車菊素和異澤蘭黃素,混合對照品色譜峰見圖1、25批不同產地艾葉的指紋圖譜疊加圖見圖2。

注:1.新綠原酸; 2.綠原酸; 3.異綠原酸A; 4.異綠原酸C; 5.矢車菊素; 6.異澤蘭黃素。

注:1.新綠原酸; 2.綠原酸; 3.異綠原酸A; 4.異綠原酸C; 5.矢車菊素; 6.異澤蘭黃素。

應用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2015版)”對25批樣品的HPLC指紋圖譜進行相似度分析,以對照指紋圖譜為參照,對25批艾葉色譜圖譜進行相似度計算,結果見表2,25批艾葉樣本與自動生成的對照圖譜相比,相似度均大于0.92,表明相似度良好。

表2 樣品的相似度分析

由表2可知,蘄春產樣本(S1～S6)與19批陜西產樣本相似度均在0.91以上,19批陜西產艾葉相互比較,相似度為0.86～0.99;對陜西不同產區樣本進行比較,寶雞產樣本(S7～S12)與商洛產樣本(S13～S19)相似度為0.87～0.99,寶雞產與銅川產樣本(S20～S25)的相似度為0.88～0.99,商洛產區與銅川產區之間相似度為0.88～0.99。比較各個產區的不同樣本之間相似度發現:蘄春產樣本相似度為0.95～0.99,陜西寶雞產各樣本相似度為0.93～0.99,商洛產樣本的相似度在0.91～0.99,銅川產各樣本的相似度為0.87～0.98。

2.6 聚類分析

用SPSS 19.0軟件,以共有峰峰面積信息對25個樣本進行聚類分析,選擇中位數聚類法、平方Euclidean距離作為聚類參數[10-11],分類結果樹狀圖見圖3。

圖3 25批艾葉樣本的聚類分析圖

由圖3可知,所分析的25批艾葉以非揮發性共有峰為主要特征,大體聚為2類,蘄春產樣本中5號樣本與其他4個樣本距離較遠,全部陜北產樣本、部分陜南產樣本與多數的蘄春產樣本可聚為一類,蘄春的一個樣本與少數陜南產樣本及多數關中產樣本聚為一類。

2.7 多元統計分析

以共有峰峰面積為樣本特征,按照產地分組整理數據矩陣,用MetaboAnalyst 5.0對25批艾葉樣本分別進行了無監督的主成分分析(principal component analysis, PCA)[12]及有監督的偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)[13],原始數據分別經過平方根及帕累托轉換后歸一化。PCA得分圖見圖4。

圖4 25批艾葉樣本的PCA得分圖

由圖4可知,各產地樣本整體上呈現交疊分布的特征,蘄春產樣本與陜北、關中、陜南產大多數樣本未顯示出分簇的狀態,表明在整體特征上蘄春產樣本與陜西3個區域產樣本未見差異。

PLS-DA得分圖及模型交叉驗證(cross validation)結果見圖5。由圖5可知,各個產地的樣本依然無明顯分簇。對所建立的PLS-DA模型進行內部交叉驗證發現,在基于各主成分的驗證中,模型的R2值均在0.4以下,Q2值均為負值。

注:A. PLS-DA記分圖;B.內部交叉驗證結果。

3 討論

建立中藥材指紋圖譜時,色譜條件和制樣方法的優化是關鍵。本文為確定指紋圖譜關鍵參數,分別對流動相組成、洗脫梯度、檢測波長、柱溫、流速和進樣量進行了系統考察,在優化流動相梯度及流速時耗費了較長時間,最終確定了最優條件;對于供試品制備方法,分別考察了取樣量、溶劑種類、溶劑倍量、提取方式和提取時間,選擇出提取效率最高的方式進行了樣本制備。

進行相似度分析時發現,蘄春產艾葉與陜西產艾葉非揮發性成分指紋圖譜具有很高的相似度,表明在主要的非揮發性成分特征方面,陜西產艾葉整體上與蘄春產艾葉具有很高的相似度。此外,陜西不同地區(陜北、關中、陜南)之間比較,相似度也較高(均在0.87以上);陜西不同產區樣本之間的相似度波動比蘄春與陜西產樣本之間的相似度波動相近甚至更大。眾所周知,陜西分為陜北、關中、陜南3個區域,不同區域之間地理與生態環境相差較大,溫度、日照、土壤、水分等因素的不同可能導致艾葉中化學成分不同[14]。此外,比較各產區樣本之間相似度波動的范圍,蘄春要比陜西各區域均小,這也表明,即使是在陜西省內部的各產區進行艾葉種植、采收和加工,仍需加強其有效成分的質量監控。

PCA是一種無監督的分析方法[15],其分析過程中,默認對所有樣本不加以區分,即每個樣本對模型有著同樣的貢獻,當樣本的組間差異較大而組內差異較小時,無監督分析方法可以明顯區分組間差異;但當樣本的組間差異不明顯而組內差異較大時,無監督分析方法難以發現和區分組間差異。另外,如果組間的差異較小,各組的樣本量相差較大,樣本量大的那組將會主導模型。而有監督的PLS-DA分析能很好地解決無監督分析中存在的這些問題[16]。但是,作為一種有監督的分類模型,PLS-DA模型可能會存在過擬合風險,因此需要驗證模型的可靠性[17]。交叉驗證是常用的檢驗方法之一,其基本過程為通過逐步增加擬合的主成分來觀察模型對變量的解釋度(R2)和預測度(Q2)的變化,當Q2停止增長時,主成分不再增加。Q2數值越大表示模型的預測能力越強[18]。一般情況下,模型具備良好的預測性能要求Q2至少大于0.5[19-20]。在本文中,Q2始終是負值,表明PLS-DA模型不具備預測組間差異的可靠性,導致模型表現不佳的主要原因可能是按照產區分類、陜西產樣本的組內差異較大,這也從反面證實了蘄春產與陜西產樣本之間的差異不顯著。

4 結論

本文建立的陜西產艾葉指紋圖譜分析方法符合2020年版《中國藥典》相關要求,基于指紋圖譜共有峰信息進行的聚類分析、PCA及PLS-DA判別分析發現,陜西產艾葉中非揮發性成分的主要特征與蘄春產艾葉無顯著差異。