LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定諾氟沙星膠囊中的3種雜質(zhì)

曹 旭, 張 琤,劉 濤,王群葆

1.邢臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)所,邢臺(tái) 054000;2. 邢臺(tái)市第五醫(yī)院,邢臺(tái) 054000

諾氟沙星(norfloxacin),別名氟哌酸,化學(xué)名稱為1-乙基-6-氟-1,4-二氫-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸,是第三代喹諾酮類抗菌藥,可選擇性抑制消化道內(nèi)致病菌DNA合成中起作用的DNA促旋酶,從而干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)重組,使細(xì)菌無(wú)法傳代。諾氟沙星膠囊為諾氟沙星常用制劑,主要輔料為淀粉、羥甲基纖維素等,其生產(chǎn)和使用在我國(guó)具有廣泛性和普遍性。但有研究結(jié)果表明,喹諾酮類化合物藥物的雜質(zhì)會(huì)引起惡心、頭痛、頭暈、高血壓、光毒性等不良反應(yīng)[1]。因此,有必要對(duì)諾氟沙星膠囊進(jìn)行雜質(zhì)分析和有關(guān)物質(zhì)檢查。

諾氟沙星原料中的主要雜質(zhì)為:雜質(zhì)A(7位取代基為氯,化學(xué)名為1-乙基-6-氟-7-氯-4-氧代-1,4-二氫-3-喹啉羧酸);雜質(zhì)E[氯哌酸,化學(xué)名為1-乙基-7-氯-1,4-二氫-4-氧代-6-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸];雜質(zhì)K[1位取代基位甲基,化學(xué)名為1-甲基-6-氟-1,4-二氫-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸]。它們均為諾氟沙星原料在合成過(guò)程中產(chǎn)生的工藝雜質(zhì)。這些雜質(zhì)會(huì)少量帶入諾氟沙星制劑中,從而顯著降低其質(zhì)量。因此,雜質(zhì)的分離和測(cè)定對(duì)質(zhì)量控制、工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程的反應(yīng)監(jiān)測(cè)都具有重要意義[2]。諾氟沙星膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)二部[3],有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)在雙波長(zhǎng)下對(duì)諾氟沙星雜質(zhì)A和總雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)并規(guī)定了限度要求。《美國(guó)藥典》(the United States Pharmacopieial,USP)41 版(USP41)[4]、《歐洲藥典》(the European Pharmacopoeia,EP)9.3版(EP9.3)[5]未收錄諾氟沙星膠囊,但對(duì)諾氟沙星原料藥中雜質(zhì)A、雜質(zhì)E、雜質(zhì)K均做了限度要求。因標(biāo)準(zhǔn)方法靈敏度有限,各雜質(zhì)之間分離度達(dá)不到要求[6],根據(jù)藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則和人用藥品技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)理事會(huì)(the international council for harmonisation of technical requirement for pharmaceuticals for human use,ICH)相關(guān)規(guī)定[7-9],并參考有關(guān)文獻(xiàn)[10-23]建立了本方法。各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-Class TQS液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó) Waters公司);MS205DU電子天平(Mettler Toledo公司);ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)購(gòu)自沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 試藥

諾氟沙星雜質(zhì)A(批號(hào)111869-201704,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.2%)、諾氟沙星雜質(zhì)E(批號(hào)110734-201914,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.0%)、諾氟沙星雜質(zhì)K(批號(hào)110714-201809,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.2%)、諾氟沙星(批號(hào)110714-201809,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.2%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;諾氟沙星膠囊(市售30批);乙腈(批號(hào)171060405001,LC-MS Grade,OMNI CHEM公司);甲酸(批號(hào)M185-500,Mreda Technology Inc公司);純化水(用Milli-Q自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1混合溶劑的制備 取20 mL乙腈和0.2 mL甲酸,加水至100 mL,即得。

2.1.2對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取諾氟沙星、諾氟沙星雜質(zhì)A、雜質(zhì)E、雜質(zhì)K對(duì)照品各20 mg,分別置于100 mL量瓶中,加乙腈20 mL使溶解,加2 mL·L-1甲酸溶解,并稀釋至刻度,搖勻,即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 分別精密量取2.1.2項(xiàng)下制備的4種對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL,置于同一50 mL量瓶中,加混合溶劑至刻度,搖勻,即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液制備 精密量取2.1.3項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,制成質(zhì)量濃度分別為4、20、40、80、160、400 ng·mL-1的對(duì)照品系列溶液,備用。

2.1.5供試品溶液的制備 精密稱取諾氟沙星膠囊內(nèi)容物10 mg,置于100 mL量瓶中,加混合溶劑超聲10 min使溶解,并稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.1.6色譜條件 用ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),以乙腈(A)-2 mL·L-1甲酸(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,流速為0.3 mL·min-1,柱溫為40 ℃,進(jìn)樣量為0.5 μL;質(zhì)譜離子化方式為 ESI,正離子模式。梯度洗脫:0～6 min,7%～4% A;6～7 min,4%～12% A;7～10 min,12%～50% A;10～10.5 min,50%～7% A;10.5～14 min,7% A,用分段模式檢測(cè)[18],避免高質(zhì)量濃度的諾氟沙星母核進(jìn)入質(zhì)譜。雜質(zhì)A檢測(cè)離子對(duì)為m/z270.223→288.352/224.227,雜質(zhì)E檢測(cè)離子對(duì)為m/z336.323 →318.327/247.220,雜質(zhì)K檢測(cè)離子對(duì)為m/z306.332→262.346/288.346,諾氟沙星檢測(cè)離子對(duì)為m/z320.272→276.356/302.351。

2.2 結(jié)果

2.2.1線性與范圍 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液注入液相色譜-質(zhì)譜儀,按照2.1.6項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè),以溶液質(zhì)量濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸,得各對(duì)照品回歸方程:諾氟沙星雜質(zhì)Ay1=1 377.35x1+4 926(r=0.999 4)、雜質(zhì)Ey2=1 372.18x2+1 053.33(r=0.998 4)、雜質(zhì)Ky3=362.50x3+824.04(r=0.998 7)。雜質(zhì)A、雜質(zhì)E和雜質(zhì)K質(zhì)量濃度分別在4.11～410.78、4.12～412.00、3.98～398.40 ng·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.2專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密量取混合對(duì)照品溶液、空白溶液各0.5 μL注入液相色譜-質(zhì)譜儀,按照2.1.6 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄質(zhì)譜圖和色譜圖,見(jiàn)圖2、圖3。結(jié)果表明各色譜峰保留時(shí)間分別為諾氟沙星5.84 min、雜質(zhì)A 9.36 min、雜質(zhì)E 4.83 min、雜質(zhì)K 3.00 min,各色譜峰之間互不干擾,表明該方法的專屬性較好。

注:A.空白溶液;B.對(duì)照品溶液。

2.2.3精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)曲線40 ng·mL-1的溶液0.5 μL,按照2.1.6項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。結(jié)果顯示,對(duì)照品諾氟沙星雜質(zhì)A、雜質(zhì)E和雜質(zhì)K峰面積的RSD值分別為1.78%、0.95%、2.06%(n=6),表明儀器的精密度良好。

2.2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取樣品細(xì)粉6份,分別按照2.1.8項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1.6項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,諾氟沙星雜質(zhì)A、雜質(zhì)E和雜質(zhì)K峰面積的RSD值分別為1.19%、2.04%、2.29%(n=6),結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液,分別于0、1、2、4、12 h進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算得諾氟沙星雜質(zhì)A、雜質(zhì)E和雜質(zhì)K峰面積的RSD值分別為5.88%、4.76%、4.84%,結(jié)果表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.6回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取2.1.3項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.9、1.0、1.1 mL,分別置于100 mL量瓶中,各質(zhì)量濃度平行3份,共9個(gè)量瓶,每個(gè)量瓶中精密加入空白輔料10 mg,用混合溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取0.5 μL,按照2.1.6項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,各雜質(zhì)回收率結(jié)果見(jiàn)表1。回收率限度在80%～115%之間,符合要求。

表1 各雜質(zhì)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.7批量樣品實(shí)驗(yàn) 用本研究新建的液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatograph tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法測(cè)定30批諾氟沙星膠囊(樣品信息見(jiàn)表2)中3個(gè)雜質(zhì),按照2.1.5項(xiàng)下供試品溶液制備方法對(duì)樣品進(jìn)行處理,按照2.1.6項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,含量分布見(jiàn)圖4。檢測(cè)結(jié)果表明,30批諾氟沙星膠囊中雜質(zhì)A、雜質(zhì)E、雜質(zhì)K普遍存在,其中1批雜質(zhì)E和4批雜質(zhì)K含量超過(guò)0.15%(USP、EP限度),存在安全風(fēng)險(xiǎn)。而按照國(guó)內(nèi)法定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè),雜質(zhì)E完全包含在諾氟沙星主峰內(nèi),不能檢出,見(jiàn)圖5,新建的LC-MS/MS法可有效分離、檢測(cè)雜質(zhì)A、雜質(zhì)E、雜質(zhì)K。

表2 30批諾氟沙星膠囊信息

圖4 各雜質(zhì)含量分布圖

注:A.雜質(zhì)E、雜質(zhì)K色譜圖;B.諾氟沙星樣品色譜圖;1.雜質(zhì)K;2.諾氟沙星;3.雜質(zhì)E。

3 討論

供試品溶液中溶質(zhì)的主要成分為諾氟沙星,因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度諾氟沙星進(jìn)入液質(zhì)聯(lián)用儀會(huì)污染質(zhì)譜檢測(cè)器,所以須采取分段模式檢測(cè),把諾氟沙星保留時(shí)間段的液體切換至廢液,避免高質(zhì)量濃度諾氟沙星母核進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器。諾氟沙星峰和其他雜質(zhì)峰的保留時(shí)間差在0.5 min以上才能保證分段模式檢測(cè),這就要對(duì)色譜柱和流動(dòng)相進(jìn)行選擇和優(yōu)化。

3.1 色譜柱的選擇

分別考察了ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、ACQUITY UPLC CHS C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)。結(jié)果表明用ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)檢測(cè)時(shí)諾氟沙星和雜質(zhì)E保留時(shí)間的差值為0.5～0.6 min,各雜質(zhì)有較佳的峰形,且各峰分離度良好。這可能是因?yàn)樵撋V柱在C18鏈上鑲嵌了一個(gè)極性官能團(tuán)氨基甲酸酯,對(duì)不同極性的化合物有不同的選擇性,使諾氟沙星和雜質(zhì)E有較好的分離度。

3.2 流動(dòng)相的選擇和優(yōu)化

對(duì)新建檢測(cè)方法進(jìn)行重現(xiàn)性驗(yàn)證時(shí),選擇了其他藥品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證,各實(shí)驗(yàn)室的試劑、液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀不同,影響各雜質(zhì)峰的保留時(shí)間。因此,對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。先后用2 mL·L-1甲酸溶液(用甲酸銨調(diào)節(jié)pH值至3.0)-乙腈體系、2 mL·L-1甲酸5 mmol·L-1乙酸銨溶液-乙腈體系和2 mL·L-1甲酸-乙腈體系進(jìn)行梯度洗脫,結(jié)果顯示,用2 mL·L-1甲酸-乙腈體系為流動(dòng)相時(shí),諾氟沙星和雜質(zhì)E保留時(shí)間的差值可以達(dá)到0.9～1.0 min。這足以排除不同儀器、試劑對(duì)各雜質(zhì)峰保留時(shí)間帶來(lái)的影響,確保了色譜條件的適用性。

3.3 小結(jié)

2020年版《中華藥典》用HPLC法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè),靈敏度和分離度不能滿足要求。本研究新建的LC-MS/MS法可同時(shí)測(cè)定諾氟沙星膠囊中3個(gè)雜質(zhì),方法靈敏度高、專屬性好、簡(jiǎn)便快捷,線性、精密度、穩(wěn)定性滿足測(cè)定要求。該方法可用于諾氟沙星及其制劑各雜質(zhì)的檢測(cè),從而保證臨床用藥的安全性。所測(cè)30批次諾氟沙星膠囊中雜質(zhì)A、雜質(zhì)E、雜質(zhì)K普遍存在,因此應(yīng)加強(qiáng)諾氟沙星及其制劑中雜質(zhì)的監(jiān)測(cè)。