金匱腎氣丸中馬錢苷、京尼平苷酸、23-乙酰澤瀉醇B和β-蛻皮甾酮含量測定方法的建立

王開裕,林天東,吳振寧,許海丹

1.海南省中醫院藥學部,海口 570203; 2.海南省中醫院國醫大師工作室,海口 570203

金匱腎氣丸不僅具有溫補腎陽、化氣行水等功效,還具有增強免疫力、抗衰老、改善糖脂代謝等藥理作用,能增強神經-體液調節、改善垂體功能[1-3]。金匱腎氣丸是由地黃、茯苓、山藥等10味藥材經粉碎、過篩、干燥、制丸等工藝加工而成的中藥丸劑,在臨床上常用于治療腎虛水腫、腰膝酸軟、小便不利、畏寒肢冷等病癥[4-5]。山茱萸具有補益肝腎、收澀固脫等作用[6-8];澤瀉具有利水滲濕、瀉熱、化濁、降脂等作用[9-11];牛膝具有逐瘀通經、補肝腎、強筋骨等作用[12-14];車前子具有清熱、利尿、通淋、滲濕、止瀉等作用[15-17]。金匱腎氣丸現收載于《衛生部藥品標準中藥成方制劑》第二十冊中,標準編號為WS3-B-3892-98,執行標準中僅有性狀、鑒別和檢查項目,缺少含量測定項目。隨著我國人口老齡化趨勢的加劇,老年病患者數量也在逐年增加,金匱腎氣丸臨床應用也越來越廣。為保障患者的用藥安全,有必要提高金匱腎氣丸的檢測標準。根據2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)中山茱萸、澤瀉、牛膝和車前子含量測定項目,本研究建立了高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測定金匱腎氣丸中馬錢苷、京尼平苷酸、23-乙酰澤瀉醇B和β-蛻皮甾酮的含量檢測方法[18-21],提高金匱腎氣丸的檢測標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫 1290 Infinity(配備G4513A型自動進樣器、G1316C型柱溫箱、G1315型二極管陣列檢測器)購自美國Agilent科技有限公司;梅特勒 AE200型電子天平(精度為萬分之一,瑞士Mettler-Toled科技有限公司);Capcell Pak UG C18色譜柱(日本資生堂科技有限公司);鑫欣XCD-NS-3C型多槽超聲波清洗機(濟寧鑫欣超聲電子設備有限公司)。

1.2 試藥

對照品:馬錢苷(批號111640-201808,Cas號為18524-94-2,質量分數為99.0%),京尼平苷酸(批號111828-201805,Cas號為27741-01-1,質量分數為98.1%),23-乙酰澤瀉醇B(批號111846-202006,Cas號為26575-95-1,質量分數為98.3%),β-蛻皮甾酮(批號111638-201907,Cas號為5289-74-7,質量分數為98.3%),均購自中國食品藥品檢定研究院。金匱腎氣丸(規格為 6 g·丸-1,批號:211214、220112、220506,昆明中藥廠有限公司);實驗用水為超純水,自制;乙腈、甲醇均為色譜純,購自天津市科密歐試劑公司;其他試劑均為分析純,購自上海化學試劑廠。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

液相色譜柱為Capcell Pak UG C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。柱溫為25 ℃。以乙腈為流動相A、3 mL·L-1磷酸溶液為流動相B,梯度洗脫,洗脫程序:0～4 min,14% A;4～16 min,14%～46% A;16～25 min,46%～91% A;25～30 min,91% A;31～31.5 min,14% A;京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B的檢測波長分別設定為254、250、240、254 nm。流速為1.0 mL·min-1;進樣量為10 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1對照品儲備液 取1.2項下馬錢苷對照品,精密稱取適量,置于10 mL棕色量瓶中,加甲醇制備每1 mL溶液中含馬錢苷49.5 μg的溶液,即得馬錢苷對照品儲備液;同法制備每1 mL溶液中含京尼平苷酸、23-乙酰澤瀉醇B和β-蛻皮甾酮分別為98.1、19.7、98.3 μg的儲備液,分別加甲醇定容,搖勻,即得。

2.2.2對照品溶液 取2.2.1項下馬錢苷、京尼平苷酸、23-乙酰澤瀉醇B和β-蛻皮甾酮對照品儲備液,分別精密移取1.0 mL,置于10 mL棕色量瓶中,加甲醇定容,搖勻。

2.2.3陰性對照溶液 按照金匱腎氣丸質量標準中的處方和制備方法,分別制備缺山茱萸、澤瀉、牛膝、車前子的陰性樣品,陰性樣品溶液按照2.2.4項下供試品溶液制備方法制備,分別制得山茱萸、澤瀉、牛膝、車前子陰性對照溶液。

2.2.4供試品溶液 取金匱腎氣丸供試品(批號211214)適量,置于研缽中研成細粉,精密稱取0.5 g,置于25 mL棕色量瓶中,加甲醇20 mL,超聲提取20 min(超聲功率設定為220 W,頻率為75 Hz),提取完畢后,在室溫下放冷,加甲醇定容,搖勻,濾過(0.45 μm濾膜),續濾液即為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1專屬性考察 取2.2項下對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液,按照2.1項下色譜條件分別進樣分析,采集色譜圖;結果京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B在該色譜條件下分離良好,分離度均大于1.5,理論塔板數均不低于3 000,拖尾因子在0.95～1.05之間,符合《中國藥典》的要求,且陰性供試品溶液中無干擾峰。典型色譜圖見圖1。

注:A.對照品溶液;B.陰性供試品溶液;C.供試品溶液;D.缺車前子供試品溶液;E.缺牛膝供試品溶液;F.缺山茱萸供試品溶液;G.缺澤瀉供試品溶液;1.京尼平苷酸;2.β-蛻皮甾酮;3.馬錢苷;4.23-乙酰澤瀉醇B。

2.3.2線性關系考察 取2.2項下對照品儲備溶液,分別準確移取0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mL,置于5個10 mL棕色量瓶中,加甲醇定容,搖勻,按照2.1項下色譜條件,分別進樣10 μL,采集色譜圖并記錄峰面積。以峰面積(y)為縱坐標、質量濃度(x)為橫坐標進行線性回歸,結果見表1。

表1 待測成分的回歸方程、相關系數及線性范圍

2.3.3儀器精密度考察 取2.2項下制備的對照品溶液,按照2.1項下色譜條件,分別連續進樣6次,每次進樣10 μL,采集色譜圖并記錄峰面積。根據色譜圖記錄的京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B峰面積計算相對標準偏差(RSD)。計算得京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為1.14%、1.33%、1.18%、1.04%,表明儀器的精密度良好。

2.3.4方法重復性考察 取金匱腎氣丸供試品(批號為211214)適量,置于研缽中研成細粉,準確稱取約0.5 g,平行取樣6份,分別置于25 mL棕色量瓶中,后續按照2.2.4項下供試品溶液制備方法進行處理,得6份供試品溶液,按照2.1項下色譜條件分別進樣10 μL,采集色譜圖并記錄峰面積。根據京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B檢測結果計算RSD。計算得京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B含量的RSD值分別為1.62%、1.31%、1.76%、1.24%,表明該方法的重復性良好。

2.3.5穩定性考察 取金匱腎氣丸供試品(批號211214)適量,按照2.2.4項下供試品溶液制備方法進行處理,得供試品溶液,室溫下放置,按照2.1項下色譜條件,分別于0、2、4、8、12、24 h取樣分析,采集色譜圖并記錄峰面積。根據京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B的峰面積計算RSD。計算得京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為1.41%、1.27%、1.61%、1.52%,表明溶液在24 h內穩定。

2.3.6加樣回收率考察 取已測定京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B含量的金匱腎氣丸供試品(批號211214)適量,準確稱取0.5 g,置于25 mL棕色量瓶中,平行取樣6份,分別加入2.2.1項下制備的對照品儲備液適量,后續按照2.2.4項下供試品溶液制備方法進行處理,得6份加樣溶液;按照2.1項下色譜條件分別進樣10 μL,采集色譜圖并記錄峰面積,計算加樣回收率。結果見表2。

表2 樣品加樣回收率結果

2.4 市售樣品檢測應用

分別取金匱腎氣丸適量,按照2.2.4項下供試品溶液進行前處理,得供試品溶液;按照2.1項下色譜條件分別進樣分析,采集色譜圖,根據峰面積計算京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B的含量。結果見表3。

表3 樣品含量檢測結果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

實驗選取金匱腎氣丸組成中的山茱萸、澤瀉、牛膝、車前子4種藥材的活性成分作為其質量控制的指標。取2.2.2項下制備的京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B對照品溶液,按照2.1項下色譜條件,分別進樣10 μL上述溶液,設置波長掃描為200～600 nm,采集4種成分的色譜圖。結果顯示京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B的最大吸收波長分別為254、250、240、254 nm;差異較大,為提高檢測效率,實驗采用程序波長切換技術,實現了在同一色譜條件下,在4種成分最大吸收波長處分別測定其含量。

3.2 流動相的選擇

液相色譜法常用的流動相有甲醇體系和乙腈體系,實驗分別選擇水-甲醇、水-乙腈、甲醇-3 mL·L-1磷酸溶液和乙腈-3 mL·L-1磷酸溶液作為流動相體系,考察京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B的出峰時間、分離效果等情況。

結果顯示,選擇甲醇體系時,3種目標物出峰時間較長,檢測效率偏低,且23-乙酰澤瀉醇B基線噪音較大,定量結果準確度偏低;選擇水-乙腈體系時,β-蛻皮甾酮和馬錢苷色譜峰發生分叉,可能原因是β-蛻皮甾酮和馬錢苷在純化水狀態下,存在2種分子狀態,這2種分子在該色譜條件下微弱分離,導致定量結果不準確;選擇乙腈-3 mL·L-1磷酸溶液時,京尼平苷酸、β-蛻皮甾酮、馬錢苷和23-乙酰澤瀉醇B分離良好,分析時間較短,且無基質干擾。故實驗選擇乙腈-3 mL·L-1磷酸溶液作為流動相體系。

綜上所述,實驗以金匱腎氣丸為研究對象,選取其藥材組成中的山茱萸、澤瀉、牛膝、車前子的活性成分作為研究目標,建立能同時檢測金匱腎氣丸中馬錢苷、京尼平苷酸、23-乙酰澤瀉醇B和β-蛻皮甾酮4種成分含量的HPLC法。對該方法的重復性、線性、回收率等進行了考察,并對前處理的條件進行了優化。結果表明,該方法具有前處理簡單、分析時間短、檢測結果準確等優點,適用于金匱腎氣丸的質量控制。