芝麻素影響冠心病大鼠心肌細胞凋亡的機制

魏鵬輝,劉 英,程敏菊

1.華北醫療集團峰峰總醫院心內科,邯鄲 056000;2.唐山開灤醫院心血管內科,唐山 065000;3.邢臺市人民醫院心臟內科,邢臺 054000

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病,coronary heart disease, CHD)是冠狀動脈功能性/器質性病變,即冠狀動脈血管發生粥樣硬化,引起冠狀動脈供血與心肌需求失衡,心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病[1]。CHD的臨床表現為心力衰竭、心悸乏力,甚至猝死,極大威脅人們的生命健康[2]。芝麻素是一種天然抗氧化劑,作為芝麻的主要活性成分,具有降低三酰甘油(triglyceride, TG)、膽固醇(cholesterin, TC)及改善心肌及血管肥厚、減少中風等功效[3]。脂代謝異常、血管內皮功能異常是CHD的主要誘因[4]。研究表明,芝麻素可通過降低炎癥因子釋放抑制CHD大鼠心肌細胞的異常活化[5]。因此,本研究建立CHD模型,研究芝麻素對CHD大鼠脂代謝、血管內皮功能、心肌組織的影響及作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HM355S全自動輪轉式石蠟切片機(德國MICON醫療技術有限公司);DxC700AU全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司);PowerPac電泳儀和CheniDoc XRS化學發光成像分析系統,均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 試藥

芝麻素(質量分數>98%,批號Z-001,成都瑞芬思生物科技有限公司);羧甲基纖維素鈉(批號C9481)、BCA蛋白定量分析試劑盒(批號BCA1),均購自美國Sigma-Aldrich公司;一氧化氮Assay試劑盒(批號ab272517,美國Abcam公司);白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)ELISA試劑盒(批號:SEKR-0005、SEKR-0009),均購自北京索萊寶生物科技有限公司;兔抗大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)抗體(批號ab154598)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase, Akt)抗體(批號ab154598)、p-Akt抗體(批號ab8805)、一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)抗體(批號ab38449)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(cysteinyl aspartate specific proteinase-12, Caspase-12)抗體(批號ab199956),細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)抗體(批號ab62484)及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ig G(批號ab282575),均購自美國Abcam公司;p-eNOS抗體[批號YS-(kt)-0416,上海研生實業有限公司]。

1.3 動物

80只SPF級雄性SD大鼠,10周齡,體質量為(200±20) g,購自武漢云克隆動物有限公司,許可證號SCXK(鄂)2018-0021,室溫飼養,實驗前適應性飼養7 d。

2 方法

2.1 大鼠模型的建立

適應性飼養后取64只大鼠給予高脂飼料飼養,建立CHD模型[6]:以質量分數3%膽固醇、10%白糖、20%豬油、15%酪蛋白、1%維生素D及51%基礎飼料連續喂養4周。末次喂養后禁食12 h,不禁飲,30 mg·kg-1戊巴比妥耳緣靜脈注射麻醉大鼠,尾靜脈注射垂體后葉素30 u·kg-1。記錄Ⅱ導聯心電圖,Ⅱ導聯心電圖中測定J點位移>0.1 mV即建模成功[5]。

2.2 干預方法

將建模成功大鼠隨機分為模型組及芝麻素低劑量、中劑量和高劑量組,每組16只,剩余16只為對照組。芝麻素低劑量、中劑量和高劑量組按照每天2 mL,分別灌胃40、80、160 mg·kg-1芝麻素(羧甲基纖維素鈉溶液溶解),對照組和模型組每天灌胃羧甲基纖維素鈉溶液2 mL,連續干預28 d。

2.3 檢測脂代謝相關指標

大鼠干預結束后禁食12 h,各組大鼠尾靜脈取血5 mL,以3 000 r·min-1(離心半徑為25 cm)離心10 min,收集血清,用全自動生化分析儀檢測TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平。

2.4 檢測血管內皮功能相關指標

用30 mg·kg-1戊巴比妥麻醉各組大鼠后,迅速取出大鼠胸主動脈,清除結締組織,將血管剪成3～4 mm血管環,懸掛于連接張力換能器的K-H液的氣管浴管中,浴管中供給氣體(體積分數95%氧氣和體積分數5%二氧化碳)。待血管環穩定后滴注1 μmol·L-1去氧腎上腺素干預。待張力恢復至1 g,再給予1 μmol·L-1去氧腎上腺素收縮血管,達峰值10 min后,連續給予乙酰膽堿(acetylcholine, ACH),穩定后血管環平衡至基礎張力。血管收縮達峰值后,累積給藥,給予酸化亞硝酸鈉,以1 μmol·L-1的去氧腎上腺素誘發最大收縮幅度,記錄血管張力變化。

2.5 HE染色觀察組織學變化

取各組8只大鼠左心室心肌組織,用100 g·L-1多聚甲醛固定48 h,乙醇脫水,石蠟包埋,制成厚4 μm的切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,蘇木精染色5 min,伊紅染色5 min,脫水固定后,中性樹脂封片,鏡下觀察并拍照記錄。

2.6 檢測IL-6、TNF-α和一氧化氮(nitric oxide,NO)水平

無菌取剩余各組的8只大鼠心肌組織,液氮處理后置于-80 ℃的冰箱中保存,取心肌組織50 mg,加入PBS 1 mL勻漿,以3 500 r·min-1低溫離心10 min(離心半徑為10 cm),取上清,設置對照品孔、樣本孔及空白孔,將稀釋樣品及對照品液加入相應檢測孔內,抗體包被,洗板,加入酶結合物工作液,洗板,加入顯色工作液,終止反應,于450 nm波長處測定各孔吸光度(A)值,繪制對照品線性回歸曲線,計算樣品中IL-6、TNF-α和NO水平。

2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率

取各組2.6項下冷凍保存的大鼠心肌組織研磨,制備單細胞懸液(5×105個·mL-1),取懸液100 μL,加入稀釋好的1×Annexin V Binding Buffer 100 μL,用移液槍緩慢吸打混勻,避光靜置10 min,加入FITC-Annexin V和PI染液5 μL,吸打混勻,避光靜置10 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.8 檢測PI3K等蛋白水平

取各組2.6項下冷凍保存的大鼠心肌組織100 mg,置于無酶EP管中,加入RIPA 0.6 mL,充分勻漿,以12 000 r·min-14 ℃離心10 min,取上清,BCA法檢測蛋白質量濃度,SDS-PAGE電泳,濕轉蛋白至PVDF膜上,用50 g·L-1脫脂牛奶封閉2 h,于一抗(TBST行1∶1 000稀釋)中4 ℃孵育過夜,TBST洗膜20 min,加入二抗(TBST行1∶8 000稀釋),置于搖床中振蕩孵育1 h,TBST洗膜20 min,將PVDF膜置于凝膠成像儀顯影區,均勻滴加顯影液,于暗室中進行曝光、顯影,Image J軟件分析,目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 脂代謝指標的比較

模型組的TC、TG較對照組升高,HDL-C較對照組降低(P<0.05);芝麻素各劑量組的TC、TG較模型組降低,HDL-C較模型組升高(P<0.05);TC、TG與芝麻素呈劑量依賴性降低,HDL-C與芝麻素呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠脂代謝的比較

3.2 血管內皮功能的比較

模型組ACH處理血管最大舒張程度較對照組升高(P<0.05);芝麻素各劑量組ACH處理血管最大舒張程度較模型組降低(P<0.05);ACH處理血管最大舒張程度與芝麻素呈劑量依賴性降低(P<0.05)。酸化亞硝酸鈉處理血管最大舒張程度各組間差異比較無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血管內皮功能的比較

3.3 組織形態學的比較

對照組大鼠心肌纖維結構清晰,排列規則緊密,細胞質和細胞核染色均勻。模型組大鼠心肌細胞染色不均,間質伴有炎癥細胞浸潤,心肌纖維排列紊亂,或見斷裂。芝麻素各劑量組大鼠心肌細胞排列較模型組整齊規則,炎癥細胞浸潤減少,心肌組織的損傷較模型組減輕。見圖1。

注:A.對照組;B.模型組;C.芝麻素低劑量組;D.芝麻素中劑量組;E.芝麻素高劑量組。

3.4 心肌組織IL-6、TNF-α和NO水平的比較

模型組IL-6、TNF-α水平較對照組升高,NO水平較對照組降低(P<0.05);芝麻素各劑量組IL-6、TNF-α水平較模型組降低,NO水平較模型組升高(P<0.05);IL-6、TNF-α水平與芝麻素呈劑量依賴性降低,NO水平與芝麻素呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見表3。

表3 心肌組織IL-6、TNF-α和NO水平的比較

3.5 心肌組織凋亡率的比較

模型組心肌組織凋亡率較對照組升高(P<0.05);芝麻素各劑量組心肌組織凋亡率較模型組降低(P<0.05);心肌組織凋亡率與芝麻素呈劑量依賴性降低(P<0.05)。見表4、圖2。

注:A.對照組;B.模型組;C.芝麻素低劑量組;D.芝麻素中劑量組;E.芝麻素高劑量組。

表4 心肌組織凋亡率的比較

3.6 心肌組織諸項蛋白水平的比較

模型組Caspase-12、ICAM-1蛋白水平較對照組升高,PI3K、p-Akt和p-eNOS蛋白水平較對照組降低(P<0.05);芝麻素各劑量組Caspase-12、ICAM-1蛋白水平較模型組降低,呈劑量依賴性降低(P<0.05);PI3K、p-Akt和p-eNOS蛋白水平較模型組升高,呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見表5、圖3。

注:A.對照組;B.模型組;C.芝麻素低劑量組;D.芝麻素中劑量組;E.芝麻素高劑量組。

表5 心肌組織PI3K、p-Akt、p-eNOS、Caspase-12和ICAM-1蛋白水平的比較

4 討論

CHD是臨床上較為常見的一種心血管疾病,隨著生活水平變化CHD呈年輕化趨勢[7]。CHD患者會伴隨出現不同程度的血脂功能異常[8]和血管內皮功能損傷[9]。有研究發現芝麻素和異芝麻素混合物可改善高脂飲食大鼠的脂質代謝[10]。另有研究發現,芝麻素聯合維生素E對由D-半乳糖和三氯化鋁誘導的大鼠主動脈內皮功能障礙具有明顯的改善作用[11]。本研究以高脂喂養建立CHD大鼠模型,深入探討芝麻素對CHD大鼠心肌組織的作用及可能的作用機制。

本研究中,HE染色結果顯示芝麻素各劑量組大鼠心肌細胞排列較模型組更整齊規則,炎癥細胞浸潤減少,心肌組織的損傷較模型組減輕,且芝麻素各劑量組TC、TG和ACH誘導血管舒張效應較模型組降低,HDL-C較模型組升高,表明芝麻素可有效抑制膽固醇合成,降低血脂水平,并緩解主動脈ACH處理血管最大舒張程度,保護心肌組織,發揮治療CHD的作用。炎癥反應對CHD的發生和發展有顯著影響,IL-6、TNF-α水平在一定程度上可反映動脈粥樣硬化的程度[12],有研究發現抑制炎癥反應可保護血管內皮細胞,提高血管內皮功能,保護心肌細胞[13]。ICAM-1是炎性細胞參與動脈粥樣硬化形成的必要條件,也參與血管內皮損傷過程[14]。Caspase-12是Caspase蛋白家族中參與細胞凋亡的主要蛋白,有研究發現下調Caspase-12可發揮抑制心肌組織凋亡的作用[15]。本研究中芝麻素各劑量組IL-6、TNF-α、ICAM-1和Caspase-12水平較模型組降低,表明芝麻素可以減輕CHD大鼠炎癥反應和血管內皮損傷,抑制凋亡蛋白分泌,保護心肌組織。

PI3K/Akt作為抗凋亡的主要調控信號通路,在CHD中發揮作用[16]。PI3K可使下游靶因子Akt磷酸化[17],活化的Akt進一步激活下游靶蛋白eNOS[18]。eNOS磷酸化后可催化NO的生成,NO能調節血流分布和血管張力,保護血管內皮功能[19],也可以通過抑制mPTP通道開放而發揮抑制凋亡的作用[20]。本研究中芝麻素各劑量組心肌組織凋亡率較模型組降低,NO、PI3K、p-Akt和p-eNOS較模型組升高,表明芝麻素可抑制CHD大鼠心肌細胞凋亡,增加NO合成量,從而保護心肌組織,其可能與激活PI3K-Akt-eNOS信號通路有關。

綜上所述,芝麻素可有效改善CHD大鼠脂代謝水平和血管內皮功能損傷,減輕心肌組織炎癥反應,降低ICAM-1、Caspase-12蛋白的表達水平,抑制心肌細胞凋亡,保護心肌組織,可能與調控PI3K-Akt-eNOS信號通路的相關蛋白有關。