葛根素基于IL-33/ST2通路對PE大鼠胎盤組織損傷的作用

李格琳 ,臧密密 ,付雪蓮

1.滄州市人民醫院產科,滄州 061000;2. 滄州市人民醫院妊娠糖尿病科,滄州 061000;3. 滄州市人民醫院婦產科,滄州 061000

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠特異性綜合征,其進展與胎盤灌注不足及由缺氧導致的胎盤功能不全有關,表現為血壓異常升高、局部水腫和蛋白尿等,是導致早產兒、孕產婦和圍產兒發病及死亡的主要原因[1-2]。PE病理機制復雜,潛在病因包括內皮功能障礙[3]、氧化應激[4]、免疫失衡及炎癥反應[5]等。白細胞介素-33(interleukin-33,IL-33)在主動或被動損傷中作為警報細胞因子或內源性信號被細胞釋放,與其受體即生長刺激表達基因2蛋白(growth stimulating expression gene 2 protein,ST2)及白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)受體輔助蛋白組成的二聚體結合進而參與PE多種病理過程[6]。葛根素可改善PE大鼠氧化應激過度激活及免疫失衡[7],提示其具有預防和治療PE的潛力,本實驗擬構建PE大鼠模型,探討葛根素對PE大鼠胎盤損傷影響,以期闡明其可能的作用機制并為PE治療提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BP-98A/B鼠尾無創血壓儀(北京軟隆生物技術有限公司);Multiskan FC多功能酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司);FluorChem M化學發光凝膠成像系統(美國ProteinSimple公司)。

1.2 試藥

葛根素(質量分數≥98%,云南力蓮生物有限公司);阿司匹林(拜耳醫藥保健有限公司);亞硝基左旋精氨酸甲酯(nitrosoL-arginine methyl ester,L-NAME,美國Sigma公司);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-4(interleukin 4,IL-4)及白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10),均購自武漢艾美捷科技有限公司;干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ,上海遠慕生物科技有限公司);可溶性生長刺激表達基因2蛋白(soluble growth stimulating expression gene 2 protein,sST2)酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自上海酶研生物科技有限公司;IL-33 ELISA試劑盒、兔抗IL-33單克隆抗體、兔抗生長刺激表達基因2蛋白(growth stimulating gene 2 protein,ST2)多克隆抗體,均購自美國Abcam公司。

1.3 實驗動物

SPF級雌性、雄性7周齡Wistar大鼠各60只,體質量為(200±10) g,由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供,許可證號為SCXK(魯)2019-0003。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

可育雌性及雄性Wistar大鼠于恒溫(22 ℃～24 ℃),相對濕度為50%～60%環境下普通飼養,12 h光-暗交替,適應1周后,將雌性及雄性大鼠按照1∶1比例合籠交配,每日陰道涂片,見有精子即記錄為妊娠第0天(encyesis day 0,Ed 0)[8]。剔除未妊娠大鼠7只及孕鼠3只,剩余孕鼠隨機分為對照組、模型組、葛根素低劑量組、葛根素高劑量組及阿司匹林組,每組10只。除對照組外,其余組孕鼠均于Ed 13～Ed 21皮下注射50 mg·kg-1L-NAME以誘導PE模型,對照組皮下注射等量生理鹽水,且葛根素低劑量、高劑量組[9]及阿司匹林組[10]孕鼠均于Ed 15～Ed 21治療,分別按照40、80、2 mg·kg-1灌服給藥,對照組及模型組孕鼠灌服等體積生理鹽水,每日1次。

2.2 樣品采集與處理

于Ed 15、Ed 21用無創血壓儀檢測各組大鼠尾動脈血壓;于Ed 20將孕鼠分別置于單獨的代謝籠中,收集24 h尿液樣本用于檢測孕鼠24 h尿蛋白;腹腔注射戊巴比妥鈉(80 mg·kg-1)麻醉各組孕鼠,心臟取血,4 ℃靜置過夜,收集血清,以1 500 r·min-1、4 ℃離心10 min,取上清用于ELISA檢測;記錄各組大鼠孕有仔鼠數量及存活率;大鼠及仔鼠均實施安樂死,取胎盤組織稱質量,并分別保存于40 g·L-1多聚甲醛和液氮中,用于組織病理學染色、LDH活性及蛋白質印跡法(Western blotting)檢測。

2.3 Bradford法定量大鼠24 h尿蛋白

設置對照孔及樣本孔:蛋白對照品稀釋至0.5 μg·μL-1,吸取不同體積對照品置于標準孔內,用磷酸鹽緩沖溶液補足至20 μL,于反應孔內加入稀釋20倍的尿液樣本20 μL,于對照孔及樣本孔內均加入200 μL考馬斯亮藍G250染色液,混勻,室溫靜置5 min,于570 nm波長處測定各孔吸光度(A)值,繪制標準曲線并計算尿液樣本24 h尿蛋白含量。

2.4 HE染色觀察胎盤組織病理學變化

胎盤組織經40 g·L-1多聚甲醛固定24 h,常規石蠟包埋,制備成5 μm石蠟切片,二甲苯脫蠟至水,蘇木素染核5 min,體積分數1%鹽酸乙醇分化10 s,氨水返藍3 s,水洗,伊紅染液染核30 s,水洗,脫水透明,晾干后用中性樹膠封片,鏡下觀察并采集圖片。

2.5 TUNEL染色檢測胎盤滋養層細胞凋亡指數

用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、無DNase蛋白酶K溶液處理20 min,50 μL TUNEL反應液反應1 h,過氧化物酶封閉,與底物二氨基聯苯胺混合液反應顯色,蘇木精復染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。見細胞質或細胞核中有棕色顆粒,即呈染色陽性。細胞凋亡指數=(TUNEL陽性細胞數/細胞總數)×100%。

2.6 ELISA檢測大鼠血清中相關因子水平

設置對照品孔和樣本孔,分別滴加50 μL不同質量濃度對照品及10倍稀釋的待測樣品,加酶標工作液溫育1 h,洗板,依次加底物A、B避光孵育15 min,滴加終止液終止反應,于450 nm波長處測定各孔A值,以對照品質量濃度作橫坐標、對應A值作縱坐標,繪制出對照品線性回歸曲線,計算各組大鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-33及sST2的水平。

2.7 IL-33、ST2L蛋白相對表達水平

取液氮保存的各組大鼠胎盤組織,研缽碾碎,用預冷的RIPA裂解液裂解,勻漿后離心,取上清,測定蛋白質量濃度并加熱變性蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳(壓縮膠60 V 25 min,分離膠120 V 62 min),轉膜(200 mA,110 min),50 mg·mL-1脫脂乳(1×TBST稀釋)室溫封閉PVDF膜2 h;后加一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜;次日洗膜,換液6次,辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(1∶8 000稀釋)室溫孵育2 h,洗膜,換液6次,ECL反應顯影,于化學發光凝膠成像系統中觀察并記錄。Image J軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白IL-33、ST2L與內參β-actin灰度值的比值表示蛋白的相對表達水平。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠Ed 15、Ed 21尾動脈血壓

尾動脈血壓測量結果顯示,各組大鼠Ed 15尾動脈血壓比較差異無統計學意義(P>0.05),Ed 21尾動脈血壓比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組大鼠Ed 21尾動脈血壓升高(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組大鼠Ed 21尾動脈血壓降低(P<0.05);與葛根素低劑量組比較,葛根素高劑量組、阿司匹林組大鼠Ed 21尾動脈血壓降低(P<0.05),阿司匹林組最低(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠Ed 15、Ed 21尾動脈血壓

3.2 大鼠24 h尿蛋白含量

尿蛋白定量結果顯示,各組大鼠24 h尿蛋白含量比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組大鼠24 h尿蛋白含量增加(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組大鼠24 h尿蛋白含量減少(P<0.05);與葛根素低劑量組比較,葛根素高劑量組、阿司匹林組大鼠24 h尿蛋白含量減少(P<0.05),阿司匹林組含量最少(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠24 h尿蛋白含量

3.3 大鼠孕有仔鼠的數量及存活率

各組大鼠孕有仔鼠的數量及仔鼠存活率比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組大鼠孕有仔鼠的數量及仔鼠存活率降低(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組大鼠孕有仔鼠的數量及仔鼠存活率升高(P<0.05);與葛根素低劑量組比較,葛根素高劑量組、阿司匹林組大鼠孕有仔鼠的數量及仔鼠存活率升高(P<0.05),阿司匹林組最高(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠孕有仔鼠的數量及仔鼠的存活率

3.4 大鼠胎盤組織的質量

結果顯示,各組大鼠胎盤組織質量比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組大鼠胎盤組織質量減輕(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組大鼠胎盤組織質量增加(P<0.05);與葛根素低劑量組比較,葛根素高劑量組、阿司匹林組大鼠胎盤組織質量增加(P<0.05),阿司匹林組質量增加更明顯(P<0.05)。見表4。

表4 大鼠胎盤組織的質量

3.5 孕鼠胎盤組織的病理變化情況

HE染色結果顯示,對照組大鼠胎盤組織未見炎性浸潤,細胞排列有序,結構完整、規則,毛細血管分布均勻;與對照組比較,模型組大鼠胎盤組織結構紊亂,毛細血管減少,細胞間隙變大,排列疏松,見明顯炎性浸潤;與模型組比較,3個給藥組大鼠胎盤組織病理情況均改善。見圖1。

注:A.對照組;B.模型組;C.葛根素低劑量組;D.葛根素高劑量;E.阿司匹林組。

3.6 孕鼠胎盤滋養層細胞的凋亡情況

TUNEL染色結果顯示,4組大鼠胎盤滋養層細胞凋亡指數比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠胎盤滋養層細胞凋亡指數降低(P<0.05);與葛根素低劑量組比較,葛根素高劑量組及阿司匹林組大鼠胎盤滋養層細胞凋亡指數降低(P<0.05),阿司匹林組降低更多(P<0.05)。見表5、圖2。

表5 大鼠胎盤滋養層細胞的凋亡情況

3.7 大鼠的血清諸項指標水平

ELISA結果顯示,各組大鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-33及sST2水平比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組大鼠血清TNF-α、IFN-γ及sST2水平升高,IL-4、IL-10及IL-33水平降低(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組大鼠血清TNF-α、IFN-γ及sST2水平降低,IL-4、IL-10及IL-33水平升高(P<0.05);與葛根素低劑量組比較,葛根素高劑量組、阿司匹林組大鼠血清TNF-α、IFN-γ及sST2水平降低,IL-4、IL-10及IL-33水平升高(P<0.05),阿司匹林組諸項指數水平的變化更明顯(P<0.05)。見表6。

表6 大鼠血清相關因子水平

3.8 孕鼠胎盤組織的諸項蛋白表達水平

Western blotting結果顯示,各組大鼠胎盤組織中IL-33、ST2L蛋白相對表達水平比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組大鼠胎盤組織中IL-33蛋白相對表達水平降低,ST2L蛋白相對表達水平升高(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組大鼠胎盤組織中IL-33蛋白相對表達水平升高,ST2L蛋白相對表達水平降低(P<0.05);與葛根素低劑量組比較,葛根素高劑量組及阿司匹林組大鼠胎盤組織中IL-33蛋白相對表達水平升高,ST2L蛋白相對表達水平降低(P<0.05),阿司匹林組諸項蛋白相對表達水平的變化更明顯(P<0.05)。見圖3、表7。

注:A.對照組;B.模型組;C.葛根素低劑量組;D.葛根素高劑量;E.阿司匹林組。

表7 大鼠胎盤組織中IL-33、ST2L蛋白相對表達水平n=10)

4 討論

一氧化氮對于正常的螺旋動脈重塑和妊娠至關重要,其缺乏可導致妊娠小鼠PE子宮及胎盤病理改變[11],L-NAME為一氧化氮合酶抑制劑,常用于誘導構建PE大鼠模型[12]。本研究中皮下注射L-NAME初期各組妊娠大鼠尾動脈血壓比較差異無統計學意義,經連續注射后,與對照組比較,模型組大鼠尾動脈血壓及24 h尿蛋白含量均顯著升高,表明L-NAME于妊娠中后期可誘發PE綜合征,表現為高血壓和蛋白尿[13],提示成功構建PE大鼠模型。

阿司匹林是目前唯一推薦的被用作預防PE的妊娠干預藥物[14],可通過促炎通路改善PE癥狀及人滋養層細胞損傷[15-16],本研究結果顯示,與模型組比較,大鼠尾動脈血壓及24 h尿蛋白含量降低,表明葛根素可降低孕鼠前期子癇高血壓并緩解蛋白尿癥狀;胎盤為母體及胎兒之間呼吸氣體、營養物質及廢物的運輸器官,其生長及發育對胎兒的正常生長和存活至關重要,其中胎盤滋養層細胞發生炎癥和細胞凋亡過度激活可導致胎盤異常[17]。胎兒生長受限主要在于妊娠早期子宮螺旋動脈重塑不足及胎盤分布血管減少[18-19],進而誘發的炎癥反應及胎盤組織損傷可導致幼崽存活率下降[20],研究發現,PE大鼠孕有仔鼠數量及存活率均降低[21],與對照組比較,模型組大鼠胎盤組織質量減輕,結構紊亂,毛細血管減少,細胞間隙變大,見有明顯炎性浸潤且細胞凋亡嚴重,大鼠孕有仔鼠數量及仔鼠存活率均顯著降低,而經葛根素低劑量、高劑量治療后可改善胎盤組織病理和仔鼠生存情況,表明葛根素可改善PE癥狀,且可能與炎癥反應相關。

正常妊娠與輕度全身性炎癥反應和Th2細胞免疫偏向有關,當免疫細胞群體失調,Th1細胞免疫偏向促進慢性免疫激活,抗炎與促炎細胞因子失衡引起的強烈炎癥反應將導致胎盤組織損傷并誘導PE發生[22]。TNF-α是母體免疫系統的重要介質,可通過增加血管通透性影響并損傷內皮細胞功能、誘導滋養層細胞凋亡,使母體炎癥復雜化[23],許多研究表明,TNF-α在PE時質量濃度增加,IL-4、IL-10為抗炎細胞因子,由Th2細胞分泌,在PE中與促炎細胞因子呈負相關[24];IFN-γ由Th1細胞分泌,可有效誘導PE內皮激活及過度炎癥發生[25]。本研究結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠血清中促炎因子TNF-α、IFN-γ水平升高,抗炎因子IL-4、IL-10水平降低,表明正常妊娠Th1/Th2免疫失衡可導致機體促炎狀態反應,并促進PE發生、發展,經葛根素低、高劑量治療后,TNF-α、IFN-γ水平降低,IL-4、IL-10水平升高,表明葛根素可能通過調節Th2細胞免疫偏向,促進免疫失衡狀態的恢復,進而減輕炎癥反應,改善PE病理癥狀。

IL-33釋放至細胞外后可啟動并維持Th2型相關免疫反應;當易位至細胞核時,可抑制促炎信號[6]。sST2被認為是IL-33的誘餌受體,高水平的sST2可與ST2L競爭性結合IL-33,促進Th1免疫反應,促進Th1細胞免疫偏向,ST2L則可刺激IL-33引起Th2細胞因子及免疫因子產生[26]。本研究結果顯示,模型組大鼠血清sST2水平升高、IL-33水平降低;胎盤組織中ST2L蛋白相對表達水平升高、IL-33蛋白相對表達水平降低,表明循環中高水平sST2可能通過競爭性結合IL-33蛋白,導致ST2L蛋白相對表達水平升高,并促進免疫細胞偏向失調及促炎/抗炎狀態的失衡,誘導PE發生及發展。葛根素低劑量、高劑量治療后可有效降低sST2循環水平,提高IL-33含量,ST2L因結合IL-33而表現為蛋白相對表達水平降低,表明葛根素可能通過降低循環中誘餌受體sST2水平,提高循環及胎盤組織中IL-33含量促進Th2免疫細胞偏向及抗炎/促炎因子失調的恢復,進而改善PE大鼠胎盤組織損傷。

綜上所述,葛根素可促進循環中抗炎/促炎因子失調的恢復,降低PE大鼠高血壓及24 h尿蛋白含量,減輕胎盤組織結構病理改變,滋養層細胞的凋亡及孕鼠及仔鼠發病情況,其作用機制可能與降低sST2水平、促進IL-33的表達,進而調節免疫失衡有關。