畢赤酵母發酵耦合多糖酶解一步法制備結冷膠寡糖

李宏雨,施旭,詹曉北,朱莉,蔣蕓,高敏杰

(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

結冷膠是鞘氨單胞菌產生的一種胞外多糖,它是由→3)-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖醛酸-(1→4)-β-D-葡萄糖-(1→4)-α-L-鼠李糖-(1→為重復結構組成的線性陰離子雜多糖[1]。結冷膠具有良好的安全性、凝膠性、互溶性、穩定性等優越的性能,不僅在食品領域,還在生物醫藥、化工、環境等行業得到廣泛的應用[2-4]。

目前,低聚糖的功能活性已引起廣泛關注。例如,已有研究報道了α-1,3-葡寡糖和卡拉膠低聚糖具有抗腫瘤活性[5-6],殼寡糖表現出了植物的抗病性[7]。具有不同結構性質的寡糖可能具有不同的生物活性,其中聚合度被認為是對分子功能特性影響最大的參數之一。特定聚合度寡糖可能具有特定的功能活性,如麥芽七糖可以作為蛋白質和細胞的特異性識別標記[8]。此外,一些寡糖的功能活性與聚合度大小呈現了相關性,如殼寡糖對超氧自由基的清除能力也與聚合度大小成正相關[9]。近年研究者發現利用酸水解結冷膠得到的低聚結冷膠具有植物的抗菌活性[10],并且能夠促進植物生長和改善植物葉片品質[11],結冷膠寡糖也被發現是一種潛在的益生元[12]。大多數關于結冷膠寡糖的應用和生物活性的研究主要是基于混合形式的,因此降解結冷膠制備特定聚合度結冷膠寡糖具有重要意義。傳統的低聚糖生產方法多是對多糖進行化學降解和酶法降解。化學降解被認為是多糖降解的經典方法,化學降解具有操作簡便、成本低等優點[13],但化學降解對環境污染大且得到的產物組分往往比較復雜,阻礙了后續的分離純化。酶法降解因為其特異性高而能得到均一的目標產物,且反應溫和得到了越來越多的關注。酶法降解可以有效克服化學降解產物成分復雜的缺點,簡化特定聚合度結冷膠寡糖生產的過程,提高結冷膠寡糖定向生產的實用性。

本研究利用前期實驗室構建的含有結冷膠裂解酶基因的重組畢赤酵母進行外源表達,得到結冷膠裂解酶,并開發了畢赤酵母發酵耦合多糖酶解一步法制備單一聚合度結冷膠寡糖的方法——在結冷膠裂解酶發酵初始添加結冷膠,以達到生產結冷膠裂解酶并實時降解多糖,實現一步制備結冷膠寡糖的目的,并將酶解制備的結冷膠寡糖與酸解結冷膠寡糖加以對比,分別利用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer, FTIR)與基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)來解析2種產物在結構與分子質量方面的差異。以期為制備單一聚合度寡糖,進一步研究特定聚合度結冷膠寡糖功能活性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

低酰基結冷膠(食品級)購自江蘇仟泊生物工程有限公司;蛋白胨、酵母粉、甘油和無水甲醇等購自國藥集團化學試劑有限公司。

RE-5205型旋轉蒸發器,上海亞榮生化儀器廠;3K15型高速冷凍離心機,德國Sigma公司; ultrafleXtreme型質譜儀,美國Bruker Daltonics公司;MULTISKAN FC型酶標儀,美國Thermo Fisher Scientific公司;NEXUS型傅里葉變換紅外光譜儀,美國Nicolet公司。

1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)(g/L):酵母粉 10,蛋白胨 20,葡萄糖 20(固體培養基加入瓊脂粉20)。

甘油緩沖復合培養基(buffered glycerol-complex medium, BMGY)(g/L):酵母粉 10,蛋白胨 20, YNB 13.4,生物素 4×10-5,甘油 10,K3PO4緩沖液濃度100 mmol/L,pH 6.0。

誘導表達培養基(buffered methanol-complex medium, BMMY)(g/L):酵母粉 10,蛋白胨 20,YNB 13.4,生物素 4×10-5,甲醇 10 mL/L,K3PO4緩沖液濃度100 mmol/L,pH 6.0。

1.3 搖瓶發酵方法

將前期實驗室構建的含有結冷膠裂解酶基因的重組畢赤酵母劃線接種于YPD平板培養基上,在30 ℃恒溫培養箱中倒置活化60～72 h。活化結束后,挑取單菌落接種至BMGY液體培養基中(裝液量10%,體積分數),30 ℃、200 r/min培養16～18 h至OD600值達到4～6,得到種子液。4 ℃下無菌收集種子液菌體接種至BMMY液體培養基(裝液量20%,體積分數)中,30 ℃、200 r/min培養3～4 d發酵結束,每24 h補加體積分數1.0%的甲醇。

1.4 搖瓶發酵條件優化

按1.3節中所述方法獲得種子液。設置初始發酵條件:酵母粉添加量20 g/L,甲醇添加量1%,pH 6.0。保持其他條件不變,調整發酵初始酵母粉添加量為0、5、10、15、20、25、30、35、40 g/L研究發酵初始酵母粉添加量對畢赤酵母生長、結冷膠裂解酶酶活力的影響。以同樣的方法研究不同pH(3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5)、不同甲醇添加量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%,體積分數)對畢赤酵母生長、結冷膠裂解酶酶活力的影響,以尋求重組畢赤酵母的最佳發酵條件。

1.5 畢赤酵母發酵耦合多糖酶解一步法制備結冷膠寡糖及條件優化

稱取適量結冷膠添加至BMMY液體培養基中,收集按1.3節中所述方法獲得的種子液中的菌體接種至添加了結冷膠的BMMY培養基中,30 ℃、200 r/min培養至發酵結束。保持其他條件不變,調整發酵初始結冷膠添加量為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L,研究發酵初始結冷膠添加量對結冷膠寡糖產量的影響。以初始結冷膠添加量2%,其他條件不變,研究發酵時間對結冷膠寡糖產量的影響。

1.6 酸水解結冷膠條件優化

1.6.1 底物濃度優化

分別稱取1、3、5、7 g/L的食品級低酰基結冷膠溶于適量蒸餾水中,90 ℃水浴加熱至結冷膠完全溶解,補加蒸餾水與濃鹽酸至終溶液中HCl濃度為0.5 mol/L。將配制好的水解液置于70 ℃水浴鍋中加熱水解3 h。水解結束后分別取樣待后續薄層色譜分析。

1.6.2 HCl濃度優化

稱取4份5 g/L的食品級低酰基結冷膠溶于適量蒸餾水中,90 ℃水浴加熱至結冷膠完全溶解,補加蒸餾水與濃鹽酸至終溶液中的HCl濃度分別為0.25、0.5、0.75、1 mol/L。將配制好的水解液置于70 ℃水浴鍋中加熱水解3 h。水解結束后分別取樣待后續薄層色譜分析。

1.6.3 水解時間優化

稱取5 g/L的食品級低酰基結冷膠溶于適量蒸餾水中,90 ℃水浴加熱至結冷膠完全溶解,補加蒸餾水與濃鹽酸至終溶液中的HCl濃度為0.5 mol/L。將配制好的水解液置于70 ℃水浴鍋加熱水解6 h,每小時取樣1次待后續薄層色譜分析。

1.7 結冷膠寡糖純化方法

1.7.1 酸解結冷膠寡糖純化方法

酸水解結束后加入NaOH將水解液pH調至7,然后離心除去未水解的懸浮物,上清液旋轉蒸發濃縮至水解液體積的1/10,得到濃縮液。在濃縮液中添加6倍體積的無水乙醇進行醇沉,4 ℃冰箱過夜后收集上清液繼續添加4倍濃縮液體積的無水乙醇,4 ℃冰箱過夜后收集沉淀。用去離子水復溶沉淀,將復溶液體加入100～500 Da的透析袋進行透析除鹽。

1.7.2 酶解結冷膠寡糖純化方法

發酵降解結束后的發酵液離心除去菌體,上清液旋轉蒸發濃縮至發酵液體積的1/10,得到濃縮液后添加7倍體積的無水乙醇進行醇沉,4 ℃冰箱過夜后收集上清液繼續添加3倍濃縮液體積的無水乙醇,4 ℃冰箱過夜后收集沉淀。去離子水復溶沉淀后,通過Sevage[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]法除蛋白[V(發酵液)∶V(Sevage試劑)=4∶1]。除蛋白后通過C18固相萃取小柱進一步除蛋白及色素等其他雜質。最后,將除雜后的糖液加入100～500 Da的透析袋進行透析除鹽。

C18固相萃取小柱純化方法[14]:用1～2倍柱體積的乙腈對小柱進行活化;用1～2倍體積的去離子水淋洗小柱;上樣,并收集流出液體;用1～2倍體積去離子水淋洗小柱,并收集水洗液。

1.8 分析檢測方法

1.8.1 還原糖含量測定

采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)比色法。取1 mL稀釋到適當濃度的發酵液,加入1.5 mL DNS試劑,沸水浴加熱5 min,冷卻至室溫加蒸餾水至10 mL,550 nm下測定吸光度。用蒸餾水代替發酵液做空白對照。根據標準曲線計算出吸光度。

1.8.2 酶活力測定方法

取250 μL酶液與250 μL磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH 6.0)混合,加入500 μL結冷膠水溶液(0.5 g/L)45 ℃水浴20 min,煮沸10 min終止反應。用DNS比色法測定反應體系中的還原糖含量,方法如1.8.1節所述。酶活力定義:1 min轉化底物生成1 μmol還原糖所需的結冷膠裂解酶量為1個酶活力單位(U)。

1.8.3 薄層色譜分析

將制備好的樣品點于薄層板上,點樣量2 μL,晾干后放入裝有展開劑的層析缸中將產物進行分離。層析完晾干薄層板,均勻噴上顯色劑于105 ℃烘箱顯色5 min。

酸解產物展開劑:V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)∶V(水)=5∶5∶2;酶解產物展開劑:V(正丙醇)∶V(乙酸)∶V(水)=5∶2∶3;顯色劑:900 mg地衣酚,25 mL水,375 mL乙醇,50 mL濃H2SO4。

1.8.4 FTIR分析

稱取制備好的凍干后的結冷膠寡糖5 mg,使用傅里葉變換紅外光譜儀在波數4 000～400 cm-1區間內進行掃描。

1.8.5 MALDI-TOF-MS分析

配制1 g/L的寡糖凍干樣品溶液,取1 μL基質點于質譜預制靶上,再取1 μL樣品與基質混合,真空泵中抽干液體水分待測量,在m/z400～2 000的質量范圍內進行分析。

2 結果與分析

2.1 酸水解制備結冷膠寡糖及其條件優化

酸水解多糖是無規則降解,所得產物往往組分復雜[15]。酸濃度、水解時間、底物濃度均能影響酸水解效果,控制幾個重要的影響水解效果的因素對結冷膠進行酸水解以提高產物得率,并將制得的酸解產物與酶解產物進行對比分析。圖1-a是不同底物質量濃度對酸水解效果影響的薄層色譜分析,根據斑點顏色深淺可大致判斷樣品濃度。各聚合度的寡糖含量隨底物濃度增加而增加,但當底物質量濃度超過5 g/L時變化不再明顯,因此5 g/L是一個較為合適的底物質量濃度。圖1-b是不同HCl濃度對酸水解效果影響的薄層色譜分析,當HCl濃度為0.25 mol/L時,主要產物為聚合度為5和8的寡糖。隨HCl濃度增加,聚合度<5的寡糖逐漸增多,但聚合度>5的寡糖逐漸減少;當HCl濃度為0.75 mol/L時,聚合度為8的寡糖在薄層色譜板上幾乎消失。盡管聚合度<5的寡糖隨HCl濃度增加而逐漸增加,但當HCl濃度超過0.5 mol/L時,寡糖聚合度范圍卻在變小,逐漸出現一些單糖和二糖,這與得到更多低聚糖的目標不符。考慮目標產物特性,最終選取0.5 mol/L HCl進行下一步實驗。

圖1 底物質量濃度(a)、HCl濃度(b)、水解時間(c)對酸的水解效果Fig.1 The effects of substrate concentrations (a), HCl concentrations (b), and hydrolysis time (c) on acid hydrolysis

圖1-c是不同水解時間對酸水解效果影響的薄層色譜分析,隨水解時間的增加,聚合度<5的寡糖逐漸增加,聚合度>5的寡糖逐漸減少;但從4 h開始,聚合度>5的寡糖逐漸消失。并且水解時間越長產生的單糖和二糖越多,因此選擇水解3 h進行下一步實驗。最終酸水解選擇底物質量濃度5 g/L,HCl濃度0.5 mol/L,水解3 h作為適宜水解條件制備結冷膠寡糖。

2.2 結冷膠裂解酶發酵條件優化

酶解多糖制備寡糖具有產物專一且溫和的特點,本研究是利用前期實驗室構建的含有結冷膠裂解酶基因(來源于Bacillussp.GL1)的重組畢赤酵母進行外源表達得到結冷膠裂解酶[16]。酶活力對于寡糖產量至關重要,酶活力越高則產物產量越高,因此有必要對發酵條件進行優化。重組結冷膠裂解酶是在畢赤酵母中以AOX1為啟動子進行表達,因此在發酵過程中是以甲醇為唯一碳源誘導表達蛋白。發酵過程中氮源、碳源與pH都是微生物生長過程中的重要因素[17],因此分別研究了發酵初始酵母粉添加量、甲醇添加量與發酵初始pH對酶活力的影響。由圖2-a可知,在酵母粉添加量為20 g/L時,重組結冷膠裂解酶酶活力最大;如圖2-b所示,甲醇添加量為1%時,重組結冷膠裂解酶酶活力最大;從圖2-c可知,pH為6.0時,重組結冷膠裂解酶酶活力最大。綜上,選擇發酵初始酵母粉添加量20 g/L,甲醇添加量1%,pH 6.0是重組結冷膠裂解酶的適宜發酵條件。

a-酵母粉添加量;b-甲醇添加量;c-pH圖2 結冷膠裂解酶發酵條件優化Fig.2 Optimization of fermentation conditions for gellan lyase

2.3 酶解制備結冷膠寡糖及條件優化

傳統的酶降解法是先通過發酵生產目標酶,然后直接用粗酶液或是將酶分離純化后對多糖進行降解。用粗酶液直接進行降解需要先將酶生產出來再降解多糖,而酶的分離純化因蛋白質結構復雜、易失活等原因往往需要幾種純化技術聯用才能夠得到目標蛋白[18],降解結束后還需要一系列的寡糖純化步驟,這樣極大地降低了酶法降解結冷膠生產結冷膠寡糖的效率。為了縮短酶法降解的時間,提高酶法降解效率,提出了畢赤酵母發酵耦合多糖水解一步法制備結冷膠寡糖的策略——在結冷膠裂解酶發酵初始添加結冷膠,以達到生產結冷膠裂解酶并實時降解多糖,實現一步制備結冷膠寡糖的目的。為此分別對發酵初始結冷膠添加量與發酵時間進行優化,以確定結冷膠寡糖產量更高的降解條件。圖3-a顯示結冷膠寡糖隨結冷膠添加量增加而逐漸增加,當結冷膠添加量>2.0 g/L時,結冷膠寡糖幾乎不再增加。圖3-b顯示結果與薄層色譜分析結果大致相同,隨結冷膠添加量的增加還原糖產量逐漸增加,但當結冷膠添加量>2.5 g/L時,還原糖產量增加量變少。在優化過程中,觀察到由于結冷膠在常溫下溶解度不高的原因,當結冷膠添加量>2 g/L時,會造成發酵培養基凝結的問題,為了既能夠生成較多的結冷膠寡糖又不影響結冷膠裂解酶的生產,綜合考慮最終確定發酵初始添加2.0 g/L的結冷膠較為合適。

a-薄層色譜分析;b-還原糖產量圖3 不同結冷膠添加量對酶降解效果的影響Fig.3 The effect of different gellan gum addition on enzymatic degradation

為進一步提高酶法降解的效率,對發酵時間進行優化,圖4-a顯示,結冷膠寡糖隨時間增加而逐漸增多。圖4-b可知,還原糖產量隨發酵時間增加而增多,但當發酵96 h后、還原糖產量增速變慢,可能是發酵后期一些細胞產生自噬現象[19],限制了甲醇利用效率,導致發酵后期還原糖產量基本不再增加,最終確定發酵96 h為最佳發酵時間。

a-薄層色譜分析;b-還原糖產量圖4 發酵時間對酶降解效果的影響Fig.4 The effect of fermentation time on enzymatic degradation

2.4 產物分析

a-商品結冷膠;b-酸水解結冷膠寡糖;c-酶水解結冷膠寡糖圖5 降解產物的FTIR譜Fig.5 FTIR spectra of the degradation products

進一步通過MALDI-TOF-MS來確定2種水解方式得到的寡糖的分子質量。如圖6-a所示,在[M-H]-m/z845.12、1 309.45、1 955.67處檢測到3個結冷膠寡糖成分,表明酸水解后得到了聚合度為5、8、12的結冷膠寡糖。圖6-b是酶解結冷膠寡糖的質譜分析圖,在[M+Na]+m/z669.34處檢測到一個結冷膠寡糖成分,表明酶解后得到了聚合度為4的結冷膠寡糖,這一結果正是酶解產物的專一性導致的。因此,酶解法能夠克服酸解法產物組分復雜的特點,成功制備出單一聚合度的結冷膠寡糖。

a-酸解產物MALDI-TOF-MS分析;b-酶解產物MALDI-TOF-MS分析圖6 降解產物的MALDI-TOF-MS譜圖Fig.6 MALDI-TOF-MS spectrum of the degradation products

3 結論