酵母菌對高鹽稀態醬油風味強化研究進展

苗春雷,朱婭媛,黃卓權,張敏倩,朱新貴,2*

1(李錦記(新會)食品有限公司,廣東 江門,529100)2(華南農業大學 食品學院,廣東 廣州,510642)

醬油作為東亞國家重要的飲食調味品,其色、香、味在釀造過程中形成的豐富度及協調度是影響消費者對醬油接受程度的主要因素[1]。與色澤和滋味不同,醬油的風味較難通過后期調配以達到人們期望的感官品質。這是由于醬油的香氣成分豐富且復雜,風味的構成與各種微生物長期的相互作用和代謝有關[2-3]。現階段醬油的釀造多采用高鹽稀態發酵法,霉菌、細菌及酵母菌的不斷繁殖使高鹽度的醬醪在3～6個月的時間里緩慢發酵[4]。由于競爭性抑制,在制曲及鹽水發酵前期,醬油中米曲霉占據優勢大量生長,分泌大量蛋白酶和糖苷水解酶水解原料中的多糖和蛋白質[5-6]。這些酶解產物不僅構成了醬油的基礎風味,分解生成的小分子營養組分也會為后期微生物的繁殖創造物質條件。在整個發酵周期內,醬醪微生物群落由耐鹽和耐酸性較差的前期優勢菌株向耐受性較強的菌株逐漸演變,在發酵后期,醬醪中的真菌以酵母菌為主[7-8]。

醬油中的揮發性風味化合物可分為醇類、酯類、酚類、醛類、酸類、酮類、吡嗪類、呋喃類等。研究表明,這些風味化合物的種類和含量與醬醪中酵母菌的繁殖情況密切相關[9]。近年來,隨著代謝組學及測序技術的發展,酵母菌與醬油風味形成的相關性逐步得到了揭示和報道[10-12]。本文將對醬油主要風味組分及不同酵母菌對各類風味化合物的貢獻程度進行綜述,為醬油風味的定向強化提供理論依據,并對未來醬油生產工藝的研究及發展方向進行展望。

1 高鹽稀態醬油中的特征性風味化合物

發酵食品均具有其獨特的香氣,人們通常只要憑借其特征風味即可判斷出食品的種類。而食物的特征風味實際上是多種揮發性化合物綜合作用的結果。作為一種風味多樣的釀造調味品,醬油中存在的,并已得到重復報道驗證的揮發性組分累計達到400余種[13]。不同醬油風味的差異基本來源于釀造原料、微生物菌群結構及生產工藝參數的不同[14]。雖然醬油的產品風味具有顯著的多樣性,但釀造過程均遵循GB 2717—2018《食品安全國家標準 醬油》中相對規范的生產原則,即采用大豆、小麥或其副產物為原料,經米曲霉制曲發酵而成,這就使得醬油在釀造過程中可產生成分相對固定的且具有辨識性的特征性風味組分。目前文獻報道較為集中的醬油特征性風味化合物根據各自類別整理如表1所示。

表1 醬油特征性風味化合物[15-21]Table 1 Characteristic flavor compounds of soy sauce[15-21]

在醬油整體的風味物質構成中,醇類和酸類是揮發性組分中含量最多的2類化合物[22]。醬油中醇類化合物主要為微生物代謝產生,其中乙醇所占比重通常最大,這種酵母初級代謝產物是使各類發酵產品產生令人愉悅風味的重要化合物[23-24]。糠醇、苯乙醇則是醬油特征風味構成的關鍵化合物,它們均具有較高的沸點,在烹調過程中不易損失。糠醇呈現煙熏香,可使醬油風味更加濃郁,苯乙醇則呈玫瑰花香氣,是酵母菌降解苯丙氨酸的產物[25]。其他醇類化合物如2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇同樣為擁有較高風味活性值的揮發性物質,主要呈現麥芽香氣、苦杏仁風味,同時在非揮發狀態下可貢獻醬油的酸味及焦糖味口感[26]。1-辛烯-3-醇的主要來源是原料的制曲階段,是米曲霉孢子的特征風味,因此當孢子浸于醪液后可為醬油帶來令人愉悅的蘑菇香氣[27]。自然發酵的條件下,這些多元醇和高級醇的大量產生通常在發酵的中后期,與醬醪中酵母的繁殖情況呈現正相關。揮發性酸類化合物主要為乙酸、丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸等,這些揮發性酸類為醬油的風味提供甜香、酸香及奶酪香,并同樣可作為各類酯化反應的前體物質,同時它們還可以降低醪液的pH值,為耐鹽酵母菌的大量繁殖創造有利環境。其中乙酸所擁有的刺激性香氣對醬油的整體風味具有一定的協調作用[22],而2-甲基丁酸、3-甲基丁酸含量則需要得到適當的控制,因其在低濃度下呈現水果香,而積累到較高的濃度會帶來不愉快的腐臭味,對醬油的品質造成影響[28]。

醛類化合物在醬油中的含量較少,但其風味活性值通常較高[29],因此同樣為醬油風味的重要組成部分。這些醛類的生成途徑可能由Strecker降解反應以及微生物代謝或分解原料得到[30]。在醛類化合物中,乙醛的占比通常較高,其具有強烈的刺激性香氣,是酵母酒精發酵的中間代謝產物。苯甲醛、苯乙醛呈現水果香及花香,2-甲基丁醛、3-甲基丁醛呈現堅果及奶酪香,它們對醬油特征風味的形成同樣具有較大貢獻[31]。壬醛、癸醛主要為柑橘香及脂肪香,少量存在即可提升醬油風味的層次感及豐富度。值得注意的是,相對于生醬油,滅菌后的熟醬油中醛類化合物含量通常會得到大幅增加且醬油風味也得到了增強,這表明除微生物的生化合成外,由化學反應生成的醛類同樣占較大比重。酮類化合物中的1-羥基-2-丙酮呈現啤酒、煙草風味,3-羥基-2-丁酮具有令人愉悅的乳制品及草莓香氣,它們可為醬油帶來醇厚的風味。近年來的研究分離得到HDMF/HEMF并確認它們為醬油醬香來源關鍵的風味化合物[32],并且只在釀造醬油中被檢出,是由微生物代謝產生的糖類及氨基酸通過美拉德反應獲得或由酵母產生的酶催化反應產生[33-34]。3-羥基-2-甲基-4-吡喃酮俗稱為麥芽酚,可能由醬油生產中使用的原料小麥焙炒產生,或源于霉菌與細菌代謝產物的氧化,可為醬油帶來焦香風味。

醬油中的揮發性酯類化合物主要由醬醪中酵母分泌的酶催化或經非酶酯化反應產生[35],由于醪液中的醇類以乙醇為主,所以酯化反應生成的酯類多為乙酯。酯類化合物帶有的花香和果香可使醬油的整體風味趨向于濃郁且柔和[36]。中低級揮發性脂肪酸酯中乙酸乙酯的含量最多,但在長時間的發酵過程中呈現先增后減的趨勢。芳香酸酯以沸點較高的苯乙酸乙酯為主,具有濃烈的蜂蜜香氣,是構成醬油特征風味的重要組分[37]。高級脂肪酸酯以亞油酸乙酯為主,主要由曲霉等微生物的脂酶水解出的脂肪酸轉化得到,其貢獻了醬油濃郁的后味。醬油中脂肪酸酯的主要來源是大豆中的脂肪分解,因此大豆品種及油脂含量對醬油的酯類構成及風味有著不可忽視的影響[38]。通常情況下,低沸點酯通常都具有強烈的芳香,對點蘸類醬油貢獻較大,但在烹調過程中較難存留。而高級酸類構成的酯沸點較高,因此在醬油的調味過程中保留程度較高。

醬油中的酚類化合物均具有一定的揮發性,盡管種類有限,但對醬油的風味仍具有較大影響。這些酚類化合物多呈現煙熏香或麥芽烘焙的風味[39],愈創木酚主要為微生物代謝香草酸產生[40],其在發酵酒類中可能會被視為異味成分,但在醬油中卻是構成產品關鍵特征風味的重要部分。4-EG和4-乙基苯酚為構成醬油醬香風味的核心化合物,其中4-EG主要通過酵母代謝阿魏酸產生[41],呈味閾值極低,在醬油中的含量小幅變化即可對產品品質產生顯著影響。這些酚類化合物雖然在發酵初期產生較少,但其含量會隨著發酵的進行逐漸增加并積累,因此被認為與醬醪中酵母的繁殖存在相關性。

以吡嗪類、吡咯類、呋喃類為主的一些雜環化合物主要在美拉德反應過程合成或降解產生[42]。反應的底物多來源于微生物的代謝產物或分泌的酶水解原料。這些雜環化合物中,吡嗪類化合物被檢測到的種類相對較多,多呈現烤肉香、咖啡香,賦予醬油豆香與醬香。2-乙酰基呋喃具有堅果、焦糖等香氣,2-乙酰基吡咯具有烘烤香、堅果香味,為醬油賦予了濃郁厚重的風味,同時它們也是食品原料中普遍存在的天然風味物質。近年有研究表明,這些雜環化合物可隨著特定微生物的代謝直接或間接產生[43],因此這些雜環風味化合物存在著被選擇性提升的潛力。雖然在醬油中檢測到這幾類雜環化合物的含量均相對較少,但它們的風味閾值較低[44],少量存在即可強化感官分辨效果,對食品整體風味產生貢獻。

2 不同酵母菌對醬油風味的強化

醬油釀造過程實質上是微生物的繁殖代謝及相互作用的一系列活動。由于醬油的發酵環境開放、且發酵周期漫長,自然環境中的微生物會持續的通過各種途徑被攜帶進入醬醪,其中一些耐鹽性微生物則有機會在醬醪中成功定殖。這種開放式多菌種共存的發酵體系,不僅豐富了醬油的口味,還可以顯著改善醬油的感官風味。根據醬醪中優勢微生物的動態變化趨勢,參與整個發酵過程的微生物群落一般可分為3個階段:曲霉期、轉化期和酵母期[45]。研究表明,微生物群落從曲霉階段向酵母階段的轉化從鹽水加入時就已經開始,因此酵母菌是驅動醬油中后期發酵至關重要的微生物,其對醬油產品最終風味的形成具有關鍵作用[46],并且不同種類的酵母菌對醬油特征風味的貢獻也各不相同。

2.1 接合酵母

接合酵母是發酵產品中常見的酵母菌,具有葡萄糖的發酵能力及較好的產醇性能[47],無性生殖時細胞為芽殖,有時有假菌絲,有性生殖時其子囊通過細胞接合形成,每一個子囊含有1～4個圓形或卵形的子囊孢子。醬醪中的接合酵母主要有魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbaillii)等。目前對醬醪中接合酵母的研究以Z.rouxii為主,它是常見的嗜高滲透壓酵母,在擁有較高濃度的離子和非離子(糖和醇)環境下均可生長及繁殖[48],于醬醪中的檢出率及豐度均較高。Z.rouxii在自然條件下的定殖主要在醬油發酵的前期,當成曲加入鹽水后,米曲霉開始逐步消亡,耐鹽乳酸菌被解除生長抑制開始繁殖并代謝產生乳酸,這為Z.rouxii等嗜酸性酵母提供了適宜的生長環境[49]。近年來的大量研究表明,Z.rouxii是酵母發酵期的主發酵酵母,可給予醬油良好的產品風味。它除了以生物合成途徑產生乙醇外,還可通過Ehrlich途徑由相應的氨基酸代謝產生大量的高級醇及芳香醇[50],是醬油醇香的主要貢獻者,其中包括苯乙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇等均是醬油特征風味的關鍵組成部分。YAO等[51]用含6%鹽分的培養基對Z.rouxii進行單獨培養后,發現其生長情況與樣品中的苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇等高級醇類化合物的濃度密切相關。基于其優越的產香性能,調味品釀造相關產業已經開始對Z.rouxii及其代謝產物進行系統研究,并逐步以人工接種的方式對醬醪原始微生物群落進行干預以強化醬油風味。方冠宇等[52]于醬醪pH自然降至適宜條件后接種Z.rouxii進行酵母發酵,研究發現醬醪中的高級醇和芳香醇的含量及種類均得到大幅上升。由于Z.rouxii在pH>5.5的環境中難以維持其耐鹽性,因此在發酵初期對醬醪中總酸的調控將有利于該酵母的繁殖和代謝產物的積累。此外,有報道顯示Z.rouxii在自身生長過程中還可產生有助于HDMF合成的酶類[53-54],可使在接種該酵母的醬醪中HDMF這種重要的醬油特征性風味物質的含量也得到增加。而Z.baillii原為酒類特別是白酒釀造過程中的優勢微生物[55],但由于其具有良好的醇類和酯類生產能力,近年來也逐漸被應用于醬油的風味強化。除自身代謝產生揮發性風味化合物外,這些接合酵母的代謝產物(如丙酮酸、氨基酸和維生素等)也為一些細菌的繁殖提供了營養物質及生長因子[22],這促進了醬醪微生物多樣性的形成,多菌種發酵也間接地豐富了醬油的整體風味。

2.2 球擬酵母

球擬酵母同樣為一種可耐受高滲透壓環境的酵母菌,可適應的pH范圍較廣,酵母細胞呈圓形或卵形,無假菌絲,多邊芽殖。醬油發酵醪中存在的球擬酵母主要有球擬圓酵母(Torulopsisglobosa)、埃切球擬酵母(Torulopsisetchellsii)、易變球擬酵母(Torulopsisversatilis)、莫格球擬酵母(Torulopsismogii)等。由于具有良好的產酯能力,球擬酵母被廣泛應用于各類釀造食品中以提升產品風味[56],在醬油的發酵過程中可將醪液中前期生成的醇類和有機酸合成為酯類、產生4-EG并促進醬油的成熟及特征風味形成[57]。其中T.mogii在10%濃度的鹽水中可繁殖旺盛,在18%的濃度下仍能維持良好的生長狀態,并對乙醇具有一定的耐受能力,于發酵前期接入醬醪后可顯著增加醬油中酯類及4-EG的含量,但發酵產乙醇能力相對較弱[58]。張麗[59]研究發現,于45～60 d將T.mogii接種進入醬醪后,終產品總酯含量顯著多于對照組,但在更早的階段接種反而不利于總酯的積累,這可能由于酵母生成揮發性酯類的同時也對其有分解作用[60],導致在較大的時間區間里,酯類產出量逐漸低于分解量,這也可能是大多數醬油在發酵后期揮發性酯類含量均較低的原因。LIU等[61]于發酵第45天將T.versatilis接種至醬醪,并在發酵結束后檢測醬油樣品中風味物質含量,結果顯示成品醬油中棕櫚酸乙酯的含量相對空白組增加了7.9倍,愈創木酚含量增加了1.77倍,3-甲基-1-丁醇的含量也得到了顯著提升。同時該研究還發現發酵過程中T.versatilis與其他酵母協同發酵還可顯著提升醬油中的苯甲醛、苯乙醛、3-甲基丁醛等醛類化合物的含量。在傳統的開放式發酵過程中,球擬酵母在醬醪的發酵初期就開始生長,但在醬醪發酵的后期時,當主發酵酵母逐漸消退后才開始大量繁殖并開始發酵。因此為提升醬油揮發性風味物質含量并給予微生物代謝產物更多的積累時間,現階段多在發酵的中前期以人工接種的方式對球擬酵母菌群進行強化。可利用球擬酵母最適繁殖溫度偏高但對pH變化敏感性較低的特點,在酵母接種后根據醬油的目標風味選擇控溫發酵或變溫發酵,以改善產品揮發性風味物質的構成以及整體香氣的傾向性。同時,這樣的發酵方法也是縮短醬油釀造周期的重要手段。

2.3 假絲酵母

假絲酵母天然存在于各類高鹽發酵的調味品中,也是廣式高鹽稀態醬油發酵過程中的常見酵母,其在醬油的酵母發酵階段占據主導地位,假絲酵母細胞呈圓形、卵形或長形等,生殖方式為芽殖,有時會存在假菌絲和有隔菌絲。醬醪中檢測到的假絲酵母通常有埃切假絲酵母(Candidaetchellsii)、易變假絲酵母(Candidaversatilis)、皺褶假絲酵母(Candidarugosa)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)等。由于假絲酵母在富含有機酸與高鹽環境下可競爭性生長,因此在醬油自然發酵條件下其通常在發酵后期開始迅速增殖并逐步占據優勢[62]。假絲酵母與醬醪中其他耐鹽酵母相似,其在醪液中繁殖及生長產生的代謝產物對最終醬油的氨基酸態氮等理化指標及氨基酸等呈味物質含量的影響有限,但卻對產品特征風味的形成具有積極的貢獻[36],現階段已廣泛應用于醬油、豆醬等調味品的發酵。有報道顯示,在醬醪中C.versatilis的存在可顯著提升醬油中酯類和酚類化合物的含量,如乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、2,6-二甲氧基苯酚和4-EG等[63],可在醬油發酵中后期促使醬油成熟并促進風味的形成和口感的改善。張玲[64]于發酵第60天后向醬醪中添加C.versatilis,發現其可促進醬油中乙酸、4-EG、苯乙醛、2-苯乙酸酯等風味物質的產生,并且4-EG的含量與未添加的樣品相比具有極顯著差異。同時C.versatilis代謝產出乙醇的也能力較強,并可在高鹽條件下發酵麥芽糖,為醬油帶來醇香和酒香。鄒謀勇等[65]于醬醪中篩選出一株假絲酵母菌(Candidaoceani)FW922-1,發現該菌株可在不添加額外營養物質前提下合成及代謝多種風味物質,顯著提高發酵醬油或醬類中的苯乙醇含量,改善發酵產品的風味且不產生不良氣味。韓冉等[66]發現在不同發酵階段接種C.etchellsii進入醬醪,最終醬油產品的風味與對照組相比存在明顯不同。相對于早期接種,發酵中期接種該酵母于醬醪后,發酵結束后醬油中檢測得到的風味化合物明顯增多,其中酯類和有機酸類的增加較為顯著。這表明假絲酵母的菌群優勢需要在在醬油發酵的中后期進行建立,這可能是由于其合成酯類以及代謝產生4-EG所需的前體物質在醬醪中達到一定濃度時,對醬油風味的強化效果才可展現出顯著性。因此采用特定工藝提高釀造前期醬醪中的醇類物質含量可作為提升假絲酵母產香效果的可行途徑之一。而對醬油中4-EG含量的優化則可通過調整原料構成或制曲工藝,提升醪液中阿魏酸的基礎含量,進而通過調整酵母接種時間、通氣量、發酵溫度等參數調控酵母菌群豐度以提升4-EG的生成量。不僅如此,假絲酵母還有合成其他風味化合物(如一些呋喃類和吡嗪類化合物)的潛力[67],有報道指出在醬醪的高鹽條件下C.etchellsii可生成HEMF,并在20%～22%的鹽濃度下生產HEMF的能力最佳[68]。這些呋喃酮類與4-EG、苯乙醇等高沸點的風味化合物一樣,是構成醬油醬香與豉香的關鍵組分,也是醬油在烹飪過程中特征風味可以得到保留的基礎。

2.4 其他酵母

醬油發酵過程中的微生物群落在發酵前期的變化較為顯著,特別是在醬油制醪發酵的初期,醬醪中往往有著豐富的酵母菌菌群,但多為無乙醇發酵能力的雜酵母,它們在發酵中前期逐漸衰退并消亡,競爭存留下的酵母繼續參與醬醪的發酵,此時酵母群落逐漸趨于穩定。但在發酵中后期,除幾種醬醪中優勢酵母外,其他酵母菌對醬油風味亦有積極貢獻,并且這些非主發酵酵母使醬油呈現產地特色。SONG等[69]報道,異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)可能與當地醬油的特色風味形成有關,W.anomalus可在醬醪中與Z.rouxii和C.versatilis競爭性生長,并合成多種高級醇,同時產酯類及酮類化合物的能力也較高。膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)在醬油發酵過程中可以維持較穩定的種群,并具有較高的油脂以及酯類、吡嗪類化合物(如2-苯乙酸乙酯、2,6-二甲基吡嗪等)合成能力[70]。另外一些種群較小的酵母同樣有著增強醬油特征風味的潛力,如季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)、異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)均可以代謝產生較高水平的4-EG及其他醬油特征芳香化合物[71-72]。擴大這些低豐度酵母的種群規模以及針對性的促進或抑制其生物活性是強化及豐富醬油風味的可選工藝,可結合產品香氣的協調性進行綜合考量。除在醬醪中直接代謝產生揮發性風味物質外,部分酵母菌還以通過參與原料中大分子有機物的分解,為發酵過程中風味化合物的合成提供底物,從而間接提升醬油風味。如異常畢赤酵母(Pichiaanomala)、扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)等,它們主要在發酵的起始階段生長繁殖,可產生脂肪酶類及淀粉酶類促進原料中營養物質的水解,致使小分子化合物在醬醪中得到快速積累[73-74]。這些擁有增強醬油風味能力的酵母菌通常不會對醬油中的總酸、氨基酸態氮、還原糖等理化指標帶來負面影響,因此均具有開發成為新型醬油風味強化酵母的潛力。

3 展望

醬油的生產多是在開放條件下進行,釀造過程中多種耐鹽微生物會進入醬醪中定殖、發酵并參與醬油風味的形成。在這其中,酵母菌的豐度與醬油的最終風味密切相關。在醬油傳統的釀造工藝中,酵母菌主要由環境攜帶自然進入醬醪。這種途徑雖可生產出具有地方特色風味的產品,但自然環境中微生物的數量及菌群結構受季節和氣候的影響,不利于醬油品質的穩定及規范化生產。目前,在發酵過程中主動接種酵母正在逐步成為強化醬油風味的重要手段。隨著對醬油特征風味化合物的闡明以及對醬醪中耐鹽酵母的深入研究,不同種類酵母的代謝特性和醬油特征風味物質形成的相關性已逐步清晰。這使得對醬油風味的定向增強成為可能,在釀造過程中人們可根據不同的風味需求有選擇的在特定時期接種相應種類的酵母菌,以提升特定類別的風味化合物含量,或在相應階段解除目標酵母的生長限制,針對性地對風味化合物進行積累。本綜述為醬油的釀造技術在未來的研究中提供啟迪,并對現有釀造工藝的改進和產品風味強化提供新的思路。