產γ-氨基丁酸釀酒酵母CLNJ1的鑒定及基因組改組選育研究

遲燕平,路雅雯,王景會,李達,蘇穎,牛紅紅,苗新宇,孫慕白,華梅

(吉林省農業科學院 農產品加工研究所,吉林 長春,130033)

γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)是一種非蛋白質的天然氨基酸,動物、植物和微生物中均可產生,具有降血壓、抗抑郁、抗驚厥、鎮靜安神的作用,既有利于心腦血壓的緩解,又能促進人體內氨基酸代謝平衡[1-2]。GABA作為重要的抑制性神經遞物質,參與多種代謝活動,具有很高的生理活性,越來越受到人們的關注,作為一種功能性因子,將被廣泛地用于食品、醫藥及化工等行業[3-4]。GABA化學合成法的成本高、得率低,在生產工藝中使用危險溶劑,不是天然食品添加劑,不能應用于食品。生物合成法相比較來說是一種既安全、又低成本的方法,合成條件溫和,安全性高,是GABA合成的理想途徑[5-7]。釀酒酵母是發酵中最常用的微生物種類,是與人類關系最密切的一種酵母,常用于釀酒及制作面包和饅頭等食品,是我國重要的微生物資源,因此,篩選產GABA的酵母菌株具有較好的應用前景和較高的經濟效益[8-10]。基因組改組技術是建立在菌株誘變和原生質體融合基礎之上的菌株選育技術,常被應用于菌株的改良選育中[11-12]。通過對原始菌株誘變篩選得到正向突變體,將其作為親代菌株,利用熱處理和紫外滅活制備原生質體,之后進行原生質體融合再生[13-15]。本研究通過對篩選的產GABA釀酒酵母進行基因組改組選育,獲得具有穩定遺傳性和安全性的高產GABA融合菌株,具有成本低、產率高、安全性高等優點,為后續的產業化應用提供了理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

菌株CLNJ1由實驗室篩選,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心,編號:CGMCC No.23423。

1.1.2 培養基

LB培養基(g/L):葡萄糖3、酵母浸3、蛋白胨10、NaCl 5,調節pH至 6.2,121 ℃滅菌20 min。

固體培養基:發酵培養基中加入瓊脂20 g/L。

再生培養基:用原生質體穩定液代替蒸餾水,按照發酵培養基配方配制。

磷酸緩沖液、高滲緩沖液、預處理溶液、原生質體穩定液、促融合劑、酶溶液的配置參照文獻[16-17]的方法。

1.2 實驗方法

1.2.1 GABA的定量測定

參照方綺等[18]的方法, 采用Berthelot比色法進行測定。

1.2.2 菌株鑒定

形態學鑒定:平板培養觀察菌落形態大小,顏色及邊緣隆起狀況,挑取單個菌落進行革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察菌落形態特征。

同源性分析和系統發育樹的構建:將篩選菌株送至吉林省庫美生物科技有限公司測序,將菌株序列用BLAST與數據庫中的已知序列進行比較,利用MEGA軟件進行同源性分析并繪制系統發育樹。

1.2.3 菌株基因組改組

1.2.3.1 菌株生長曲線

將CLNJ1菌株活化后接入LB培養基中,于適宜溫度下振蕩培養,每隔2 h取1次菌液,在600 nm波長下測定吸光度值,總計測24 h,記錄實驗結果。

1.2.3.2 LiCl誘變

配制含有不同質量分數LiCl的LB培養基,將活化后培養至對數期的CLNJ1菌液轉接其中培養24 h,以未經LiCl誘變的為對照,涂布完成后的平板在恒溫培養箱中培養48 h。待菌落長出后,計活菌數,取致死率在80%～90%的時間進行LiCl誘變。為確保誘變菌株的穩定性,將菌株連續傳代10次后進行液體發酵,對其GABA產量進行測定,從而判斷誘變菌株的遺傳穩定性。

1.2.3.3 基因組改組

參照文獻[16-17]的方法,配置原生質體菌懸液,適當稀釋,并涂布于固體培養基上。再分別取1 mL菌株原生質體細胞懸液,加入9 mL高滲緩沖溶液中,稀釋到合適濃度后,在再生固體培養基上涂布,培養48 h后,計算菌株原生質體形成率和再生率。根據不同處理條件下原生質體的形成率和再生率,選擇酶最佳的濃度和溫度,菌體生長時期制備原生質體,獲得最適雙親滅活(熱滅活或紫外線滅活)條件。

分別取CLNJ1-Y菌株原生質體各1 mL,混合均勻后放入無菌離心管中,用高滲緩沖液離心洗滌2次,離心后加入1 mL原生質體穩定溶液于上述沉淀菌體中,混勻后再加入1.8 mL 40%(體積分數)促溶劑聚乙二醇6000,搖勻,37 ℃恒溫水浴10 min,再用原生質體穩定溶液稀釋至適當的濃度。涂布于再生平板上,30 ℃培養3～5 d,計算融合率。

將融合液涂布在再生培養基上進行培養,觀察并比較親株和重組子的細胞形態。將菌株進行純化、斜面保藏。將保藏的菌株接種至LB液體培養基中培養1～2 d,測定改組菌株發酵液中GABA的含量。改組后菌株經過穩定性試驗后保存。

1.2.4 菌株安全性評價

1.2.4.1 菌株溶血試驗

將改組后菌株(CLNJ1-YC)在LB固體培養基上進行劃線活化,然后接種于哥倫比亞血瓊脂培養基上培養48 h,根據平板上是否出現溶血環判斷菌株安全性,α-溶血環為草綠色,β-溶血環為無色透明,本實驗以金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌株。

1.2.4.2 抗生素敏感性實驗

采用K-B紙片擴散法檢測CLNJ1-YC菌株對10種抗生素的耐藥性,測量并記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。參照美國臨床和實驗室標準協會(Clinical &Laboratory Standards Institute,CLSI) 標準進行結果判定,結果描述為敏感、中度敏感、耐藥。

1.3 數據處理與統計分析

樣品的每個指標均設置3次重復,采用SPSS 25.0軟件進行Duncan多重比較分析,采用Origin 95C進行繪圖,結果以平均值±標準差表示,統計結果以P<0.05表示差異達到顯著水平。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母CLNJ1菌株鑒定

2.1.1 菌落菌體特征

由圖1-a可知,釀酒酵母CLNJ1為乳白色、圓形、邊緣規則、表面光滑、濕潤,直徑約2.9 mm。革蘭氏染色后呈現藍色,菌體為橢圓形,呈單個排列方式(圖1-b)。

a-菌落形態;b-革蘭氏染色圖片圖1 釀酒酵母CLNJ1菌落形態特征Fig.1 Morphological characteristics of CLNJ1

2.1.2 16SrDNA和ITS序列比對分析及系統發育樹的構建

將菌株CLNJ1送由吉林省庫美生物科技有限公司測序,選擇ITS基因序列測序(正向引物ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG,反向引物ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC),測序結果與NCBI數據庫序列進行BLAST同源性檢索。結果顯示,CLNJ1菌株序列與已公布序列的釀酒酵母菌 (Saccharomycescerevisiae) 99%同源,系統發育樹結果如圖2所示。

圖2 CLNJ1系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of CLNJ1

2.2 釀酒酵母CLNJ1菌株生長曲線

如圖3所示,釀酒酵母CLNJ1發酵4 h后進入對數生長期,發酵14 h后結束對數生長期,GABA產量為1.72 g/L。

圖3 菌株生長曲線Fig.3 Strain growth curve

2.3 釀酒酵母CLNJ1的LiCl誘變研究

由圖4-a可知,當LiCl質量分數為0.3%時,菌株CLNJ1致死率達到90%～95%,故選擇0.3%作為菌株CLNJ1的LiCl誘變最佳質量分數,進行多次誘變和測定后,得到一株產量較高的誘變菌株CLNJ1-Y,GABA產量為5.96 g/L,比出發菌株提高了246%。將誘變菌株 CLNJ1-Y傳代10次,進行GABA產量測定,比較菌株遺傳穩定性,LiCl誘變菌株CLNJ1-Y經過10次傳代,GABA產量基本穩定,沒有出現回復突變的問題(圖4-b)。

a-誘變致死率;b-誘變穩定性圖4 LiCl誘變結果Fig.4 Results of LiCl mutagenesis

2.4 基因組改組選育高產GABA菌株

2.4.1 原生質體的再生比率

CLNJ1-Y菌株在培養8 h,預處理時間15 min,溶菌酶和蝸牛酶酶解時間3 h條件下原生質體的再生比率為99.66%,得到的原生質體己經比較純凈。

2.4.2 原生質體滅活條件的確定

對不同時間紫外滅活處理和熱滅活處理的再生培養基平板上的菌落進行菌落計數,按滅活率公式計算,結果見圖5,對于菌株CLNJ1-Y,紫外照射超過20 s后原生質體的滅活率達到100%,熱滅活80 min時原生質體的滅活率達到100%。

a-紫外滅活;b-熱滅活圖5 紫外處理和熱處理對菌株滅活率的影響Fig.5 Effect of UV treatment and heat treatment on the inactivation rate of strains

2.4.3 改組菌株的檢出與篩選

將制備好的原生質體混合后用紫外和熱滅活的方式進行滅活,然后進行融合,適當稀釋后涂布于高滲培養基中。長出菌落后按照上述所用的初篩和復篩的方法,最終篩選出一輪改組菌株,改組后菌株CLNJ1-YC的GABA產量為12.28 g/L,比CLNJ1-Y提高106%,比CLNJ1提高614%。

2.4.4 改組菌株的遺傳穩定性實驗

為確保改組菌株的穩定性,因此將改組菌株分別轉接10次進行傳代,對轉接10次的菌株進行產GABA能力測定,由圖6可知,CLNJ1-YC產量基本穩定,沒有出現回復突變的問題。

圖6 基因組改組菌株遺傳穩定性Fig.6 Genetic stability of genome shuffling strains

2.5 重組菌株CLNJ1-YC安全性評價

2.5.1 菌株溶血試驗

將重組菌株CLNJ1-YC和金黃色葡萄球菌分別劃線接種于哥倫比亞血瓊脂培養基上,培養后觀察,結果如圖7所示。金黃色葡萄球菌菌落周圍出現了透明圈,發生了β-溶血現象,而CLNJ1菌落周圍無溶血環出現,說明CLNJ1-YC不是溶血性細菌,不存在引起敗血癥的風險。

a-CLNJ1-YC;b-金黃色葡萄球菌圖7 菌株溶血實驗結果Fig.7 Results of strain hemolysis test

2.5.2 抗生素敏感性試驗

菌株安全性評價的首要指標是菌株對抗生素的敏感性,本實驗選取青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、慶大霉素、四環素、紅霉素、環丙沙星、林可霉素、復方新諾明、氯霉素10種抗生素對菌株進行研究,根據CLSI的方法測定菌株抑菌環直徑,菌株敏感性結果如表1所示。CLNJ1-YC對10種常見的抗生素表現均為敏感性,證明菌株安全性好。

表1 菌株對10種抗生素的敏感性檢測結果Table 1 Sensitivity test results of strains to 10 antibiotics

3 討論與結論

釀酒酵母是傳統發酵中應用最廣泛的微生物,其在發酵過程可以產生GABA,選育高產GABA酵母菌株在工業發酵生產中具有重要意義。菌株誘變是一種操作簡便、容易獲得的誘變方式,可以有效地得到高質量突變菌株。沙見宇等[19]利用紫外誘變篩選獲得2株高產莫納可林K突變株M7、M8,產量比出發菌株提高了26%、27%。吳崢等[20]利用紫外誘變獲得產胞外谷胱甘肽突變菌株UV3-10,產量是出發菌株的2.52倍。ELHUSSIENY等[21]利用溴化乙啶誘變釀酒酵母,獲得突變體EtB20b的乙醇產量 (19.5%) 高于原始菌株 (18.0%)。本實驗中LiCl誘變后菌株CLNJ1-Y的GABA產量為5.96 g/L,比出發菌株CLNJ1(1.72 g/L)產量提高了246%,證明LiCl對CLNJ1菌株的誘變效果好,提高菌株產GABA的能力。基因組改組是將傳統育種和原生質體融合相結合的一種高效育種方法,是將誘變后的菌株制備成原生質體進行融合,使菌株的細胞基因組進行重排。GHOSH等[22]通過基因組改組篩選出具有明顯培養特性的融合子 F2-19,黃色素、橙色素和紅色素的含量分別比野生型高67%、70%和76%。ABD等[23]采用基因組改組方法,顯著提高了植物乳桿菌的抗菌活性,金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌的抑制區增加1.34、1.31、1.37和1.37倍。王曉潔等[24]利用基因組改組技術,獲得融合子F2-24的短桿菌素產量是出發菌株的1.92倍。本實驗獲得的融合菌株CLNJ1-YC的GABA產量為12.28 g/L,比誘變菌株CLNJ1-Y提高了106%,比出發菌株CLNJ1提高了614%,因此,基因組改組能夠更有效地提高菌株產GABA的能力。

改組菌株進行菌株溶血試驗和抗生素敏感性試驗,CLNJ1-YC沒有溶血環出現,無溶血性,對大多數抗生素均敏感,菌株安全性良好,可以廣泛應用于發酵食品生產中。