芫根提取物對長期運動誘導疲勞小鼠的骨骼肌穩態的保護作用

王鋮,喻忠茹,李安怡,朱紅康,郭亞輝,成玉梁,錢和

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

疲勞是一種影響人類正常工作和生活的常見綜合癥,通常由劇烈運動、缺氧、睡眠不足或長期患病導致的[1]。疲勞的癥狀多種多樣,通常表現為肌肉酸痛和精神不振[2]。長期過度運動誘發疲勞的過程中,通常伴隨著肌肉損傷、心肺功能受損、免疫系統紊亂等一系列損害,并具有進一步誘發慢性疲勞綜合癥的風險[1]。其中,肌肉功能的損傷,不僅會導致運動功能障礙,也會通過“肌肉-神經”鏈影響到中樞神經系統,存在誘發中樞性疲勞的可能性[3]。因此維持肌肉穩態,是一種對抗疲勞的重要方式。研究發現,在維持肌肉穩態的過程中,線粒體介導的能量代謝和氧化應激信號傳導途徑是重要影響因素[4]。而由于線粒體生物發生過程的復雜性,會通過多靶點途徑影響機體健康,因此“多化合物-多靶點”的干預理論正逐漸成為國際社會對抗疲勞的主要策略[5]。其中,由于中草藥富含多種具有特殊功能活性的化合物,在調理健康中有著悠久的應用歷史,利用中草藥緩解疲勞的方式現在也被人們采納[5]。

芫根(BrassicarapaL.)作為一種藥食兩用的傳統食物,性溫味辛。富含多糖、黃酮、多酚、皂苷等活性物質,表現出如抗缺氧、抗氧化、調節腸道菌群、調節免疫等諸多生物活性[6]。近期的研究也發現了芫根的抗疲勞功能,但是作用機制有待闡明[7]。由于在疲勞發生過程中伴隨著肌肉功能失調,目前關于芫根的生物活性研究中,尚未對保護肌肉的生物過程進行探索。因此本研究將聚焦于探索芫根對長期游泳誘發疲勞小鼠的骨骼肌穩態的保護作用,揭示芫根發揮抗疲勞功效的一種實現途徑。為利用芫根開發功能性食品提供了理論基礎,為人類衛生健康建設貢獻中國智慧。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芫根購自西藏拉薩。

ATP試劑盒、輔酶Ⅰ(NAD+/NADH)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)試劑盒、過氧化氫酶(catalase, CAT)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)試劑盒,南京建成生物工程研究所。

RNA提取試劑盒 RC112、逆轉錄試劑盒 R323、熒光定量qPCR試劑盒 Q711V20.1,南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

ABTS,上海百靈威化學技術有限公司;DPPH,國藥集團化學試劑有限公司;其余試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SorvallTMST 8型高速冷凍離心機,美國賽默飛公司;BioTek多功能酶標儀,美國伯騰公司;XLX-096D 實時熒光定量PCR儀,江蘇鑫藍鑫生物科技有限公司;UVmini-1285 紫外可見光分光光度計,日本島津公司;光學顯微鏡,日本奧林巴斯公司。

1.3 芫根提取液的制備

將芫根洗凈、切片,放入鼓風干燥箱50 ℃烘干,打成細粉,過40目篩網。取芫根粉末50 g,按料液比1∶14(g∶mL)加入去離子水,浸泡0.5 h后,用沸水回流提取1 h,提取2次,趁熱合并煎液并過濾。然后在60 ℃條件下減壓懸蒸濃縮,將濃縮液過濾,真空凍干,凍干粉為芫根提取物(aqueous extract ofBrassicarapaL.,AEB)。

1.4 體外抗氧化活性測試

1.4.1 DPPH自由基清除能力測定

先用乙醇溶解DPPH(0.05 mmol/L),將1 mL樣品提取物及不同質量濃度(0～5 mg/mL)的維生素C溶液和1 mL的DPPH溶液混勻,并在37 ℃避光反應30 min。檢測其在517 nm下的吸光度[8]。DPPH自由基清除能力按公式(1)計算:

DPPH自由基清除率/%=1-[1-(A1-A2)/A0]×100

(1)

式中:A1,樣品的吸光度;A2,純水的吸光度;A0,DPPH溶液與純水(對照組)的吸光度。

1.4.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

首先,將14 mmol/L ABTS溶液和4.9 mmol/L K2S2O8溶液以1∶1(體積比)的比例混合,在室溫下避光反應16 h,獲得ABTS的儲備液。將20 μL不同質量濃度(0～5 mg/mL)的AEB或維生素C溶液加入180 μL ABTS儲備液中,混勻。靜置10 min后,在734 nm處檢測吸光度[8]。ABTS陽離子自由基清除率按公式(2)計算:

ABTS陽離子自由基清除率/%=1-[1-(A1-A2)/A0]×100

(2)

式中:A1,樣品的吸光度;A2,純水的吸光度;A0,對照組的吸光度。

1.4.3 ·OH清除能力測定

分別將1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和1 mL 9 mmol/L的H2O2溶液混合,隨后加入1 mL不同質量濃度(0～5 mg/mL)的AEB溶液或維生素C溶液?；靹?37 ℃孵育30 min后,在510 nm處測量吸光度并按公式(3)計算·OH清除率[8]。

·OH清除率/%=1-[1-(A1-A2)/A0]×100

(3)

式中:A1,樣品的吸光度;A2,純水的吸光度;A0,對照組的吸光度。

1.4.4 鐵離子還原能力測定

向不同質量濃度(0～5 mg/mL)的2 mL AEB溶液或維生素C溶液中加入PBS(2 mL,0.2 mol/L,pH 6.6)和2 mL 10 g/L的K3Fe(CN)6?；靹虿⒃?0 ℃下溫育20 min,快速冷卻并加入2 mL 100 g/L的 Cl3CCOOH以終止反應?；旌衔? 000 r/min離心5 min,將2 mL上清液轉移到新試管中,并與2 mL 1 g/L的FeCl3溶液混合。室溫靜置10 min,在700 nm處檢測吸光度[8]。按公式(4)計算鐵離子還原能力:

鐵離子還原能力=A1-A2

(4)

式中:A1,樣品的吸光度;A2,空白組的吸光度。

1.5 動物實驗設計

1.5.1 長期運動誘導疲勞小鼠模型構建

32只雄性KM小鼠[8周齡;(40±2) g],維通利華實驗動物有限公司,所有的實驗動物均經過江南大學實驗動物中心倫理委員會批準(倫理編號:JN.No20211130k0341225)。小鼠被飼養在溫度、濕度恒定且每周期12 h光照/黑暗的環境下,可以自由獲取食物和水。適應5 d,開展實驗。

將小鼠分為4組(n=8),空白組(Con組):生理鹽水灌胃,不游泳;游泳運動組(Ex組):生理鹽水灌胃,并游泳干預;芫根低劑量組(AEB-L組):AEB[0.5 g/(kg·d)]灌胃;并游泳干預;芫根高劑量組(AEB-H組):AEB[1 g/(kg·d)]灌胃;并游泳干預。

上述AEB溶液的濃度為100 g/L。每天灌胃小鼠,持續4周。

游泳模型可以更自然地模擬運動性疲勞過程,根據長期游泳誘導疲勞的小鼠模型[9],結合本實驗的條件,構建運動模型:從第2周開始,在Ex、AEB-L和AEB-H組灌胃30 min后,每天進行30 min 無負荷強迫力竭游泳訓練。根據實驗動物的疼痛感知發現,由于上午8點至下午5點間動物的有氧代謝變化量最小,本實驗中游泳訓練在上午9點至下午2點間進行[10]。第30天,小鼠禁食9 h后開始負重游泳實驗:在Ex、AEB-L和AEB-H組的小鼠灌胃30 min后,在小鼠的尾部固定相當于其體重3%的小鐵球,開展強迫負重游泳30 min實驗[11]。游泳實驗結束后,用異氟烷麻醉小鼠,進行眼球采血,然后頸部脫臼處死小鼠。解剖并取出腓腸肌組織,立即凍存于-70 ℃。

1.5.2 肌肉組織形態學觀察

將新鮮的腓腸肌組織,用質量分數4%多聚甲醛固定。然后用石蠟包埋,制作5 μm的切片。H&E染色后,用光學顯微鏡可視化(放大200倍)。采用Image J軟件進行分析。統計每個樣本的5張不同照片中至少100根纖維,計算每個樣本的肌纖維直徑。計算每平方毫米的肌纖維數目和白細胞浸潤數量[12]。

1.5.3 生化指標檢測

根據南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書,分別檢測并計算:小鼠肌肉組織中ATP、NAD+、NADH、MDA、T-SOD、CAT、GPx的指標。

1.6 實時熒光定量PCR

根據諾唯贊提供的試劑盒說明書,提取小鼠腓腸肌組織的RNA,用Nano-200核酸定量儀鑒定純度(RNA濃度≥100 ng/μL)。繼續根據相關試劑盒的說明書進行逆轉錄反應,合成cDNA。將cDNA稀釋至合適倍數后,按照試劑盒進行qPCR反應。根據NCBI數據庫設計各基因引物,見表1。以β-actin為內參基因,用2-ΔΔCt計算各基因的相對表達量。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of primers for PCR

1.7 數據分析

結果用平均值±標準差表示。用單因素方差分析(ANOVA)法分析組間差異。用GraphPad Prism 8.2.1軟件處理數據,*表示P<0.05、**表示P<0.01、***表示P<0.001,表示與對照組比較具有統計學差異,#表示P<0.05、##表示P<0.01、###表示P<0.001,表示與Ex組比較具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 芫根體外抗氧化活性

如圖1所示,AEB在不同的自由基清除實驗中均表現出良好的抗氧化活性。經計算,AEB對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH的半數抑制率(IC50)分別為(0.906 6±0.043 2)、(0.709 5±0.013 6)、(0.473 3±0.024 5)mg/mL。其中,AEB對·OH清除活性與維生素C接近。植物提取液的抗氧化活性象征著其功能物質的活性,如多糖、黃酮、多酚等物質[13]。結果表明,AEB對自由基具有較強的清除作用,意味著芫根具有良好的抗氧化活性,具有減輕體內活性氧損傷的潛力,并可能具有保護組織在應激狀態下受到損傷的功效。

a-DPPH自由基清除活性;b-ABTS陽離子自由基清除活性;c-·OH的清除活性;d-鐵離子還原力圖1 AEB體外抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of AEB in vitro

2.2 肌肉組織形態學觀察

為了進一步確定芫根的組織保護功效,對骨骼肌進行H&E染色和形態學觀察。如圖2所示,在Ex組中可以明顯地觀察到肌肉的裂紋、壞死和腫脹;而在AEB-L組中,觀察到僅有輕微裂紋;在AEB-H組的肌肉組織則更趨近于正常,表明在運動前攝入AEB可以有效減少長期力竭運動引發的骨骼肌損傷。

a-肌肉切片;b-肌纖維直徑;c-肌纖維密度;d-白細胞浸潤數注:*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001 vs.Con組。#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001 vs.Ex組,(下同)。圖2 對肌肉組織形態學的影響(n=3)Fig.2 Effects on histological changes in muscle

ImageJ量化分析結果表明,AEB-H組的肌纖維直徑比Con組和Ex組顯著提高(P<0.01),且肌纖維密度也明顯增加(P<0.001),這兩者的變化表明AEB的攝入提高了肌肉的綜合強度,減輕了運動誘發的肌肉穩態異常。此外,可以在切片圖中觀察到Ex組肌纖維中有大量白細胞浸潤、侵染。計數可知,單位面積的肌纖維中的白細胞浸潤的數量比Con組多出了29.12%(P<0.001);AEB的攝入可以有效減少白細胞浸潤數量,在AEB-H組中,比Ex組降低了18.82%(P<0.01)。

結果表明,AEB可以通過增強肌肉強度和減少炎癥侵染的方式,發揮維持肌肉穩態的作用,且AEB-H組的效果最顯著。

2.3 對肌肉能量代謝的影響

在發生劇烈運動時,肌肉中的高能磷酸物(如ATP)被優先消耗,當肌肉中的能量消耗大于能量供應時,可能會誘發肌肉損傷[14]。通過對肌肉組織的ATP含量測定發現,Ex組的ATP含量比Con組降低了63.30%(P<0.001),而AEB-L組和AEB-H組的含量均分別比Ex組上調了141.45%(P<0.01)和253.40%(P<0.001)。由于AEB中富含糖類物質[15],在攝入后提高體內能量儲備是理所當然的。但ATP的生物合成過程不僅需要能量底物,與糖酵解過程相關輔酶也發揮了重要作用。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),是線粒體進行ATP合成的關鍵輔助因子,在糖酵解過程的重建中發揮關鍵作用[16]。如圖3所示,本研究中發現Ex組的NAD+含量呈現出顯著的低水平(P<0.001),而攝入AEB的2組NAD+的含量均顯著提高。雖然NADH作為NAD+的還原態,具有正向調節細胞能量合成的作用,但在本研究中未發現顯著組間差異。通常NAD+/NADH比值被用來評價糖酵解和三羧酸循環(tricarboxylin acid cycle,TCA)的強弱[17]。本研究中,Ex組的NAD+/NADH值顯著低于其他組(P<0.001),而AEB-L、AEB-H組的比值均顯著高于Ex組(P<0.001)。NAD+/NADH值的降低會對糖酵解和TCA過程產生抑制作用,同時也說明細胞呼吸過程耗氧量偏高,組織可能處于過氧化狀態[17]。本研究中的結果表明,AEB可以通過調節NAD+/NADH比值,重塑應激狀態下肌肉細胞糖酵解和TCA的過程,提高ATP在肌肉細胞的生物合成,來滿足肌肉在劇烈運動時,對能量的大量需求。

另外有研究發現NAD+/NADH的比值在維持線粒體的電子傳遞鏈中具有重要意義,從而調控線粒體的代謝和生物發生[18]。

2.4 對肌肉線粒體功能的影響

SIRT1是一種NAD+依賴性脫乙酰酶,可通過脫乙酰化調節PGC-1α表達[19]。PGC-1α作為轉路共激活因子,對線粒體功能代謝、氧化應激過程起重要調節作用。PGC-1α通過調節核呼吸因子(nuclear respiratory factor,Nrf1、Nrf2等),進而繼續激活線粒體轉錄因子TFAM[20]。TFAM通過線粒體膜進入線粒體基質,與線粒體DNA結合,繼而激活線粒體生物合成。因此SIRT1/PGC-1α/TFAM通路在維持線粒體的生物發生和功能穩定中具有重要意義[21]。

如圖4所示,通過對肌肉中SIRT1/PGC-1α/TFAM通路表達發現,在Ex組中的SIRT1/PGC-1α/TFAM的mRNA相對表達量均分別比Con組(P<0.001)顯著組下降了48.47%、51.08%、54.16%。AEB處理后表達量均有顯著上調,AEB-H組的上調更顯著且穩定。AEB-H組的表達量分別比Ex組上調了80.92%(P<0.001)、50.74%(P<0.05)、68.71%(P<0.01)。結果表明,在本實驗中,劇烈運動可能通過對SIRT1/PGC-1α/TFAM通路的靶向影響,誘發了小鼠骨骼肌線粒體功能障礙。而AEB通過干預該通路,促進了骨骼肌線粒體生物發生,說明AEB干預的潛在靶點可能是線粒體,印證了上文NAD+/NADH的結果。

a-肌肉SIRT1 mRNA相對表達量;b-肌肉PGC-1α mRNA相對表達量;c-肌肉TFAM mRNA相對表達量圖4 對肌肉線粒體功能影響(n=6)Fig.4 Effects on mitochondrial function in muscle

此外,PGC-1α還可以調節核呼吸因子的表達,影響機體的抗氧化防御系統。因此下一步對AEB的抗氧化功效進行了探索。

2.5 對肌肉抗氧化能力的影響

2.5.1 對氧化應激指標的影響

過度運動時身體各個組織的O2需求大幅增加,持續積累的活性氧物質無法獲得及時的消除,會對組織持續造成機體損傷,影響組織功能穩態[22]。因此個體的運動耐力與抗氧化防御系統有很強的正相關。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一種能在保護機體免受氧自由基損傷的酶。·O2-在體內可被SOD迅速轉化為H2O2,然后經GPx和CAT催化生成水。MDA是脂質過氧化的產物,是判別力竭運動后抗氧化防御降低的重要標識物[23]。

如圖5所示,劇烈運動使Ex組肌肉中的MDA含量比Con組上升了42.81%(P<0.001),使抗氧化T-SOD、GPx分別比Con組顯著降低了23.61%(P<0.001)、36.81%(P<0.01),這意味著肌肉組織處于過氧化狀態,與NAD+/NADH的趨勢一致。AEB的處理可以顯著降低肌肉MDA的含量,并提高抗氧化酶的活性,且AEB-H組的效果更加顯著(P<0.001)。接下來對AEB調節抗氧化活性的可能分子機制進行研究。

a-肌肉MDA含量;b-肌肉T-SOD活性;c-肌肉CAT活性;d-肌肉GPx活性圖5 對氧化應激指標影響(n=6～8)Fig.5 Effects on oxidative stress index in muscle

2.5.2 對抗氧化通路的影響

上文所述中,PGC-1α可以調節Nrf的表達。其中Nrf2在氧化應激的過程中,可以釋放并與抗氧化反應元件結合,并上調抗氧化酶如血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)、醌氧化還原酶-2、SOD、CAT、GPx的表達。調節細胞內抗氧化防御系統的相關基因表達,促進抗氧化酶的合成[24]。有研究發現過氧化狀態下,Nrf2的表達會顯著降低。本研究中發現,如圖6所示,Ex組肌肉的Nrf2表達量比Con組降低了64.15%(P<0.001);而AEB-L組和AEB-H組的表達量均有顯著上調(P<0.001)。并且在HO-1的mRNA表達中也觀察到了類似的趨勢。

a-肌肉Nrf2 mRNA相對表達量;b-肌肉HO-1 mRNA相對表達量圖6 對肌肉Nrf2通路影響(n=6)Fig.6 Effects on Nrf2 pathway in muscle

綜上,劇烈運動使小鼠骨骼肌處于過氧化狀態,表現為MDA指標上升與抗氧化酶活性降低,并且Nrf2的表達發生降低。而AEB干預可能通過增強Nrf2和Keap1的結合而阻斷其對Nrf2的降解作用,使Nrf2能夠在細胞內積累,并進入細胞核激活氧化應激相關基因的表達,如SOD、CAT、GPx等內源性抗氧化酶[25]。

2.6 對肌肉再生相關基因表達的影響

Titin是一種巨大的蛋白,在肌節生成和肌原纖維組裝中起作用,有Z盤、I帶、M線3個蛋白作用位點[26]。Z盤錨定在肌動蛋白絲的末端,控制肌節中力的傳遞。Z盤上的MPL與titin形成復合物,發揮應力傳感器的作用[26]。本實驗中觀察到了劇烈運動使小鼠MPL表達量均發生大幅降低(P<0.001),這可能會最終促使小鼠表現出肌無力的癥狀。雖然AEB的攝入沒有使其恢復至正常水平,但比Ex組的顯著(P<0.001)提升,也表明了肌肉力量控制的恢復。I帶調控著肌纖維的延伸,I帶中的Ankrd2表達被發現和肌纖維重塑過程有關[26]。本實驗中,如圖7所示,Ex組的表達量顯著低于其他組(P<0.001),意味著劇烈運動對肌纖維修復過程的損害;而AEB組的表達量顯著提升(P<0.001),是說明這2組小鼠受損的肌纖維處于修復并增長的狀態,對應了切片中觀察到的肌纖維直徑和密度增加。M線中的MuRF1受到萎縮刺激的激活[26],本研究中可以觀察到Ex組MuRF1表達量顯著增加,AEB組的表達顯著減少,印證了AEB組肌纖維結構的增強。

a-肌肉MLP mRNA相對表達量;b-肌肉Ankrd2 mRNA相對表達量;c-肌肉MuRF1 mRNA相對表達量;d-肌肉acta1 mRNA相對表達量圖7 對肌肉再生相關基因表達的影響(n=6)Fig.7 Effects on the expression of genes related to muscle regeneration

α-肌動蛋白(acta1)是骨骼肌中最主要的肌動蛋白亞型[12],和titin蛋白結合在新肌節生成中發揮重要作用[27]。本實驗中,觀察到AEB處理主要提高了titin蛋白相關mRNA表達量,對acta1表達的改變不顯著。這種變化通過增加titin在調節肌節再生上的作用,促進受損肌纖維組織重塑,切片中觀察到的形態穩定印證了這個過程。

3 結論與討論

持續性過度運動會促使一定程度的肌肉損傷,因此如何維持肌肉穩態,修復肌肉損傷是減輕運動損害的重要手段。之前的研究觀察到,芫根可以有效減輕急性運動中的肌肉損傷,為本研究提供了基礎。

在本研究中,先確定了芫根提取液具有的良好抗氧化活性,具有減輕由應激運動產生的自由基侵染的潛力。隨后,在對肌肉組織形態學分析中發現,運動誘發的肌肉損傷被AEB緩解了,并且還發現了AEB有效提高了肌肉強度,并減少了白細胞在肌肉纖維的浸潤。進一步研究發現,過度運動使肌肉細胞NAD+/NADH比值降低,糖酵解過程發生了障礙,ATP合成顯著不足;而AEB逆轉了這種變化,重建肌肉細胞糖酵解的同時,也為維持線粒體功能提供了條件。接下來,對肌肉組織線粒體SIRT1/PGC-1α/TFAM通路的研究證明了力竭運動過程中,引發線粒體功能障礙的分子機制,并且也發現了AEB在重構線粒體生物發生時發揮的作用。PGC-1α可以繼續干預Nrf2通路的表達,從而影響抗氧化防御體系。劇烈運動使小鼠骨骼肌出現過氧化狀態,并且抗氧化酶的活性也降低;AEB作為一種抗氧化劑,減輕了肌肉組織的自由基損害,提高了抗氧化酶活性,而調節Nrf2/HO-1通路是可能發生的分子機制。最后,對影響肌肉titin蛋白相關基因MPL、Ankrd2、MuRF1的mRNA表達發現,劇烈運動使上述3個基因的表達發生顯著變化,而AEB的攝入逆轉異常表達,為肌肉損傷后的再生提供了基礎蛋白。

綜上,本文揭示了芫根提取物通過維持肌肉細胞能量代謝穩定,促進線粒體功能,從而抑制劇烈運動造成的骨骼肌生理功能異常。另外,通過對MPL、Ankrd2、MuRF1的調節,促進了骨骼肌的損傷修復和纖維的重組,維持了骨骼肌的形態穩定。