奶酪發(fā)酵劑紅曲霉的篩選及其對奶酪理化、質(zhì)構和抗氧化性的影響

徐杏敏,鄭遠榮,劉振民*,王吉棟,王清剛

1(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海乳業(yè)生物工程技術研究中心,乳業(yè)生物技術國家重點實驗室,上海,200436)2(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)

奶酪是一種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品,種類數(shù)以千計,按照成熟菌種可分為細菌成熟、霉菌成熟和酵母菌成熟。目前,青霉、白霉常被用于制作霉菌成熟奶酪,常見的有藍紋奶酪、布里奶酪、卡蒙貝爾奶酪(Camembert cheese)等。青霉所制備的奶酪由于蛋白水解及脂肪分解的程度較高,往往氣味刺激、口感辛辣[1-2]。相比之下,白霉所制備的奶酪在氣味和口味上會更加溫和。同是霉菌的紅曲霉,在我國雖長久以來被用于發(fā)酵食品中,例如紅曲酒、紅曲醋、紅腐乳等[3-5],卻鮮少有人將其用于奶酪加工。在具備可食用性的基礎上,紅曲霉還可以生產(chǎn)紅曲色素、γ-氨基丁酸、莫納可林K及其他生物活性化合物[6-8],益處良多。成熟一直是奶酪制作中相對昂貴的過程[9],通過改變成熟條件、篩選發(fā)酵菌株,可在不降低奶酪品質(zhì)的基礎上減少奶酪的成熟時間,對奶酪行業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

本實驗從上海農(nóng)家自制腐乳、福建農(nóng)家自制酒糟中分離紅曲霉菌株,以馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基分離純化得到紅曲霉,將分離出的紅曲霉與實驗室提供的10株紅曲霉菌株以一種新型短期成熟工藝進行奶酪制備,再通過感官風味評定篩選能帶來優(yōu)良風味的菌株。隨后對優(yōu)良風味菌所成熟的奶酪樣品進行理化分析、安全分析等。實驗制作了一種紅曲霉成熟奶酪,加工工藝借鑒了卡蒙貝爾奶酪,在其基礎上優(yōu)化了加工參數(shù),創(chuàng)新出一種表面紅色的霉菌奶酪,命名為上海玫瑰奶酪(Shanghai Rose cheese)。本研究旨在獲得適宜用于成熟奶酪且能帶來優(yōu)良風味的紅曲霉菌株,為進一步分析紅曲霉奶酪優(yōu)良特征風味物質(zhì)提供實驗菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅腐乳,上海農(nóng)貿(mào)市場;紅曲酒糟,福建寧德、古田、南平農(nóng)場;牛乳、稀奶油、脫脂乳,光明乳業(yè)股份有限公司;10株篩自紅曲腐乳的紅曲霉菌株,乳業(yè)生物技術國家重點實驗室;商業(yè)發(fā)酵劑FLORA、STI-13以及凝乳酶,科漢森(中國)有限公司;馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,PDB)培養(yǎng)基、瓊脂粉,青島海博生物技術有限公司;CLOVER桔霉素免疫親和柱,北京中檢維康生物技術有限公司;NaCl、NaOH、HCl、硼酸、甲基紅、亞甲基藍,國藥集團化學試劑有限公司;總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法、FRAP法),上海碧云天生物技術有限公司;總抗氧化能力檢測試劑盒(DPPH法),上海生工生物工程股份有限公司。

生物安全柜,美國Thermo Scientific;電子天平,北京賽多利斯科學儀器有限公司;HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋,日本HIRAYAMA;奶酪槽,英國Armfiled;HPP 110奶酪成熟箱,德國MEMMERT;Acquity UPLC/FLR/SQD2超高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀,美國Waters;Agilent 1260 II高效液相色譜儀-配熒光檢測器,安捷倫;KT260凱氏定氮儀,丹麥FOSS Scino;TA.XTplus質(zhì)構分析儀,英國Stable Micro Systems;Spectramax M5酶標儀,美國Molecular Devices;DS-11超微量紫外分光光度計,美國DeNovix。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離純化

向PDB培養(yǎng)基中加入1.2%(質(zhì)量分數(shù),下同)瓊脂,制備PDA平板。向脫脂乳中加入1.2%瓊脂,配制脫脂乳瓊脂平板。取5 g紅曲腐乳或紅曲酒糟,于PDB培養(yǎng)基中,置于170 r/min、32 ℃下培養(yǎng)7 d,進行增菌培養(yǎng)。隨后用接種環(huán)將PDB培養(yǎng)基接種于PDA于32 ℃培養(yǎng)7 d,再挑選疑似紅曲霉菌落繼續(xù)劃線純化3～5次,直至平板上僅有1種菌落。將單菌落分別接種于PDA及脫脂乳瓊脂平板,32 ℃下培養(yǎng)7 d,記錄菌落形態(tài)。最終篩選出的菌株,送至上海杰李生物技術有限公司進行測序。

1.2.2 紅曲霉發(fā)酵劑的準備

從PDA培養(yǎng)基中取少量紅曲霉菌絲接種于含120 mL PDB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,170 r/min、32 ℃下培養(yǎng)7 d。隨后,用裝有約1 cm高度脫脂棉的5 mL注射器對培養(yǎng)后的菌液進行過濾。經(jīng)平板計數(shù),此時濾液中的活菌含量為106CFU/L。濾液常溫保存,現(xiàn)用現(xiàn)制。

1.2.3 奶酪的制作

根據(jù)JIAO等[10]的方法稍作修改,具體工藝如下所示,整個制備及成熟過程需要嚴格保持衛(wèi)生。

原料乳→標準化→巴氏殺菌→冷卻→添加商業(yè)發(fā)酵劑→發(fā)酵至pH 6.4→添加凝乳酶→凝乳→切割→排乳清→裝模成型→17%鹽水腌漬→晾干→涂抹紅曲霉發(fā)酵液→28 ℃有氧成熟14 d

對于奶酪的分析,取樣方法為將整塊奶酪的表皮與內(nèi)部混合均勻后取樣,所有實驗重復3份。

1.2.4 感官風味評價體系構建

分別參考GALLI等[11]、XIA等[12]、DIEZHANDINO等[13]對霉菌(白霉、紅曲霉、青霉)成熟奶酪的感官評定指標以及國標 GB/T 10221—2021《感官分析 術語》,對感官風味評價體系進行構建。品評小組由20人組成(10名奶酪研發(fā)人員,10名資深奶酪愛好者,皆有豐富的奶酪品評經(jīng)驗),評分方法如表1所示。

表1 紅曲霉奶酪感官評定方法Table 1 Sensory evaluation of Monascus cheese

1.2.5 安全性及功能性物質(zhì)含量的測定

桔霉素含量的測定:參考 GB 5009.222—2016 《食品安全國家標準 食品中桔青霉素的測定》。

洛伐他汀與γ-氨基丁酸含量的測定:稱取200 mg樣品,加入含1 mL乙醇的研磨管中,60 Hz研磨3 min后以12 000 r/min離心15 min,取上清液進行1倍稀釋,對于物質(zhì)含量較高的上清液樣品進行100倍稀釋,計算物質(zhì)含量時帶入相應的稀釋倍數(shù)。洛伐他汀使用Waters, BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),γ-氨基丁酸使用Waters, BEH T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)。流動A相為0.1%甲酸水溶液,B相為乙腈,柱溫40 ℃,流速0.25 mL/min,進樣量2 μL,質(zhì)譜選擇離子模式m/z=104,洗脫條件如表2所示。

表2 超高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions of UHPLC-quadrupole mass spectrometer

1.2.6 奶酪理化指標的測定

水分含量測定:參考GB 5009.3—2016 《食品安全國家標準 食品中水分的測定》的直接干燥法。

脂肪含量測定:參考GB 5009.6—2016 《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》的堿水解法。

蛋白質(zhì)含量測定:參考GB 5009.5—2016 《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》的凱氏定氮法。

pH 4.6可溶性氮含量測定:參考袁然等[14]方法進行測定。

1.2.7 奶酪質(zhì)構的測定

使用P/50探頭,測試前與測試后速度為5 mm/s,測試速度為1 mm/s,測試距離為7 mm。根據(jù)測量結果,由儀器自帶軟件進行質(zhì)地剖面分析(texture profile analysis, TPA)。

1.2.8 奶酪抗氧化性的測定

按照所購試劑盒的使用說明進行測定。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

液相數(shù)據(jù)采用Empower軟件進行分析,其余數(shù)據(jù)由Excel、SPSS 26.0進行處理,系統(tǒng)發(fā)育樹由MEGA 11進行構建,柱狀圖由Origin 2021完成。

2 結果與分析

2.1 紅曲霉奶酪感官評價

根據(jù)紅曲霉的菌落外觀、顏色、正反面差別等特征,從紅曲腐乳、紅曲酒糟中初步分離出15株疑似紅曲霉菌株。將這15株自分離菌株與實驗室提供的10株紅曲霉用于奶酪制備,并進行感官評價。如表3所示,按照構建的感官風味評價體系,對制備的紅曲霉奶酪樣品進行評分。

表3 紅曲霉奶酪感官得分Table 3 Sensory score of Monascus cheese

根據(jù)感官得分情況,選取奶酪得分在60分以上的紅曲霉菌株進行菌種鑒定及二次篩選,即BC18、BC17、ZX-99、BC20、BC07、X2-2。這6株菌制作的奶酪皆咸鮮適中,滋、氣味良好。其中,BC20奶酪在苦味、酸味、氣味方面的評分相對較低,這可能是由于菌株發(fā)酵能力較強,奶酪的成熟度比其余5款奶酪高而導致的。ZX-99奶酪在鮮味和組織狀態(tài)的評分相對較低,這可能是由于奶酪的成熟度比其余5款奶酪低,導致風味不足,奶酪質(zhì)地偏硬。對于這2種情況,后續(xù)可通過調(diào)整成熟時間、成熟溫度或其他工藝優(yōu)化來進行改善。由氣味部分的評分可知,整體氣味的得分與霉味、香味的得分呈正相關。說明霉味的存在會破壞奶酪整體的氣味,一些奶酪因具有其自身特有的香氣而對奶酪整體氣味具有較大積極作用。由顏色部分的評分可知,淺色的奶酪外表比深色的奶酪外表更受歡迎,深色外表的奶酪由于彼此之間顏色差異較小而得分接近。

2.2 紅曲霉分離鑒定

2.2.1 紅曲霉的菌落特征

經(jīng)感官篩選后,從菌種庫菌株及自分離菌株中優(yōu)選出的紅曲霉菌落如圖1、圖2所示。

a-BC07;b-BC17;c-BC18;d-BC20;e-X2-2;f-ZX-99圖1 紅曲霉菌落形態(tài)圖(PDA)Fig.1 Colony morphology of Monascus (PDA)

a-BC07;b-BC17;c-BC18;d-BC20;e-X2-2;f-ZX-99圖2 紅曲霉菌落形態(tài)圖(脫脂乳瓊脂)Fig.2 Colony morphology of Monascus (skim milk agar)

由圖1、圖2可知,BC07、BC17、BC18、X2-2的菌落形態(tài)較為相似。在PDA平板中菌落呈橘紅色,其營養(yǎng)菌絲體密布在營養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)部,邊緣呈不規(guī)則花瓣狀,氣生菌絲較為疏松、絲狀交織。在脫脂乳瓊脂平板中,菌落呈深紅色,表面毛絨狀菌絲不明顯,菌落邊緣趨于圓形。BC20、ZX-99的菌落形態(tài)較為相似。在PDA平板中表面呈同心圓狀,菌落色澤較淺,BC20的氣生菌絲較為密集、絲狀交織,ZX-99的氣生菌絲較為致密。在脫脂乳瓊脂平板中,營養(yǎng)菌絲體為深紅色,氣生菌絲體為粉白色。以上6株菌的菌落形態(tài)與KUMURA等[15]記錄的紅曲霉屬相似,故初步認定其為Monascus。由圖2可知,這6株菌在脫脂乳基質(zhì)中生長狀態(tài)良好,有望用于奶酪制備。

2.2.2 生物學鑒定

根據(jù)EL-DAWY等[16]對分離自柑橘類水果的青霉菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析的方式進行修改。將2.1節(jié)中篩選出的優(yōu)良風味菌進行DNA測序,于NCBI中挑選序列相似性較高的紅曲霉菌株,通過MEGA 11的ClustalW程序進行比對,使用鄰接法推斷進化歷史,進行1 000次相似度重復計算構建發(fā)育樹[17]。具體如圖3所示,上標“T”代表模式菌株,括號內(nèi)為登錄號。根據(jù)發(fā)育樹構建結果,鑒定菌株BC07、BC17、BC18、X2-2、BC20、ZX-99為紅曲霉屬(Monascus)。結合菌落特征、生物學鑒定以及KUMURA等[15]對于不同紅曲霉菌株在乳清蛋白基質(zhì)上生長情況的記錄,初步推測BC07、BC17、BC18、X2-2為紫色紅曲霉(Monascuspurpureus),BC20與ZX-99為紅色紅曲霉(Monascusruber)。

圖3 基于DNA序列分析的紅曲霉系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Monascus based on DNA sequence analysis

2.3 紅曲霉奶酪的安全性分析

將優(yōu)選出的6株紅曲霉菌株用于奶酪制備,在成熟期結束時,對其進行安全性檢測,結果如表4所示。

表4 紅曲霉奶酪的安全性及功能性物質(zhì)含量Table 4 Safety and functional substance content of Monascus cheese

桔霉素是一種真菌毒素,常見于曲霉屬、青霉屬和紅曲霉屬的代謝產(chǎn)物中,具有遺傳毒性、肝毒性和腎毒性等危害[18]。由表4可知,BC20與ZX-99具有較高的安全性,其奶酪樣品中桔霉素含量低于國標最低檢測限25 μg/kg,遠低于國標的定量限80 μg/kg。而BC07、BC17、BC18、X2-2奶酪的桔霉素含量過高,不宜用于制作奶酪。紅曲霉代謝產(chǎn)物中含有多種活性成分,其中的洛伐他汀具有降低血脂的功效。γ-氨基丁酸是大腦中的神經(jīng)遞質(zhì),其與谷氨酸的相互作用對正常的神經(jīng)功能至關重要[19]。與其他發(fā)酵菌株相比,BC20與ZX-99的功能性代謝產(chǎn)物洛伐他汀及γ-氨基丁酸的含量較高,具有開發(fā)生物功能乳制品的潛能。

2.4 紅曲霉奶酪的理化分析

按照1.2.3節(jié)中所述的工藝進行奶酪的制備,該工藝的特色在于可以解決紅曲霉奶酪在成熟過程中容易染菌的問題,成功實現(xiàn)“0染菌”,在此基礎上還保證了奶酪的品質(zhì)、縮短了成熟用時。所制備的奶酪如圖4所示,這是一款新開發(fā)的上海玫瑰奶酪,按照質(zhì)地、原料、成熟方式可定義為半軟質(zhì)-牛乳-表面霉菌成熟奶酪。奶酪表皮顏色、狀態(tài)根據(jù)發(fā)酵菌株的特性而有所差異。菌株BC07、BC17、BC18、X2-2所制備的奶酪類似,如圖4-a所示,奶酪表皮接近櫻桃木色(Cherrywood,該顏色的十六進制代碼為#631823)。菌株BC20所制備的奶酪如圖4-b所示,奶酪表皮接近粉紅色(Baby Pink,該顏色的十六進制代碼為#f4c2c2)。菌株ZX-99所制備的奶酪如圖4-c所示,奶酪表皮接近玫瑰塵色(Rose Dust,該顏色的十六進制代碼為#9b5b67)。不同奶酪表皮外觀的差異與圖2中菌株在脫脂乳瓊脂培養(yǎng)基中呈現(xiàn)的菌落形態(tài)差異具有一定相關性。奶酪在成熟適度的情況下,內(nèi)部接近木瓜色(Papaya Whip,該顏色的十六進制代碼為#fff0d2),并且質(zhì)地柔軟細膩。

a-BC07、BC17、BC18、X2-2;b-BC20;c-ZX-99圖4 紅曲霉奶酪Fig.4 Monascus cheese

該工藝下,成熟期結束時奶酪的理化檢測結果如表5所示,奶酪的水分含量在(41.45±0.72)%～(45.49±0.67)%,高于XIA等[12]、翁勝男等[20]所制備的紅曲干酪在成熟第14天時的水分含量(約35%),根據(jù)與李春梅等[21]的工藝對比研究可知,這一現(xiàn)象可能與切割凝乳的大小以及成熟容器有關。奶酪的蛋白質(zhì)含量在(17.70±0.44)%～(17.99±0.22)%,與焦晶凱等[22]研究中所制備的軟質(zhì)紅曲-白霉干酪的含量相當[(17.40±0.14)%～(19.60±0.85)%]。脂肪含量在(32.65±0.77)%～(36.31±0.80)%,這取決于原料乳中脂肪的含量、稀奶油的添加量以及發(fā)酵菌株對脂肪的分解程度。奶酪的成熟度可由蛋白質(zhì)的水解程度來進行判斷,pH 4.6可溶性氮通常被用作判斷奶酪成熟的指標[23]。在1.2.3節(jié)中所述工藝下制備的奶酪,除BC17與ZX-99外,其余奶酪的pH 4.6可溶性氮含量在(32.59±0.98)%～(40.99±0.90)%,與孫顏君等[24]、XIA等[12]所制備的紅曲干酪在成熟期結束時的pH 4.6可溶性氮含量相當。通過感官品評與成熟指標的對比可知,在這種工藝下,奶酪只需熟化14 d,即可達到成熟品質(zhì),大大縮短了成熟用時,節(jié)省了制備成本,為紅曲霉奶酪的產(chǎn)業(yè)化提供技術參考。

表5 紅曲霉奶酪的理化檢測 單位:%Table 5 Physicochemical detection of Monascus cheese

2.5 紅曲霉奶酪的質(zhì)構分析

成熟期結束時,奶酪的質(zhì)構分析如圖5所示。由圖5-a可知,奶酪ZX-99的硬度顯著高于其他5款奶酪,其次是BC17,硬度最低的是BC20。結合2.1節(jié)風味品評與2.4節(jié)可溶性氮含量,推測奶酪的硬度可能與奶酪熟化程度以及菌株發(fā)酵特性有關。熟化程度不夠在一定程度上會導致奶酪質(zhì)地偏硬,成熟適度則奶酪軟糯適中,成熟過度則奶酪容易內(nèi)部流心、整體易塌散。相同制備工藝下,奶酪的硬度與菌株成熟奶酪的能力呈負相關,菌株成熟奶酪能力越強、奶酪中蛋白質(zhì)水解程度越高、奶酪硬度越小。結合鄭遠榮等[25]對切達奶酪不同成熟時期的研究,推測這一現(xiàn)象可能是由于不同菌株產(chǎn)酶的情況不同,從而導致蛋白結構和脂肪結構的降解情況存在差異。由圖5-b、圖5-c可知,奶酪的彈性為0.90～0.93,內(nèi)聚性為0.35～0.43,組間沒有顯著差異。郝教敏等[26]、DIEZHANDINO等[27]認為,奶酪的彈性、內(nèi)聚性與凝乳酶、凝乳時的pH值、Ca+濃度以及谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶相關。故在同類發(fā)酵菌株、相同奶酪制備工藝下,奶酪彈性及內(nèi)聚性的差異較小。奶酪的咀嚼性的大小由硬度、彈性、內(nèi)聚性三者的乘積得到[28]。由圖5-d可知,奶酪ZX-99由于硬度較高,其咀嚼性也顯著高于其他5款奶酪。在品嘗過程中,其他5款奶酪與奶酪ZX-99相比,口感更加柔嫩。

a-硬度;b-彈性;c-內(nèi)聚性;d-咀嚼性圖5 紅曲霉奶酪的質(zhì)構參數(shù)Fig.5 Texture parameters of Monascus cheese注:組間不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.6 紅曲霉奶酪的抗氧化分析

紅曲霉在生長代謝的過程中會產(chǎn)生不同種類的酶,如蛋白酶、脂肪酶、糖化酶等。其中,蛋白酶的產(chǎn)生對奶酪中蛋白質(zhì)的水解具有一定積極作用,從而豐富奶酪中多肽、短肽、游離氨基酸的種類與數(shù)量。在這些水解產(chǎn)物中,存在一些具有抗氧化能力的活性物質(zhì)。圖6展示了不同奶酪在ABTS陽離子自由基體系、DPPH自由基體系以及對鐵離子還原抗氧化能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)這3個方面的抗氧化結果。在ABTS陽離子自由基體系中,奶酪BC18、BC20、X2-2表現(xiàn)出的抗氧化能力顯著較高,其次是奶酪ZX-99,而奶酪BC17表現(xiàn)的抗氧化能力最低;在FRAP方面,奶酪BC07表現(xiàn)出的抗氧化能力顯著較高,而奶酪ZX-99表現(xiàn)的抗氧化能力最低,其次是奶酪BC17。綜合ABTS陽離子自由基體系與FRAP這2方面,奶酪BC17、ZX-99表現(xiàn)的抗氧化能力較差,結合2.4節(jié)中理化分析結果推測,這可能是奶酪BC17、ZX-99的與其他4款奶酪相比成熟度略低、蛋白質(zhì)水解程度較低、功能性抗氧化產(chǎn)物較匱乏導致。在DPPH自由基體系中,奶酪BC07表現(xiàn)出的抗氧化能力顯著較高,而奶酪BC20、ZX-99表現(xiàn)出的抗氧化能力顯著較低。這一結果與奶酪的成熟情況不呈相關性,結合2.2.2節(jié)中菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果,推測這可能是由于不同種的紅曲霉在生長代謝的過程中存在一定差異,導致奶酪中抗氧化物質(zhì)的情況存在差異。

a-ABTS法;b-DPPH法;c-FRAP圖6 紅曲霉奶酪的抗氧化性Fig.6 Antioxidant activity of Monascus cheese

3 結論

本文通過直接分離法對紅曲腐乳及紅曲酒糟中的菌株進行初步篩選,得到15株疑似紅曲霉菌株。將這15株來自酒糟的紅曲霉及實驗室提供的10株來自腐乳的紅曲霉以一種新型短熟工藝進行奶酪制備,篩選出具有風味優(yōu)勢的6株,即BC07、BC17、BC18、BC20、X2-2、ZX-99。通過DNA序列比對及進化樹分析,鑒定該6株菌為紅曲霉屬。通過安全性及功能性物質(zhì)的定量檢測,認為BC20與ZX-99在具備風味優(yōu)勢的同時還具有食用安全性。通過理化指標的檢測及與其他工藝下理化結果的對比,認為在短熟工藝下,BC20與ZX-99具備熟化奶酪的能力,其中BC20的熟化能力更強。通過質(zhì)構分析,認為隨著奶酪的熟化程度提高,口感會變得更加柔嫩。通過抗氧化性分析,發(fā)現(xiàn)奶酪中抗氧化物質(zhì)在不同檢測體系中表現(xiàn)出的抗氧化能力,與奶酪的熟化程度及發(fā)酵菌株的特性皆相關。本課題研究是從感官風味出發(fā),在短熟工藝下對源于食品的紅曲霉進行篩選,得到BC20與ZX-99兩株適宜用于制作奶酪的紅曲霉菌株,為改善紅曲霉奶酪制作工藝、節(jié)約制作成本、進一步研究其特征代謝產(chǎn)物提供參考。